宫颈冷刀锥切术后不同时期应用重组人干扰素α-2b泡腾片对HSIL患者HPV感染转归的影响*

张宇晴， 刘金， 陈丽敏， 赵水苗， 何海鹏， 齐亚舟， 侯佳琛

(1.河北大学 临床医学院， 河北 保定 071000； 2.河北大学附属医院 妇科， 河北 保定 071000)

宫颈癌是全球女性发病率及死亡率排名第4位的恶性肿瘤，严重威胁女性的身心健康[1]。宫颈癌是一种多步骤、连续发展的疾病，宫颈鳞状上皮内病变(cervical squamous intraepithelial lesion，SIL)反映了其发生发展的过程[2]。2014年世界卫生组织女性生殖器官肿瘤分类将宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)三级分类法(CIN1、CIN2、CIN3)更新为二级分类法，即低级别(low-grade SIL，LSIL)和高级别鳞状上皮内病变(high-grade SIL，HSIL)[3]，临床中大部分低级别病变可自然消退，以随访观察为主，无需治疗；而HSIL却有癌变潜能，如不治疗将会有近50%进展为宫颈癌[4]。目前国内外推荐的HSIL临床治疗措施是宫颈锥形切除术，即切除病灶[5]。手术治疗在切除病灶的基础上，对人乳头瘤病毒(human papilloma virus，HPV)感染也具有一定的清除作用，但术后仍存在HPV感染的可能，少数出现高危型HPV(high risk-HPV，HR-HPV)持续感染，宫颈锥切术后HR-HPV持续感染是宫颈病变持续存在或复发的危险因素[6]，故促进术后HPV感染转阴、预防再感染是预防HSIL术后复发的关键。重组人干扰素α-2b泡腾片，具有抗病毒、抗肿瘤和调节免疫功能作用[7]。近年来，干扰素治疗宫颈病变HR-HPV感染方面的研究也较多，疗效获得了肯定[8]，但对于伴HR-HPV感染的HSIL患者术后何时进行药物干预治疗疗效更佳，临床上尚无统一标准。因此本研究对HSIL锥切术后患者进行临床干预，比较术后HR-HPV感染转归，同时监测阴道局部免疫因子水平以了解阴道局部免疫状态，以期寻找术后最佳临床干预时机，降低术后复发率，为临床实践提供理论支持。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2019年6月—2019年12月接受宫颈冷刀锥切术(cold knife conization，CKC)的HSIL患者，要求符合术前阴道镜活检病理结果提示HSIL和HR-HPV检测结果阳性、术后病理为HSIL者、无重大内外科合并症、术后1个月复查宫颈创面愈合良好者，术后完成定期随访；排除伴阴道炎症患者、因病灶残留于术后3个月内行2次锥切或全子宫切除者、术后病理提示为宫颈癌者、有恶性肿瘤病史或免疫系统疾病等免疫功能低下者及不能严格随访者。共纳入HSIL患者178例，分为治疗A组(术后1个月给予重组人干扰素α-2b泡腾片药物干预治疗)40例和观察组138例(常规随访)。138例观察组患者中在术后6个月复查HPV时提示未转阴者66例，根据是否接受药物治疗将66例患者分为治疗B组(术后6个月给予重组人干扰素α-2b泡腾片药物治疗，n=35)和对照组(常规随访，n=31)。本研究遵循《世界医学协会赫尔辛基宣言》要求，患者接受药物治疗前，均详细告知病情和可选择的治疗方式，征得患者知情同意后，签署临床研究知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1一般资料采集 通过医院电子病历系统、门诊系统及电话随访形式收集、记录患者年龄、孕产次、绝经状态、术前液基薄层细胞检测[liquid-based thin-layer cell detection，TCT；包括未见上皮细胞内病变或恶性病变(no intraepithelial cell lesions or malignant lesions，NILM)、意义不明的不典型鳞状细胞(atypical squamous cells of undetermined significance，ASC-US)、不能排除高度鳞状细胞病变的不典型鳞状细胞(atypical squamous cells with high-grade squamous cell disease cannot be ruled out，ASC-H)、LSIL及HSIL]及HPV感染情况、术后病理情况等一般临床资料。所有患者于术后第6、12个月时复查TCT及HR-HPV分型检测、采集阴道灌洗液。

1.2.2TCT采集 采样时，暴露宫颈，采样部位尽量保持干净，擦掉宫颈表面的分泌物，使用TCT采样刷置于宫颈口处，刷取分泌物时手持采样刷朝顺时针旋转5～10圈，将刷头推入专用细胞保存液中，做好标记、轻振荡并尽快送检。

1.2.3HR-HPV分型检测 暴露宫颈，将HPV采样器毛刷置于宫颈管内，手持标本采样毛刷顺时针旋转3～5圈，持该标本采样刷头放入装有 HR-HPV 保存试剂的专用无菌采样管内(江苏健友医疗科技有限公司)，折断刷柄，盖紧采样管口并尽快送检。采用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)技术进行检测，使用HR-HPV核酸(分型)检测试剂盒(湖南圣湘生物科技有限公司)同时检测15种常见型别HR-HPV。多重HR-HPV感染指2种及以上HR-HPV型别感染[9]。

