IL-17AA与自发性高血压大鼠肾上皮间质转化密切相关

原发性高血压（EH）是一种以血压升高为主要临床表现而病因尚不明确的疾病。调查发现全球有超过11.3亿高血压患者，预计到2025年底，全球将有15.6亿人患有高血压。2020年我国发布的《中国居民营养与慢性病状况报告（2020年）》数据显示，成年人高血压患病率为27.5%，总人数高达3亿。因此，高血压仍然是全球主要的公共卫生问题。

肾脏作为调节血压的重要器官，是EH靶器官损害的主要器官。EH引起的肾损伤主要包括肾纤维化、肾小管肥厚和肾小球的改变。研究表明，上皮间充质转化（EMT）在高血压诱导的肾纤维化发展中发挥着重要作用。EMT在胚胎组织和器官分化过程中首次被发现，是伤口愈合、癌症和纤维化的关键过程，但在高血压肾病中EMT的作用机制仍不清楚。近年来，越来越多的证据表明免疫系统参与高血压的病理生理过程以及终末器官的损伤，细胞因子对高血压炎症反应的影响也一直是研究的热点。IL-17A作为一种促炎因子，主要由Th17细胞极化产生。研究发现，在高血压患者血浆中IL-17A的水平升高，并且在高血压动物模型诱导的肾损伤中IL-17A的表达亦显著升高。但对IL-17A是否参与高血压肾EMT及相关机制暂未发现相关报道。因此，本研究采用国际公认的最接近人类EH的动物模型自发性高血压大鼠（SHR），初步探究IL-17A在SHR大鼠肾EMT中的作用，为免疫干预治疗高血压肾损伤提供初步的实验依据。

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3.1在总调查人数中调查数据表明:有献血经历的人数仅占总调查人数的4.7%;其中从年龄段显示,≥18岁~30岁的2.2%、31~40岁占1.8%、41~50岁占0.7%、50以上的为0。从文化程度显示,小学及以下文化程度的占1.9%、初中及以上的占2.8%;对无偿献血知识知晓率为25.3%;知道定期献血可以促进新陈代谢、降低血脂、对健康有利的等好处的占8.5%;认为献血对身体无影响为14.1%;了解血液知识的为8.8%;对无偿献血相关政策有初步了解的为7.7%。

1 材料和方法

1.1 主要材料与试剂

PE标记的抗大鼠IL-17A单克隆抗体、FITC标记的抗大鼠CD4单克隆抗体及相应同型对照抗体、抗大鼠IL-17A单克隆抗体（eBioscience）、E-cadherin多克隆抗体（BOSTER）、α-SMA单克隆抗体（CST）、iNOS多克隆抗体（BOSTER）、Arg-1单克隆抗体（ABclonal）；抗兔/鼠通用型免疫组化试剂盒（上海基因科技）；逆转录试剂盒（Thermo Scientific）；Trizol试剂（上海生工）；大鼠IL-17AELISA试剂盒（eBioscience）。

1.2 方法

1.2.1 实验动物 4 周龄SPF 级雄性WKY 大鼠（对照组）、SHR大鼠（实验组）各20只，购自北京维通利华公司，动物许可证号为SCXK（京）2016-0006；按简单随机法将两种大鼠各分为4组，每组5只，分别在4、6、10、30周龄（相当于EH的0期、初始期、形成期、靶器官损害期）进行实验观察。实验动物的使用和管理均经安徽理工大学生物医学研究伦理委员会批准（编号：2021019）。

前一观点把电机视为电路元件，对于定、转子上各有一套绕组的隐极电机，两绕组轴线之间的交角θm是随时间变化的。对磁链通过电流和电感表示，定、转子绕组之间的互感为Lsrcosθme，(θme=pθm是电角度)，由磁共能对θm求偏导数，可得电磁转矩

