褐藻素通过调控Nrf2/Keap1通路缓解糖尿病大鼠心肌肥大

糖尿病心肌病（DCM）是糖尿病主要并发症之一，最终可发展成心衰，导致糖尿病病人的死亡。据临床研究调查，糖尿病患者相比于非糖尿病患者其心力衰竭发生率高至2～4倍。DCM早期主要表现为糖尿病背景下心室壁肥厚和舒张功能受损，晚期进一步发展为心脏纤维化和收缩功能障碍。心脏肥大分为生理性肥大和病理性肥大，以心脏肥大，细胞凋亡和纤维化为特征的病理性肥大最终会导致心力衰竭。心脏肥厚主要表现在胎儿基因心房利尿钠肽（ANP）、脑利尿钠肽（BNP）、β-肌球蛋白重链（β-MHC）的表达增加，及细胞面积增加。心肌纤维化表现为胶原蛋白堆积、纤连蛋白（FN）和转化生长因子β1（TGF-β1）增多。

自然环境条件是农村居民点分布形成的基础，其中地形条件为农村居民点的建设提供空间，同时又可能限制其发展；耕地是农村居民的主要劳作对象及其经济来源依附体；河流的分布不仅影响到农业生产，同时也是农村居民主要的水源供给地。社会经济因素决定着区域发展潜力从而影响着农村居民点的布局，其中城镇与工矿用地为区域工业聚集地，可在一定范围内提供就业并带动经济增长；良好的交通是进行经济交流的基础。因此采用河流、耕地、高程、坡度4个因子作为影响农村居民点的自然因素，城镇与工矿、交通作为社会经济因素加以研究，根据陇川县区域实情和因子本身特性确定分级范围，测算各影响因素不同范围内的农村居民点景观指数，测算结果如表1。

褐藻素（FX）是一种源自棕色大型藻类的天然海洋类胡萝卜素。由于其特殊的官能团，包括不寻常的丙二烯键和5，6-单环氧结构，使它具有抗氧化、抗肥胖、抗糖尿病和抗癌等活性。FX逆转创伤性脑损伤模型中丙二醛的上调和谷胱甘肽过氧化物酶的活性起到神经保护作用，这归因于FX具有强抗氧化活性。在糖尿病研究方面，FX 减少氧化应激改善糖尿病大鼠肾纤维化，FX改善2型糖尿病小鼠的胰岛素抵抗、葡萄糖和脂质代谢。FX还降低糖尿病和肥胖KK-Ay小鼠的白色脂肪组织和血糖的增加，并减少肿瘤坏死因子和单核细胞趋化蛋白-1 的mRNA表达以调节白色脂肪组织诱导的胰岛素抵抗。然而，FX对糖尿病心肌病是否具有保护效应及其保护机制目前还尚未见报道。

与高血糖相关的氧化应激被认为在糖尿病心肌病中起着核心作用，可诱导心脏重塑、心肌细胞钙处理受损、心肌收缩力和舒张力降低。核因子E2相关因子2（Nrf2）是抗氧化应激转录因子，通过上调抗氧化反应来调节细胞氧化还原平衡。在氧化应激胁迫下，Nrf2在细胞质中与Keap1分离，并异位到细胞核中。超氧化物歧化酶（SOD）、血红素氧合酶1（HO-1）和谷胱甘肽S-转移酶等被认为是Nrf2的下游靶蛋白，起到抗氧化作用。

基于以上背景，本研究通过链脲佐菌素（STZ）诱导糖尿病大鼠模型和高糖诱导H9C2 心肌细胞体外模型，探讨FX是否具有抗糖尿病心肌纤维化和心肌细胞肥大作用，并初步探索其作用机制。本研究旨在为将FX 开发成为抗DCM的临床药物提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

雄性Sprague-Dawley大鼠（=32，200±10 g）由广东省医学实验动物中心提供，许可证44007200065141。所有实验程序均经美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南许可，并经海南大学伦理委员会批准（HNUAUCC-2021-00089）。

1.2 实验细胞

与NG 组相比，高糖刺激下H9C2 心肌细胞表面积增加，给予FX 处理后，细胞表面积减少（＜0.05，图2A、B）。随后通过qRT-PCR进一步检测细胞肥大因子ANP、BNP和β-MHC的mRNA表达水平。与NG组相比，高糖刺激下H9C2细胞内肥大因子ANP、BNP和β-MHC的mRNA表达上调，给予FX处理后，细胞肥大因子ANP、BNP和β-MHC的mRNA表达下调（＜0.05，图2C～E）。