1.2.4阴道灌洗液采集 所有患者均于术前及术后第6、12个月复诊时采集阴道灌洗液。使用无菌注射器抽取0.9%氯化钠注射液5 mL，冲洗宫颈和阴道壁上1/3，从后穹窿回吸阴道灌洗液，3 000 r/min常温离心5 min，取上清液转移到无菌EP小管中，-80 ℃超低温冰箱贮存，使用统一行酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测阴道灌洗液中白细胞介素2(interleukin-2，IL-2)、IL-10浓度，ELISA试剂盒购于易泽生物科技上海有限公司。

1.2.5手术治疗 所有患者均接受CKC。手术均由具备相应手术资质医师完成，切除范围为碘不着色外5 mm。将切除组织以所标记的点数为参照平均分为12份，顺时针方向命名点数。病理标本经过制片、染色过程后由2位病理科副主任医师以上专家阅片并做出诊断，如2位医师结论相反，则请第3位病理科医师进一步判断。切缘阳性是指宫颈锥切标本边缘1 mm内可见高级别病变，包括外切缘、基底切缘、内切缘和(或)宫颈搔刮标本[10]。

1.2.6术后治疗组干预措施 治疗A组患者于术后1个月给予重组人干扰素α-2b泡腾片阴道用药进行干预治疗，治疗B组于术后6个月给予重组人干扰素α-2b泡腾片进行干预治疗。阴道用药使用方法：隔日1次，1片/次(50万IU)，睡前清洁外阴后使用，使用一次性指套将药物(泡腾片)送入阴道深处至穹窿部，经期停用，使用3个月。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 感染现状及一般临床特征

178例患者术前HR-HPV感染情况及亚型分布结果表明，单一类型HPV感染者118例(66.3%)，多重类型HPV感染者60例(33.7%)；单一类型HPV感染患者中最常见的是HPV16型、有65例(占比55.1%)，其次为HPV52感染者13例(11.0%)、HPV18感染者11例(9.3%)、HPV58感染者10例(8.5%)、HPV31感染者9例(7.6%)、HPV33感染者3例(2.5%)、HPV35感染者3例(2.5%)，HPV56、51型感染者最少，各2例；多重类型HPV感染患者中包含HPV16亚型者有44例(73.3%)，其他亚型的多重感染者16例(26.7%)；观察组和治疗A组HSIL患者年龄、孕产次、绝经状态、术前TCT、HR-HPV感染情况、术后病理切缘及是否累腺等一般临床资料比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 观察组和治疗A组HSIL患者的一般临床特征Tab.1 General clinical characteristics of HSIL patients in the observation group and A group

2.2 术后第6个月的HR-HPV感染转阴率

结果显示，治疗A组患者于术后第6个月时HR-HPV感染转阴率高于观察组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 观察组和治疗A组HSIL患者术后第6个月时HR-HPV感染情况[n(%)]Tab.2 HR-HPV infection of HSIL patients in observation group and treatment group A at the 6th month after surgery[n(%)]

2.3 术后第6个月的阴道免疫功能

结果显示，治疗A组患者阴道灌洗液中IL-2水平高于观察组，差异有统计学意义(P<0.05)；治疗A组患者阴道灌洗液中IL-10水平低于观察组、IL-2/IL-10值高于观察组，但差异均无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 观察组和治疗A组HSIL患者术后第6个月的阴道局部免疫因子水平Tab.3 Comparison of vaginal local immune factor levels at the 6th month after

2.4 术后第12个月的HR-HPV感染转阴率

治疗B组HSIL患者术后12个月时HPV转阴者33例、再次感染者2例、持续性感染者5例，观察组术后6个月HPV转阴的72例患者中再次感染者7例；治疗B组HPV未转阴患者于术后第12个月时HR-HPV感染转阴率高于对照组，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 对照组和治疗B组HSIL患者术后第12个月的HR-HPV感染情况[n(%)]Tab.4 Comparison of the outcome of HR-HPV infection between the two groups at the 12th month after surgery[n(%)]

2.5 术后第12个月的阴道免疫功能分析

结果显示，治疗B组患者阴道灌洗液中IL-2水平高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；治疗B组与对照组患者阴道灌洗液中IL-10和IL-2/IL-10水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表5。

表5 对照组和治疗B组HSIL患者术后第12个月的阴道局部免疫因子水平Tab.5 Comparison of vaginal local immune factor levels at the 12th month after surgery