1.2.3 大鼠脾淋巴细胞IL-17A表达检测 无菌环境下取各期大鼠脾脏，将脾脏置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中。用眼科剪将脾脏包膜剪破后用研磨棒在300目不锈钢滤网上将脾脏研磨成细胞匀浆，然后通过静置、离心、破红、洗涤、再次离心、重悬等步骤制备脾淋巴细胞悬液。每个流式管内加入大鼠脾淋巴细胞1×10（经PMA预先刺激4 h），流式管中加入FITC标记的抗大鼠CD4单克隆抗体（0.5 μL/管）及PE标记的抗大鼠IL-17A单克隆抗体（1.0 μL/管），并设置同型对照。加入固定/破膜工作液1 mL，旋涡震荡，重悬细胞，4 ℃避光孵育30 min。1200 r/min×5 min，洗2次，重悬细胞，经流式细胞仪测定细胞各种荧光强度，用CellQuest软件进行分析。

1.2.4 大鼠肾脏IL-17A、iNOS、Arg-1、E-cadherin、α-SMA mRNA的表达 取各期大鼠左肾组织，每次取约50 mg 用Trizol法提取肾脏总RNA，其余放-80 ℃冰箱备用。按照逆转录试剂盒说明书将提取的总RNA于20µL反应体系中进行逆转录合成第一链cDNA。PCR体系为Taq PCR Master Mix 12.5µL、上游引物1µL、下游引物1 µL、cDNA 模板2 µL、加水至25 µL，以GAPDH mRNA作为内参。引物设计与合成：在基因数据库中检索目的基因序列，采用Primer 6.0软件设计引物（表1）。PCR 扩增反应条件为95 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，54.2 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循环34次，72 ℃终末延伸10 min。PCR 产物应用Gel-Pro Analyzer分析系统测量相对表达量。

1.2.2 血压测量 使用BP-6A型全自动无创血压测量仪于清晨8点在大鼠安静状态时测量尾动脉收缩压，每只大鼠测量3次，每次间隔5 min，取3次平均值作为该大鼠的收缩压值。

ELISA结果显示，SHR组IL-17A血浆表达水平在6、10、30周龄时显著高于WKY组，两者差异均具有统计学意义（＜0.05或＜0.01，图5）。

流式细胞术分析结果显示SHR大鼠脾淋巴细胞中Th17细胞的频数逐渐增加，在6、10、30周龄均显著高于WKY组，两者差异具有统计学意义（＜0.05或＜0.01，图2）。

1.2.7 统计学分析 采用SPSS13.0软件进行统计学分析，实验结果数据以均数±标准差表示，组间比较采用两独立样本检验，若方差不齐采用检验；两变量间的相关性采用Pearson相关性分析。若＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠血压的变化

③Antonio Capobianco and Hans Christiansen，Competitive Neutrality and State－Owned Enterprises:Challenges and Policy Option，p．11，OECD Publishing，2011．

IL-17A在10、30周龄时SHR组显著高于WKY组（＜0.05或＜0.01）；iNOS在6、10周龄时SHR组显著高于WKY组（＜0.05或＜0.01）；而Arg-1在30周龄时SHR组显著高于WKY组（＜0.01）。E-cadherin在4、6、10周龄时WKY组与SHR组均升高，差异无统计学意义，而在30周龄时SHR组显著低于WKY组，且差异具有统计学意义（＜0.01）；α-SMA在10、30周龄时SHR组显著高于WKY组（＜0.05或＜0.01，图4）。

2.2 大鼠脾淋巴细胞中Th17细胞的频数变化

1.2.6 大鼠血浆中IL-17A的水平 收集各期大鼠血浆，按ELISA试剂盒说明书测定收集好的血浆中IL-17A的水平。按照每块酶标板上的标准品的A450值绘制标准曲线，计算血浆中IL-17A的含量。

