类风湿关节炎血清学标志物的筛选：基于细胞因子蛋白芯片

类风湿关节炎（RA）是一种全身性自身免疫性疾病。RA的发病机制尚不明确，但许多研究表明免疫异常如B 细胞和T细胞失调及异常细胞因子表达可能与其相关。2017年全球疾病负担、伤害和风险因素研究统计指出全球范围内由类风湿关节炎导致伤残调整寿命年（DALYs）以达到43.3年/10万人。故早期诊断和及早治疗对于RA患者尤为重要，可有助于减少RA的致残率及改善远期预后。

4) 根据折臂式铁钻工的设计要求，规定铁钻工的回转速度为nH=1r/min，根据传动比可以计算出n1=5.4r/min,n2=3.1r/min 。

目前临床诊疗中最常用的RA血清学诊断标志物为类风湿因子（RF）和抗环瓜氨酸多肽抗体（抗CCP抗体），多项研究表明在临床确诊的RA患者中相当比例（20%～30%）的患者出现RF或抗CCP抗体阴性，且二者常与RA患者临床表现及病情发展不相关。近年研究提出，细胞因子及可溶性细胞因子受体蛋白在RA的发病机制中参与关节炎症和关节破坏。故研究血清细胞因子和可溶性细胞因子受体蛋白的变化可能有助于了解RA 发展的潜在机制，并有助于监测RA疾病活动及可能对RA诊断有一定价值。

高通量蛋白芯片技术可用于大量筛选疾病可能的蛋白质生物标志物。在过去的十多年中，通过运用蛋白质芯片技术已经设计和制造了相对成熟的平台并应用于检测细胞培养中的特定抗原、抗体、癌症相关蛋白和体液中细胞因子的产生。

本研究中利用人蛋白芯片技术定量测量RA患者及健康人群血清样本中的400种人细胞因子及可溶性细胞因子受体蛋白，并对其中六种在RA患者血清中显著上调者进行分析，为目前在RA患者血清中对于细胞因子检测范围最广泛的研究。同时，此为首次报道2B4（CD244）、ROBO3、IGFBP-4、LIMPⅡ在RA患者中表达情况。本研究结合细胞因子及可溶性细胞因子受体蛋白可能参与关节炎症、破坏的作用，对反应RA患者病情发展的血清学诊断标志物进行研究，并分析其作为RA诊断的潜在生物标志物的临床价值。

1 资料和方法

1.1 研究人群

很轻声的一句话，他当时并没有在意，然而此刻，这句话好似随着刚才的梦境，一同在心中苏醒了。它带着一种魔力，让他心中对飞翔的渴望，尤其强烈。

1.2 细胞因子芯片制备和血清样品收集。

通过直接静脉穿刺将受试者的全血（5 mL）收集到促凝管中。所有血液在采集后2 h内进行血清分离处理：4 ℃，2000 r/min离心10 min后取上清于新的离心管中，-80 ℃储存直至分析。

研究使用人细胞因子芯片Q9000（QAH-CAA-9000，RayBiotech），由10个非重叠阵列组成，可定量测量400种人细胞因子及可溶性细胞因子受体蛋白。从每个混合的样品中，将100 μL 稀释的血清加入每个孔中，与检测抗体混合物一起孵育并洗涤。然后将样品与Cy3等效物标记的链霉亲和素一起孵育并洗涤。使用GenePix 4000B 芯片扫描仪以Cy3 波长和无背景标准化波长对信号进行观察分析。如果倍数变化大于10，则认为RA组与健康对照组细胞因子表达有显着差异。

1.3 细胞因子分析

在每个样品组中，将5例RA患者及5例健康对照组人群血清每个样品分别取等体积血清（各500 μL）混合为2.5 mLRA患者组混合血清样本及2.5 mL健康对照组混合血清样本。后使用此对混合血清样品进行细胞因子芯片检测。通过比较RA患者样本与健康对照样本来进行细胞因子表达谱分析。

1.4 蛋白质-蛋白质交互作用（PPI）分析

使用除细胞因子芯片实验所用样本另外54 名RA患者和41 名健康对照人群（表1）的血清样本通过ELISA 方法验证选取得六种细胞因子的表达。结果与芯片数据一致：与健康对照组相比，RA 患者组中2B4、LIMPⅡ、Tie-2、ROBO3、Periostin和IGFBP-4 表达水平均显著提升（＜0.05，图2）。

