黄芪四君子汤治疗乳腺癌癌因性疲乏的疗效及机制：基于94例临床随机对照试验和网络药理学

乳腺癌是全世界女性发病率最高的恶性肿瘤，中国女性每年发病约为30.4 万，占女性恶性肿瘤发病17.10%，是女性癌症相关死亡的主要原因。近年来乳腺癌的综合治疗方案不断改进，预后也有很大改善，舒缓医学理念亦越来越受重视患者的主观感受。癌因性疲乏（CRF）可发生在乳腺癌治疗前并贯穿整个治疗过程中，部分患者的疲乏症状可能在治疗结束后仍持续许多年，发生率高达80%，CRF不仅仅导致生活质量的各个方面受到干扰，还可能成为生存率降低的危险因素。《美国国家综合癌症网络（NCCN）癌因性疲乏指南（2018版）》提出CRF是一种痛苦的、持续的、主观的、有关躯体、情感或认知方面的疲乏感或疲惫感，与近期的活动量相关，与癌症或癌症的治疗有关，且妨碍日常生活。CRF临床治疗方案目前无统一标准，主要以中枢兴奋剂、皮质类固醇（晚期肿瘤患者首选）为主，虽然有一些治疗效果，但临床效果有限，且副作用多。临床研究表明中医药治疗CRF具有一定疗效且不良反应小，可以作为CRF的补充甚至替代治疗。根据CRF的临床表现可将其归属中医理论中的“虚劳”范畴。近年关于中医药治疗CRF的相关研究越来越多，乳腺癌相关CRF以虚证为主，尤以脾胃气虚证比例居多，但关于脾胃气虚证的CRF大多以个案报道或小样本研究为主，疗效机制的研究亦比较匮乏，尚缺少有力的分子机制佐证。本研究选取94例脾胃气虚型乳腺癌化疗癌因性疲乏患者进行观察，进一步证实黄芪四君子汤治疗癌因性疲乏的临床疗效的同时，利用网络药理学、分子对接技术，从其疗效机理方面进行探索性研究。

武陵自然村调查地面塌陷共37处，主要集中发生在2017年10月16～17日(矿洞透水发生于2017年10月14日)，数量达34处，占调查总数的92%，仅有3处发生在11月20日。塌陷发生期间均有降雨过程。可见矿洞开采透水是本次塌陷发生的诱因，塌陷发生后，受降雨影响，塌陷点的规模逐渐扩大并伴随新的塌陷点出现。

1 资料和方法

1.1 黄芪四君子汤的疗效评价研究

1.1.1 一般资料 所有的研究对象均来源于2018年11月～2020年12月我科病例资料完整的乳腺癌术后患者，94例患者按随机数字表法随机分为2组。化疗组47例：年龄18～69岁，平均47.83±8.53岁；疾病分期ⅡB期11例、ⅢA期15例、ⅢB期11例、ⅢC期10例；肿瘤病理类型中浸润性小叶癌11例、浸润性导管癌16例、乳头状癌10例、髓样癌5例、粘液腺癌5例。中药+化疗组47例：年龄18～69岁，平均45.20±9.61岁；疾病分期中ⅡB期12例、ⅢA期17例、ⅢB期10例、ⅢC期8例；肿瘤病理类型中浸润性小叶癌12例、浸润性导管癌14例、乳头状癌10例、髓样癌6例、粘液腺癌5例。两组间年龄、疾病分期、病理类型等一般资料比较无统计学差异（＞0.05），具有可比性（表1）。本研究所有患者入组前均由研究者与患者本人及家属充分沟通讲解治疗程序、可能的不良反应等，签署了知情同意书，并通过伦理委员会批准（伦理审查批号：伦审第S2016-047-01号）。

1.1.2 诊断标准 （1）西医诊断标准：采用国际疾病分类标准第10版(ICD-10)中的癌因性疲乏诊断标准作为CRF的诊断筛查工具；（2）中医辨证标准：参考2002年中华人民共和国卫生部制定发布的《中药新药临床研究指导原则（试行）》中气虚证的诊断标准，主症：神疲、乏力、气短、头晕、食少。次症：自汗、懒言、舌淡、脉虚或细。符合主症2项及次症1项即可诊断。

1.1.3 纳入标准 按术后病理确诊为乳腺癌；西医治疗方案均按照《中国抗癌协会乳腺癌诊治指南与规范》行规范化AC/EC方案化疗；符合第10版（ICD-10）中的癌因性疲乏诊断标准；ECOG 评分：0～1分；（5）预计生存期大于9月。