2.3 大鼠肾脏中IL-17A、iNOS、Arg-1、E-cadherin、α-SMAmRNA的表达

IL-17A在6、10、30周龄时SHR组显著高于WKY组，差异具有统计学意义（＜0.05或＜0.01）。M1型巨噬细胞标志物iNOS 在6、10 周龄时SHR 组显著高于WKY组（＜0.05或＜0.01）；而M2型巨噬细胞标志物Arg-1在30周龄时SHR组显著高于WKY组（＜0.01）。上皮标志物E-cadherin在4、6、10周龄时WKY组、SHR组的表达均上调，差异无统计学意义；而在30周龄时SHR组的表达水平显著低于同期WKY组（＜0.01）；间充质标志物α-SMA 在10、30 周龄时SHR 组显著高于WKY组（＜0.05或＜0.01，图3）。

2.4 大鼠肾脏中IL-17A、iNOS、Arg-1、E-cadherin、α-SMA蛋白的表达

段主任几乎将听诊器往我前胸一搭，便一口断定说，是我的气管堵了。接过C T片一看，便更加确定了。迟疑地问：在当地医院看过病吗？我说：看过。段主任问：拍过C T吗？我说：拍过。老婆见问，连忙把在家拍的C T片递过去。段主任看过，指着片上一小片阴影儿说：看见没，你气管里这东西长了。

血压测量结果显示，在大鼠6、10、30周龄时，SHR组的收缩压显著高于对照组（＜0.05或＜0.01，图1）。

2.5 血浆中IL-17A的水平

1.2.5 大鼠肾脏IL-17A、iNOS、Arg-1、E-cadherin、α-SMA蛋白的表达 取各期大鼠右肾组织用10%甲醛液固定，常规脱水、石蜡包埋3µm厚连续切片，应用二步法免疫组织化学法对上述切片进行染色。阳性判定标准为境界清晰，突出于背景的棕黄色或棕褐色颗粒。每张切片随机选取5个不同的视野，采用Image Pro Plus6.0图像分析系统进行半定量分析。

2.6 IL-17A与大鼠肾脏中E-cadherin、α-SMA的相关性分析

随着病程时间的延长，从10周龄至30周龄SHR组大鼠肾脏中IL-17A mRNA 及蛋白表达水平与Ecadherin mRNA及蛋白表达水平呈显著负相关（相关系数=-0.731，＜0.05；=-0.827，＜0.01）；与α-SMA mRNA 及蛋白表达水平呈显著正相关（相关系数=0.658，＜0.05；=0.968，＜0.01，图6）。WKY组IL-17A表达水平与大鼠肾脏中E-cadherin、α-SMA的表达水平则皆无相关性。

Kinect最早是应用于Xbox360和XboxOne主机的游戏设备。它让玩家不需要手持或踩踏控制器，而是使用语音指令或手势来操作Xbox360和XboxOne的系统界面。它也能捕捉玩家全身上下的动作，用身体来进行游戏，带给玩家“免控制器的游戏与娱乐体验”。

3 讨论

最新研究发现，高血压与免疫炎症和慢性肾病之间的关系密切。持续性高血压将导致肾纤维化及终末器官损害，是继糖尿病肾病之后导致终末期肾病的第二大病因。IL-17A主要是由Th17细胞产生的一种多效性细胞因子，其主要功能是通过释放促炎和中性粒细胞动员的细胞因子介导组织炎症反应。相关研究发现IL-17A在高血压肾病中扮演着重要角色。Orejudo等在血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）建立的高血压模型小鼠中发现，应用IL-17A单克隆抗体阻断的AngⅡ模型小鼠肾脏炎症反应明显降低，结果表明IL-17A可能参与小鼠血压升高以及高血压引起的肾脏炎症反应。Amador等实验数据也表明Th17细胞及其效应细胞因子IL-17A在高血压发病机制中的作用。本实验结果显示，SHR大鼠脾淋巴细胞中Th17细胞的频数明显高于WKY组，SHR大鼠外周血与肾脏中IL-17A的浓度和蛋白的表达水平显著高于对照组，且其血压亦显著高于对照组。结果提示IL-17A可能在SHR大鼠血压升高和肾脏损伤的过程中发挥重要作用。此外，在小鼠肾脏缺血再灌注的模型中注射抗IL-17A单克隆抗体后，小鼠肾脏的损伤减轻，肾脏组织和血浆中的促炎介质浓度也随之降低。