本研究共招募了105名参与者：59名RA 患者和46名健康对照者。所有RA患者均于2015～2019年间在南方医科大学南方医院风湿免疫科诊断，符合美国风湿病学会的RA 分类标准；患者病历资料包括实验室检查数据、疾病活动度评分（DAS28）和健康评估问卷（HAQ）；排除合并其他结缔组织病的患者比如：系统性红斑狼疮，强直性脊柱炎等；排除患有严重肝脏或肾脏疾病的患者。健康对照组为在我院健康体检中心接受定期体检的年龄和性别匹配的健康人群。所有研究方案均经南方医科大学南方医院伦理委员会批准（NFEC-2015-102），每位参与者均签署书面知情同意书。

1.5 酶联免疫吸附试验

对于除细胞因子芯片检测的血清样本外的同人群中另外54例类风湿关节炎患者及41例健康人群血清进行独立酶联免疫吸附试验验证。使用定量ELISA试剂盒（DTE200，R&D Systems）分析Tie-2。使用定制ELISA试剂盒（ELH-2B4-1、ELH-ROBO3-1，RayBiotec）分析2B4和ROBO3。使用定量ELISA试剂盒（ELH-LIMPⅡ、ELH-POSTN、ELH-IGFBP-4，RayBiotech）分析LIMPⅡ、Periostin和IGFBP-4。所有ELISA 实验均根据制造商试剂盒中的操作指南进行。为避免批次差异的影响，研究中的所有血清样品与同一批次试剂同时检测。

1.6 统计学分析

使用ROC曲线分析评估已验证的细胞因子及其受体对RA的诊断价值。经ELISA结果验证的细胞因子和可溶性细胞因子受体蛋白的ROC曲线显示（图3），血清2B4、LIMPⅡ、Periostin、ROBO3、IGFBP-4和Tie-2水平可以用于区分RA患者组与健康对照组。发现最大曲线下面积为2B4（AUC：0.861，95%:0.789～0.932），其次为LIMPII（AUC：0.842，95%：0.763～0.920），ROBO3（AUC：0.804，0.95%：0.711～0.898），Periostin（AUC：0.745，95%：0.643～0.847）、Tie-2（AUC：0.709，95%：0.606～0.811）和IGFBP-4（AUC：0.695，95%：0.590～0.801）。

2 结果

2.1 RA患者组与健康对照组的细胞因子和可溶性细胞因子受体蛋白表达

通过人细胞因子芯片技术比较了5例RA患者混合样本与5例健康对照组混合样本（表1）血清中细胞因子和可溶性细胞因子受体蛋白表达水平。该研究研纳入所有人群的基本特征信息见表1。我们原始数据标准化后，与健康对照相比，我们发现共37 种细胞因子或可溶性细胞因子受体蛋白在RA 组中表达上调10倍（表2），包 括TSLP、2B4、TIM-1、EpCAM、LRP-6、LIMPII、TRAIL-R4、TGFa、4-1BB、Tie-2、ROBO3、ST2、MIP-3b、IL-17F、SDF-1b、Periostin、IL-1F5、I-309、Activin A、IL-33、IL-12p40、FABP2、B7-1、TF、Galectin-1、ⅤEGF R1、NRG1-b1、G-CSF、PD-1、ICAM-1、Cathepsin L、MMP-13、IL-1β、Kallikrein 14、Gas1、IGFBP-4、IL-13 R2。根据此37种细胞因子及可溶性细胞因子受体蛋白的PPI 分析结果（图1）选择6 种感兴趣的指标：2B4、LIMPⅡ、Tie-2、ROBO3、periostin 和IGFBP-4进行了下一步的验证实验。

需要层次理论认为，一个社会（或社区）的首先责任是满足其成员的基本生存需要包括生理的、社会的、情绪的和精神等方面的需要。具体来讲就是"驱动即需要"。这是生物决定论的说法，即用生物性的内在区里来谈需要，马斯洛的需要层次论就是如此。他从人类动机的角度，将人的"需要"分为五大类，按照由下至上的等级依次分为生理的需要、安全的需要、归属及爱的需要、受人尊重的需要和自我实现的需要。西方学者认为老年人需求主要集中在物质需求、医疗需求和精神需求。高校教师退休后有一定的经济来源，能够提供生活的基本保障，物质需求在一定程度上得到满足。但其医疗需求和精神需求满足程度则因人而异。

2.2 验证实验

为全面系统了解各细胞因子在类风湿关节炎发生发展中的作用，我们通过STRING数据库提供的PPI数据探索不同蛋白质之间还存在相互调控的间接方式，从而确定研究的主要细胞因子。以PPI 网络为切入点，选取了6个不同方向的、当前研究较少的细胞因子进行后续探讨、实验。