1.3 药物与试剂

FX（成都普瑞法生物科技有限公司）；DMEM低糖培养液、DMEM 高糖培养液（Thermo）；胎牛血清（Newzerum）；活性氧检测试剂盒、预染蛋白Marker、Western及IP细胞裂解液、蛋白酶抑制剂PMSF、HRP标记山羊抗兔lg G、HRP标记山羊抗小鼠lg G、BCA试剂盒、ECL化学发光试剂、细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒（上海碧云天生物科技有限公司）；FITC标记鬼笔环肽（上海翌圣生物科技有限公司）；FN、TGF-β1、Keap1、Nrf2蛋白抗体（武汉三鹰生物技术有限公司）；α-Tubulin、β-Actin、SOD1蛋白抗体（武汉博士德生物科技有限公司）；HO-1蛋白抗体（武汉赛维尔生物科技有限公司）；培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司）；ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）。

1.4 实验仪器

1.5.7 细胞骨架染色 将细胞种于爬片上，给药处理后用PBS 洗3 次，用4%多聚甲醛固定细胞，加入0.1%Triton X-100 透化。然后将细胞在含有1% BSA 的200 nmol/L 鬼笔环肽工作溶液中孵育30 min。用PBS洗涤3 次，10 min/次，随后用Hochest33342 染色孵育20 min以显示细胞核，用PBS洗涤3次，10 min/次。于载玻片上滴一滴抗荧光淬灭剂，将含细胞的爬片缓慢盖上，随后用滤纸吸去多余的淬灭剂，边缘涂抹指甲油以封片。封片于荧光显微镜得到细胞图像，用Image-J软件进行分析得到细胞表面积大小。

1.5 方法

1.5.3 大鼠心肌细胞H9C2的培养 本实验使用H9C2细胞代数均在25 代以内。于含10%胎牛血清的DMEM 低糖培养液中进行细胞培养（37 ℃，5%CO），待细胞长至汇合后传代。在给药处理前，先使用无血清培养液进行同步化处理。24 h后将细胞处理分为以下3组：含5.5 mmol/L葡萄糖的DMEM作为正常组（NG），含45 mmol/L 葡萄糖的DMEM 作为模型组（HG），含45 mmol/L葡萄糖的DMEM+1 μmol/L的FX作为给药组（HG+FX）。

1.5.2 HE染色 用4%多聚甲醛将新鲜的心肌组织固定，进行脱水、包埋和切片处理，得到石蜡切片。石蜡切片烘片，二甲苯脱蜡，梯度酒精水化；双蒸水冲洗；苏木精溶液中染色；1%盐酸乙醇分化数秒；蒸馏水中冲洗；0.5%伊红染液染色1～3 min；蒸馏水冲洗，梯度酒精脱水，二甲苯透明；中性树胶封片，于显微镜下观察拍照，用Image-J软件分析心肌细胞横截面面积。

1.5.1 动物分组及造模 所有动物都在标准条件下喂养，自由获取食物和水。将大鼠分为正常组（=8）和糖尿病模型组（=24），造模通过腹腔注射新鲜STZ（60 mg/kg）诱导，注射后72 h剪尾取血测空腹血糖，空腹血糖值大于16.7 mmol/L 的大鼠为成功建立糖尿病大鼠模型。糖尿病大鼠随机分为糖尿病对照组、FX 干预糖尿病组[200 mg/（kg.d）]和二甲双胍干预糖尿病组[230 mg/（kg.d）]，8只/组，每日灌胃给药，处理12周后处死大鼠。

1.5.5 Western blot实验 将细胞种于60 mm培养皿中，待细胞长至汇合状时进行无血清处理，随后加药48 h终止培养。使用预冷的PBS洗涤细胞3次后，用滤纸和小量程移液枪将皿内残余液体吸干，再加入80 μL 含PMSF 的细胞裂解液，用细胞刮充分刮下培养皿中的细胞，收集皿内裂解液于1.5 mL 的EP 管，冰浴静置30 min，于4 ℃，12 000×离心30 min，取上清为胞浆蛋白。动物组织剪切一小块，置于含PMSF 的裂解液裂解，用剪刀剪碎，玻璃棒研磨后，使用超声破碎仪破碎后，冰浴静置30 min，于4 ℃，12 000×离心30 min。取上清液于1.5 mL的EP管中，得到动物组织内蛋白。通过BCA法测定各组蛋白含量，分装得到上样蛋白量。然后经5%浓缩胶，12%分离胶进行电泳来分离蛋白，每孔上样40 μg总蛋白。经Bio-Rad电转仪在冰上以300 mA，2 h条件将蛋白由凝胶转至NC 膜上。TBST洗膜3次，10 min/次，5%脱脂牛奶封闭1 h，一抗于4 ℃慢摇孵育过夜，次日以TBST洗膜3次，10 min/次，HRP二抗于室温慢摇孵育1 h，以TBST 洗膜3次，10 min/次。随后加入ECL化学发光试剂，于Amersham Image Quant 800 蛋白印迹成像系统显影，图片用Image-J软件进行灰度分析。