3 讨论

随着对宫颈癌的研究越来越深入，大量研究证实，HR-HPV持续性感染与SIL及宫颈癌的发生发展紧密相关[11]。在全球范围内，HPV16型一直是导致HSIL和宫颈癌的最主要亚型，超过2/3的宫颈癌患者与HPV16(51.0%)或HPV18(16.2%)感染有关[12]。在亚洲5个国家1 086个样本研究中，发现HPV16、52及58是最主要HPV类型[13]。本研究发现HSIL患者术前HR-HPV感染以单一类型为主，最常见的亚型是HPV16，其次为HPV52、HPV18和HPV58型。虽然各研究HPV感染亚型构成比略有不同，但可以看出HPV16型与HSIL关系最为密切。据文献报道，在正常筛查人群、CIN1、CIN2、CIN3及宫颈癌患者中HR-HPV感染检出率分别为4%、30%、55%、65%及99.8%[14]。宫颈锥形切除术是临床上应用较广的诊治HSIL的方法，对于病变局限、较小的患者可达到治疗性目的，对于病变呈多灶性、范围较广泛者可能达到诊断性目的，但可为后续制定诊疗方案提供依据。研究指出HSIL锥切术后HR-HPV持续感染会大大增加疾病进展或复发的风险[15-16]，故提高术后HR-HPV的清除率，对于降低术后病变复发率十分有益。

免疫系统是机体在长期进化中逐步形成的复杂的防御系统，感染的发生与否及其演变、转归是由机体的免疫力与病原微生物的致病力相互消长而定[17]。随着阴道微生态在妇产科临床中研究应用越来越广泛，目前国内很多关研究集中在阴道局部免疫功能上，大量临床研究与数据证实阴道局部免疫的失衡与HR-HPV持续感染、宫颈SIL甚至是宫颈癌的关系十分密切[18]。阴道局部免疫包括细胞免疫和体液免疫两部分，在抗感染、抗肿瘤作用中至关重要的是细胞免疫,其中IL-2等在抗感染方面最为突出[19]。有研究表明，在宫颈癌相关疾病患者体内辅助性T细胞1型细胞(helper T cell type 1 cells，Th1)与Th2平衡被打破，在HPV感染者体内甚至出现Th1向Th2漂移的现象[20]。同时T细胞亚群紊乱，增加了HPV持续感染的风险，削弱了机体清除HPV的能力和肿瘤免疫监视及防御功能。同时研究指出，在HPV持续感染时Th1类因子水平下降，Th2类因子水平上升，即表现出Th1向Th2的漂移(Th1/Th2比值下降)，在感染消退时又表现出Th1/Th2比值升高[21]。国内外很多研究均与上述观点一致，随着宫颈病变的发生发展阴道灌洗液中Th1类因子如IL-2、IFN-γ、IL-12及TNF-β等降低，Th2类因子如IL-4、IL-5、IL-6及IL-10等升高，表现出Th1/Th2比值降低，阴道局部免疫力下降[22-26]。本次研究中，术后患者阴道灌洗液中IL-2水平较术前上升，IL-10水平较术前下降，且IL-2/IL-10值升高，与上述研究结果相似。于术后第6个月时，接受药物干预治疗的治疗A组患者阴道灌洗液中IL-2水平高于观察组(P<0.05)，IL-10水平低于观察组，可认为重组人干扰素α-2b泡腾片能提升阴道局部免疫因子IL-2含量，促进机体局部免疫力恢复。

目前国内关于干扰素治疗HPV感染及联合手术治疗SIL方面研究较多，重组人干扰素α-2b具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用，其作用机制[7]：(1)直接作用于病变部位，结合靶细胞表面的干扰素受体，诱导细胞内产生α-5A合成酶、蛋白激酶等抗病毒蛋白，阻止病毒蛋白质合成，从而对病毒核酸的复制、转录过程起到抑制作用；(2)通过其多重免疫调节的作用，增强淋巴细胞对靶细胞的特异性细胞毒性、巨噬细胞的吞噬作用及天然杀伤细胞功能，抑制肿瘤细胞增殖，增强免疫自稳、免疫监视及防护功能。有研究表明，给予HPV感染者重组干扰素阴道上药治疗，观察到局部分泌物中各种免疫细胞因子浓度水平发生改变，表现为Th2向Th1偏移、阴道局部免疫力增强，从而促进了HPV感染的清除[27]。在重组人干扰素药物联合LEEP治疗宫颈SIL方面的研究较多，均提出干扰素改善局部免疫环境、提高术后HPV转阴率及降低疾病远期复率的观点[28-29]。本研究结果显示，CKC术后接受重组人干扰素α-2b泡腾片进行临床干预患者(治疗A组和B组)HPV清除率较同时期未接受药物干预组提高，且治疗A组(术后1个月时接受药物干预治疗)与对照组患者在术后6个月时HPV转阴率比较，差异有统计学意义(P<0.05)。

综上所述，对HSIL术后患者及早给予药物干预措施有益于提高患者阴道局部免疫功能，促进CKC后HPV感染转阴。将来多中心大样本研究有望使阴道免疫评价得到基础量化，为预测HSIL患者术后转归提供有效手段，从而有利于提高HSIL患者术后的远期预后。