在肾脏疾病中，巨噬细胞是慢性炎症反应的重要介质，其浸润程度与肾脏损伤的严重程度密切相关。根据组织微环境的不同，人原代单核细胞来源的巨噬细胞（M0）可被极化为M1和M2两种不同的表型。其中M1巨噬细胞产生大量的促炎介质，介导抗肿瘤免疫等；M2巨噬细胞具有抗炎功能，持续表达易导致组织纤维化。常见的M1型巨噬细胞标志物有iNOS、CD86等；M2型巨噬细胞标志物有Arg-1、CD163、CD206等。Liu等研究表明巨噬细胞分泌的补体C3导致IL-17A介导的炎症细胞浸润到肾脏，从而导致肾损伤。此外，在对动物模型和高血压患者的研究中发现，巨噬细胞极化在高血压肾损伤中扮演着重要角色。本实验研究发现，iNOS mRNA及蛋白的表达在SHR大鼠肾脏组织6、10周龄时显著升高，而在30周龄时显著降低；同时Arg-1mRNA及蛋白在30周龄时显著表达。这些结果证实了巨噬细胞参与SHR大鼠肾损伤，这与前述结果一致。然而，本实验还发现在巨噬细胞浸润的过程中，SHR大鼠在6、10、30周龄时IL-17A血浆中的浓度和肾脏中mRNA的表达亦显著高于WKY组；这些数据表明在SHR 大鼠肾脏组织中M1/M2 巨噬细胞浸润与IL-17A的表达呈一致性变化趋势。提示在SHR大鼠肾脏中IL-17A上调的同时伴随着M1/M2巨噬细胞极化偏移。另有研究表明，在肺癌、子宫内膜异位症等疾病中IL-17A通过其受体IL-17AR诱导M2巨噬细胞极化，此结果亦验证了IL-17A在巨噬细胞极化的过程中发挥着重要作用。

最新研究表明，EMT与高血压肾纤维化的发生密切相关。根据其发生的生物学背景，EMT可分为三种亚型，I型与器官发育相关；Ⅱ型继发于炎症，与组织再生和器官纤维化相关；Ⅲ型促进恶性肿瘤细胞的转移。在EMT发生的过程中，最关键的一步是下调Ecadherin的表达，随后细胞分裂浸入基底膜向间质移动；而后获得间质表型标志物，如α-SMA。本实验结果发现，在SHR 大鼠30 周龄时肾组织E-cadherin mRNA和蛋白的表达显著低于对照组；α-SMA mRNA和蛋白的表达在10、30周龄时显著高于对照组。相关研究发现，在注射AngⅡ的高血压大鼠中未检测到明显蛋白尿以及肾纤维化之前，肾小管周围就能检测到EMT的发生；此外，在饮食盐摄入诱导的高血压大鼠模型中，肾小管上皮细胞周围亦检测到E-cadherin表达降低，α-SMA表达增强。在这些高血压动物模型中肾脏都发生了EMT，但其发生的机制需要进一步阐明。最新研究发现，人近端小管上皮细胞（HK-2）与M2巨噬细胞共培养48 h后，HK-2细胞α-SMA的表达明显上升，E-cadherin的表达明显下降。此外，Yu等研究发现M1/M2巨噬细胞极化可以调节顺铂处理的肾小管上皮细胞EMT的发生。我们的研究结果表明，在SHR大鼠6、10、30周龄M1/M2巨噬细胞极化的过程中SHR大鼠肾脏亦发生了EMT，与前述结果一致。本研究结果还发现，SHR大鼠从10周龄至30周龄时肾脏中IL-17A mRNA和蛋白的表达与E-cadherin mRNA和蛋白的表达呈显著负相关，与α-SMA mRNA和蛋白的表达呈显著正相关。提示IL-17A在SHR大鼠肾脏EMT的过程中发挥着重要作用。

因此，IL-17A参与高血压肾EMT的发生，其机制可能与其介导巨噬细胞极化有关。