2)从外部形态上判断。顶花芽芽基部比较细，芽体不论大小，一般都较饱满充实，多数品种芽体有3个棱起，其上部向一边歪斜。腋花芽芽体肥厚，多数芽尖歪斜，鳞片光亮。顶叶芽芽体直立，基部较粗，形态不饱满，芽体棱起不明显，鳞片上毛茸多，色暗，黑褐色边缘较宽，大鳞片不够突出。侧叶芽芽体短小而扁，芽尖小，不歪斜，芽紧贴附枝条着生，鳞皮色暗。

1.5.4 细胞核蛋白提取 细胞给药48 h后，预冷的PBS洗涤3次后，加入含有PMSF的胞浆抽提试剂A，用细胞刮充分刮取培养皿内细胞，收集提取试剂A于1.5 mL离心管中，剧烈震荡5 s，冰浴15 min。随后加入胞浆抽提试剂B，剧烈震荡5 s，冰浴1 min，再次震荡5 s，于4 ℃12 000×离心5 min，得到胞浆蛋白。余下沉淀加入含有PMSF 的细胞核蛋白抽提试剂，剧烈震荡30 s，冰浴2 min，重复该过程，直到沉淀充分悬浮并散开。随后于4 ℃12 000×离心10 min，上清即为核蛋白。

1.5.6 活性氧检测 细胞种于六孔板中培养至汇合状，无血清同步化后进行处理，给药48 h后进行检测。无血清培养液稀释活性氧探针DCHF-DA至20µmol/L，并将其加入六孔板中，在37 ℃下与细胞一起孵育1 h。孵育完成后用无血清培养液冲洗3遍，每次冲洗3～5 min，以充分除去未结合的探针。于荧光倒置显微镜中观察并拍照。

1.2.3 采取民间借贷。通过调研数据发现，借款建房的农户约占总数的73.61%。除了向亲戚朋友借钱，他们还会选择向装修工队赊账或者借10万以下的小额高利贷。可以说，借款建房是一个普遍现象。

垂直电泳仪及转膜系统（Bio-Rad），荧光倒置显微镜（Olympus），荧光实时定量PCR 仪（Thermo），Amersham ImageQuant 800 蛋白印成像系统（Cytiva），微量紫外分光光度计（Thermo）。

1.5.8 荧光实时定量PCR 法 根据Primer 5 软件和NCBI设计引物，引物序列如下：ANP序列：上游5'-GG GAAGTCAACCCGTCTCA-3'，下游5'-GCTCCAATC CTGTCAATCCT-3'；BNP序列：上游5'-CCCCAGATG ATTCTGCTCC-3'，下 游5'-AGGGCCTTGGTCCTTT GA-3'；β-MHC 序列：上游5'-AGGCAAAGCAAAGA AAGGC-3'，下游5'-AAAGTGAGGGTGCGTGGA-3'；β-Actin序列：上游5'-AATCGTGCGTGACATTAAAG AG-3'，下游5'-CATTGCCGATAGTGATGACCT-3'反应体系10 μL，扩增条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，40 个循环。Ct 值用2法计算目的mRNA相对表达量。

1.6 统计学分析

实验数据采用IBM SPSS Statistics 26软件统计分析，结果表示以均数±标准差，方差齐时选择LSD 法，方差不齐时采用非参数检验，＜0.05表示差异有统计学意义。所有的实验都是独立重复3次。

2 结果

2.1 褐藻素缓解STZ诱导的糖尿病大鼠心肌肥大和心肌纤维化

应用HE切片观察心肌细胞横截面面积，结果显示，与Con组相比，DM组心肌细胞肥大，细胞间排列紊乱。FX组和Met组心肌细胞相比于DM组心肌细胞排列整齐，且细胞横截面面积减少（＜0.05，图1A、B）。Western blot结果显示，DM组心脏组织中纤维化蛋白FN表达相对于Con组上调，FX组和Met组心脏组织中FN表达相对DM组下调（＜0.05 图1C）。DM组心脏组织中纤维化蛋白TGF-β1相对于Con组上调，给予FX和Met处理后，TGF-β1的表达下调（＜0.05，图1D）。