2.3 RA患者临床指标和血清中已验证的细胞因子和可溶性细胞因子受体蛋白的表达相关性分析

当然，光营造氛围还是不够的，利丰雅高同时也在用“智慧”用人留人：1.提供广阔的平台，给予员工充足的信任。相信每个人都是发自内心地努力做好自己的本职工作，放手让员工完成自己的工作，建立管理者和员工之间的双向信任；2.建立健全培训制度和培养机制。员工培训有利于激发员工积极性、提高员工满意度，增强凝聚力。外部营造氛围，内部完善体系，由内而外落到实处。

2.4 血清细胞因子及可溶性细胞因子受体蛋白的ROC曲线分析

所有统计分析均通过SPSS（v.20.0）软件（SPSS Inc.,Chicago,Ill）进行。采用GraphPad Prism 9.0.0 软件进行统计作图。由于样本量较小，使用Shapiro-Wilk检验数据正态性。根据需要使用Mann-Whitney检验或两独立样本率的卡方检验比较各组以评估统计显着性。使用Spearman秩相关性检验分析参数之间的相关性。对于每种细胞因子或可溶性细胞因子受体蛋白，使用受试者工作特征曲线（ROC）分析来检验其曲线下面积（AUC）及其95%置信区间（）分析各细胞因子的诊断潜能。计量资料中符合正态分布资料以均数（标准差）进行统计描述，偏态分布资料以中位数（四分位间距）描述。＜0.05为差异具有统计学意义。所有实验均独立重复3次。

为探索已验证的细胞因子和可溶性细胞因子受体蛋白血清水平是否与RA疾病活动程度的相关，同时由于样本中RA相关临床指标（包括：类风湿因子（RF）、红细胞沉降率（ESR）、C反应蛋白（CRP）、疾病活动评分（DAS28）及健康评估问卷（HAQ））经Shapiro-Wilk检验不符合正态分布，我们进行了Spearman秩相关性检验以评估其与血清2B4、LIMPⅡ、Tie-2、ROBO3、Periostin和IGFBP-4 水平之间的相关性。如表3 所示，血清LIMPII、ROBO3和Periostin的表达水平与RA临床指标呈正相关，2B4、LIMPⅡ、ROBO3和periostin血清表达水平互相呈相关趋势。

3 讨论

本研究中，我们通过细胞因子芯片综合分析了RA患者血清中的细胞因子和可溶性细胞因子受体蛋白水平，与健康对照相比，发现37种在RA患者组血清中表达上调的细胞因子或可溶性细胞因子受体蛋白，表明细胞因子在RA 的发病过程中可能起到重要作用，结果证明了前人关于血清细胞因子对于RA疾病过程可能起到重要作用的假说。与健康对照组相比，RA患者血清中与RA相关的细胞因子，如TSLP、TNF-α、IL-33和MMP-13等均表达上调。此外，我们根据此37种表达上调的细胞因子及可溶性细胞因子受体蛋白的PPI网络随机选择了6个不同方向的目前研究较少的感兴趣的靶标，包括2B4、LIMPⅡ、Tie-2、ROBO3、periostin和IGFBP-4通过了ELISA方法进行了下一步的验证实验。发现与健康对照相比，2B4、LIMPII、Tie-2、ROBO3、Periostin和IGFBP-4在RA血清中的表达显著升高，提示这些细胞因子可能在参与RA 的发病机制。通过Spearman相关性分析发现显示血清LIMPⅡ、ROBO3和Periostin水平与RF、ESR、CRP、HAQ 和DAS28 呈正相关，表明这些细胞因子可能是RA疾病活动的相关血清生物标志物。同时，2B4、LIMP Ⅱ、ROBO3 和periostin血清表达水平互相呈相关趋势（＜0.01），我们推测这些细胞因子可能直接或间接地相互作用，但需要进一步研究证实。根据ROC 分析发现，血清2B4、LIMPⅡ、ROBO3、Periostin、Tie-2和IGFBP-4水平对RA可能具有潜在的诊断价值。尤其是2B4，在6个此研究中分析的细胞因子中具有最大的ROC曲线下面积，表明其作为RA诊断的血清标志物可能性更大。