2.2 褐藻素缓解高糖诱导的H9C2心肌细胞肥大

大鼠心肌细胞H9C2购于上海生物化学与细胞生物学研究所。

（3）采用多元评价手段激发学生学习热情。过程性评价有利于学生学习活动中每个阶段的工作均得到认可，逐步引导学生继续努力，力争做到最好。

2.3 褐藻素调控糖尿病大鼠心脏中Nrf2/Keap1通路缓解心肌肥大

与Con 组相比，DM组心脏中Nrf2 表达下调，FX和Met处理可抑制STZ诱导的Nrf2表达下调（＜0.05，图3A）。DM组心脏中Keap1表达相对Con组上调，给予FX和Met处理可抑制Keap1的上调（＜0.05，图3B）。随后，我们检测Nrf2调控的抗氧化蛋白HO-1。与Con组相比，DM心脏中HO-1的表达下调，给予FX处理后，心脏中HO-1的表达上调（＜0.05，图3C）。

2.4 褐藻素调控高糖诱导的H9C2细胞中Nrf2/Keap1通路

高糖诱导H9C2心肌细胞Nrf2蛋白表达下调，给予FX处理后，Nrf2蛋白表达相对于HG组显著上调（＜0.05，图4A）。通过提取核蛋白进一步检测Nrf2入核情况，在高糖诱导情况下，Nrf2蛋白在细胞核中表达相对NG组上调。给予FX处理后，其入核程度显著上调，且与NG 组和HG 组有显著性差异（＜0.05，图4B）。Keap1在高糖诱导H9C2细胞中表达相对NG组显著上调，给予FX处理后，Keap1表达下调（＜0.05，图4C）。

㉕Tony Smith，America’s Mission，the United States and the World Struggle for Democracy in the Twentieth Century(Foreword)，Princeton University Press，1994．

2.5 褐藻素缓解高糖诱导氧化应激抗糖尿病心肌细胞肥大

高糖诱导的H9C2心肌细胞中SOD1蛋白表达相对于NG组显著下调，给予FX处理后，SOD1表达相对于HG组上调（＜0.05，图5A）。相对于NG组，HG组的HO-1表达下调，给予FX处理后，HO-1的表达显著上调（＜0.05，图5B）。通过结合DCFH-DA探针检测细胞内活性氧族（ROS）水平，我们发现在高糖刺激情况下ROS水平相对上调，给予FX处理后，ROS水平降低（图5C）。

3 讨论

糖尿病心肌病的主要特征包括心肌纤维化，心肌肥大以及心脏舒张功能和收缩功能障碍，最终导致心力衰竭、心律失常和心肌梗死。伴随着社会性人口老龄化，肥胖和糖尿病的增加，心力衰竭的发生率和死亡率以惊人的速度增加。糖尿病心肌病发病机制较为复杂，目前没有专门针对糖尿病心肌病的治疗药物。

左小龙一直很喜欢黄莹，但这样的喜欢是一种没有预感到交集的喜欢，所以不曾放在心上，今天这样的场合遇见她，左小龙突然冒出一个想法，他对大帅说：大帅，你觉得黄莹怎么样？

心肌肥大最初表现为心脏对各种刺激的适应性反应，但长期心肌肥大最终会变成病理性肥大，其特点是心肌细胞肥大和成纤维细胞活化，最终可导致适应不良性肥大和心力衰竭。给予FN聚合抑制剂的缺氧模型小鼠，其表现的心脏重构和纤维化的病理变化得到抑制。在过表达TGF-β1转基因小鼠中，心肌肥大和纤维化程度较正常小鼠更为明显，提示TGF-β1可诱导心肌肥大和纤维化。在临床上，ANP和BNP能够提供具有临床和功能价值的信息，他们与心肌肥厚信号呈正相关。本研究显示，DM组大鼠心脏中纤维化蛋白TGFβ1和FN表达上调且横截面细胞面积增加，表明STZ诱导糖尿病大鼠心脏发生心肌纤维化病变和心肌肥大。与Hu等的研究一致，给予FX处理的糖尿病大鼠中TGF-β1和FN表达均下调，因此我们推测FX可缓解糖尿病大鼠心肌纤维化病变和心肌肥大的发生。高糖刺激后H9C2 细胞表面积增加的同时，ANP、BNP 和β-MHC的mRNA 表达也增加，这表明给予高糖可诱导H9C2心肌细胞肥大。FX减少细胞表面积增加，并下调肥大因子ANP、BNP和β-MHC的mRNA表达。上述结果与Hang等研究一致，因此我们认为FX可缓解高糖诱导的细胞肥大。结合体内外研究结果，我们首次发现FX同时抑制糖尿病大鼠心脏和高糖诱导的心肌纤维化和心肌细胞肥大相关指标，但其改善效应的潜在机制有待进一步明确。