细胞因子是先天性和适应性免疫系统的关键组成部分，由小蛋白质、糖蛋白或肽分子构成，它们通过与其细胞表面受体结合来实现复杂的细胞通讯。本文研究的6种细胞因子及可溶性细胞因子受体蛋白中，4种（LIMPII、IGFBP-4、ROBO3和2B4）为首次在RA患者的血清学水平进行研究：（1）2B4（CD244）是免疫细胞受体信号淋巴细胞活化分子（SLAM）家族的成员，在调节NK细胞和CD8T细胞免疫中发挥重要作用；（2）ROBO3 是环岛（ROBO）受体家族的成员，目前在所有领域中相关研究均较少。Denk等在细胞水平的的研究中发现ROBO3基因多态性增加了人群对RA的易感性，与健康人群的滑膜成纤维细胞相比，RA滑膜成纤维细胞中ROBO3的表达显著增加；（3）IGFBP-4是一种胰岛素样生长因子结合蛋白。一项在RA患者关节滑膜液中的研究表明，与健康对照组相比，RA患者关节滑液中IGFBP-4 的表达增加；（4）LIMPⅡ（SCARB2，清道夫受体B类）是由SCARB2基因编码的溶酶体膜糖蛋白，LIMPII与RA的关系尚未见报道，需要进一步的研究来证实这些因素在RA 发病中的作用机制。同时，已有两种细胞因子（Tie-2、Periostin）被已发表的RA患者血清标志物研究分析讨论过：（1）研究表明，Tie-2是一种酪氨酸激酶受体，主要通过与血管生成素-1（Ang-1）和Ang-2相互作用参与血管生成和血管重塑。研究表明Tie-2可能参与RA滑膜炎的发病过程。但在一项对于40个RA患者和20个健康对照组队的研究表明tie-2 在类风湿关节炎中血清水平无改变，且与DAS28不相关，与我们的结论一致。这些差异可能是由于纳入人群范围不同所致，结论仍需更大样本的临床研究进行验证；（2）Periostin是一种分泌型细胞外基质蛋白，在富含胶原蛋白的纤维结缔组织中表达，参与细胞募集和粘附。Periostin是一种有效的调节因子，可促进IL-1β诱导的RA滑膜成纤维细胞的迁移和侵袭。Katharina等通过研究缓解期的RA患者证明高血清Periostin水平可能与RA患者脆性骨折风险升高相关，且与患者DAS28成正相关，支持我们的结论。

比如在《和纸玩游戏》的主题中我在晨间自主锻炼时就着重提供纸制品的材料：把报纸团成纸球、卷成纸棒，用纸板画成荷叶，把大纸箱装饰变成山洞或坦克车履带等，引导孩子们玩“奥特曼打怪兽”、“小青蛙跳荷叶”、“过河拆桥”、“赶小猪”，通过系列的玩纸游戏活动不仅使孩子们进一步认识了各种纸质材料的性能，也发展了孩子们的跳跃、钻爬、投掷、平衡等动作技能，提高了幼儿的身体素质。

本研究存在一些局限性。首先，样本量相对较小且为实验为横断面观察性设计，结论须在未来更大规模、多人种的前瞻性研究中进行证实。其次，要确定2B4等细胞因子及其可溶性细胞因子受体蛋白是否可以作为RA的血清学诊断标志物，还需进一步研究评估其有效区分RA 与其他风湿性疾病的能力，例如系统性红斑狼疮、骨关节炎和强直性脊柱炎等，这些疾病也以关节损伤及炎症反应为特征。同时，本研究出于节约实验经费的角度使用血清混合样本进行细胞因子芯片的初步筛选实验，虽后续进行了ELISA实验进行验证，但不可忽视的是：（1）血清混合后每份样本均相稀释了5倍，这可能导致血清中含量差异较小或无差异的细胞因子出现假阳性结果，故本研究中只对含量差异倍数超过10倍的细胞因子进行了研究；（2）混合后不同血清间可能出现部分交叉反应从而影响实验结果。另外，本研究中只挑选细胞因子芯片中6个感兴趣的差异表达因子进行分析，在我们之后的研究中将进一步对于其他筛选结果中差异表达细胞因子的诊断潜能进行验证讨论。

本文研究探索了血清细胞因子水平辅助类风湿关节炎诊断及病情活动评估的可能性，探讨蛋白芯片对于RA诊断的临床应用潜能，为RA临床诊疗提供新的诊疗思路。未来应进一步在前瞻性队列研究中更加深入地探讨研究相关细胞因子和可溶性细胞因子受体蛋白对类风湿关节炎临床表现的影响及其分子机制和生物学功能。