氧化应激是心肌肥大发展中关键诱因之一。在高血糖情况下，细胞内葡萄糖代谢受到干扰，伴随着大量ROS的产生。ROS促进成纤维细胞和肌成纤维细胞的活化和增殖，并激活氧化应激诱导的细胞死亡，进一步导致细胞外基质重塑和心力衰竭。自由基的消除主要通过过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽抗氧化物酶和SOD等抗氧化酶来实现，维持氧化应激和抗氧化应激反应的平衡。在本研究中，FX上调HO-1和SOD1蛋白表达水平，缓解高糖诱导的H9C2细胞ROS水平的增加从而起到抗氧化作用。早期有研究表明，荧光素上调HO-1 和NQO-1 缓解氧化应激从而抗心肌肥大，EUK-8作为SOD和CAT模拟物，减轻心脏氧化应激改善心肌肥大。非瑟酮上调抗氧化蛋白SOD1、CAT和HO-1的表达抑制氧化应激的发生，改善心肌肥大。因此我们推测，FX上调糖尿病大鼠心脏和高糖诱导心肌细胞中抗氧化蛋白SOD1和HO-1表达，抑制心脏和心肌细胞内氧化应激水平的增加，可能是其改善糖尿病大鼠心肌肥大机制之一。

Nrf2/Keap1信号通路是体内调控氧化应激重要通路之一。Nrf2的阻断导致氧化损伤的敏感度增加。补骨脂酚调节Sirt1/Nrf2 通路增强心脏抗氧化能力来改善心肌纤维化和肥大。别嘌呤醇增加Nrf2和p62的表达，降低Keap1的表达，缓解氧化应激和凋亡的发生，改善糖尿病大鼠心脏功能。临床上，SGLT2可预防糖尿病二型患者心力衰竭的发展，SGLT2抑制剂促进Nrf2入核且调控其下游抗氧化蛋白HO-1蛋白表达降低心肌氧化应激。FX激活Nrf2-ARE和自噬来减少氧化应激而发挥神经保护作用，这归因于其α，β-不饱和羰基，其结构可以促进keap1 与Nrf2 的分离。ROS上调是糖尿病诱导心脏重塑的关键因素，进一步导致心力衰竭，抗氧化剂治疗心血管疾病也越来越受到大家的关注。本研究发现，FX抑制STZ诱导糖尿病大鼠心脏中Nrf2表达减少，促进高糖诱导的H9C2细胞中Nrf2入核，从而调控其下游抗氧化基因表达，起到抗氧化作用。这与我们观察到FX抑制高糖诱导的心肌细胞中ROS的结果一致，表明FX调控糖尿病大鼠心脏和高糖诱导的心肌细胞中Nrf2的表达，降低Keap1的表达，促进下游抗氧化蛋白HO-1和SOD1表达，从而缓解氧化应激。还有研究显示，Nrf2增强心肌细胞自噬体形成以去除心脏毒性蛋白，进而抑制心脏重塑和改善功能障碍。自噬的激活缓解压力超负荷和心脏损伤引起的心肌肥大。我们推测FX缓解心肌肥大可能与Nrf2/Keap1通路降低糖尿病大鼠和高糖诱导的心肌细胞氧化应激水平有关，我们后续将通过沉默/过表达Nrf2基因，结合体外和体内实验进一步验证Nrf2通路在FX缓解糖尿病心肌肥大中的重要性。

输出方程均为x，其中H=PX (x-BTy+DTu), Rm, Rn, Rp。显然，这两个模型都需要m+n+p个决策变量,与提出的神经网络模型所需变量数一致,但网络层数不同,模型(13)和(14)的层数分别为2和3，而模型(9)仅为单层。

综上所述，我们发现FX对糖尿病心肌纤维化和心肌细胞肥大具有保护效应，并首次揭示FX通过Nrf2/Keap1调控其下游HO-1和SOD1蛋白，抑制高糖诱导的氧化应激。我们前期研究发现FX可通过缓解氧化应激改善糖尿病肾功能和肾纤维化。在此基础上，我们的研究进一步验证FX对糖尿病心肌肥大的保护效应，为FX进一步开发为糖尿病治疗药物提供数据支撑。我们接下来将结合基因沉默或过表达以及转基因动物，进一步确认FX抗糖尿病心肌肥大的作用和机制。