1.1.4 排除标准 应用免疫治疗或化疗以外对免疫指标有影响的药物治疗的患者；患有其他严重躯体疾病者；既往有精神病史或智能障碍者；有药物、酒精、毒品依赖者；有脑转移者；有电解质紊乱者；有排除单一性贫血患者。

1.1.5 治疗方法 （1）化疗组（=47）：EC化疗方案（表柔比星90 mg/miv d1，环磷酰胺600 mg/miv d1）或AC化疗方案（多柔比星60 mg/miv d1，环磷酰胺600 mg/miv d1），21d为1个疗程。所有患者均进行常规化疗，并参考《NCCN 癌因性疲乏（CRF）指南（2018版）》给予非药物干预，包括心理疏导、营养辅导以及睡眠干预。心理干预：及时疏导患者恐惧、焦虑状态，并教导患者如何应对应激状况，主要包括支持小组、个体咨询、应激处理训练以及适当的行为干预等方式。营养咨询：主要处理因厌食、腹泻、恶心、呕吐导致的营养不良，并注意维持水电解质平衡。睡眠干预：主要练习睡眠刺激控制、加强了良好的昼夜节律（睡觉和起床有固定的时间，避免服用咖啡等刺激性食品），睡眠的节制（避免长时间的午睡、限制睡觉的时间）和建立能诱导睡眠的环境（如黑暗、安静、舒适）；（2）中药+化疗组（=47）：本组病例在化疗组基础上配合黄芪四君子汤治疗，从第1周期化疗前5 d开始连续服药，100 mL/次，2次/d（早饭前、晚饭后），服用至化疗结束后第14天，共20 d。具体中药：黄芪40 g、党参10 g、茯苓20 g、生白术20 g、炙甘草6 g。煎服方法:中药全部由解放军总医院第一中心中药房提供，煎药室统一浓煎，一副药煎成两袋，100 mL/袋。

1.1.6 观察指标 （1）Piper疲乏修订量表评分：该量表包括躯体疲乏、情感疲乏和认知疲乏3个维度。其中躯体维度共8个条目（3，4，8，14，15，16，17，18）、情感维度共11个条目（5，6，7，9，10，11，12，13，19，20，21）、认知维度共3个条目（22，23，24），共22个条目。每个条目采用likert-5点计分法，评分1（完全没有）至5分（非常严重）。量表计分方法如下∶躯体疲乏评分为8个躯体维度条目评分总和，情感疲乏评分为11个情感维度条目评分之和，认知疲乏评分为3个认知维度条目评分之和，量表总评分（总疲乏）得分=躯体疲乏评分＋情感疲乏评分＋认知疲乏评分。CFS总评分范围是0～110，评分越高疲乏情况越严重。

实施岗位管理包括进行系统的岗位调查、岗位信息的采集、岗位分析等。医院人事处处长王慧卿介绍，北医三院联合中国人民大学劳动人事学院于2013年5月至2014年9月启动全院员工岗位分析项目，通过访谈法、问卷调查法、资料回顾法等对全院93个科室进行岗位分析，完成“部门职责说明书、核心岗位架构图、核心岗位说明书”的编写，形成了医院人力资源管理的基础性文件和可持续应用工具。在岗位说明书中，结构化定义了岗位的基本信息、工作描述、在组织中的位置等要素内容。

其二，上述界定没有揭示我国现行土地管制权最本质的内涵。毋庸置疑，概念是对一事物本质属性的揭示，“本质”代表了某一“概念”的核心部分，只有对“概念”之核心部分的“本质”有所了解，才能对其作出合理、妥当的界定。对我国现行土地用途管制权概念的科学界定亦同样离不开对这一权力本质的揭示。

由于Au、Ag等贵金属主要沉降在阳极泥里，因此降低电解液比重、增加阳极泥的沉降性有利于贵金属的回收。生产实践表明，阳极板银含量低于800×10-6时，电解铜含银可维持在(8～10)×10-6。图4表明，2017年以来，为提高金属回收率，电解重点加强中间物料管理及系统控制等手段，以铜为例，铜回收率为98.8%左右，为提高公司经济效益做出了贡献。

（2）安全性指标：治疗期间，观察患者是否出现皮疹、恶心、腹泻等不良事件，分析原因，判断是否与中药相关，并监测血尿便常规、肝肾功能；测定患者心电图，应用不良事件发生率反映不良事件发生情况。

2.2.2 拓扑分析 将2.2.1 所列PPI 网络图通过NetworkAnalyzer工具进行拓扑分析，degree值大于平均分的靶点共66个，按度值大小排序，度值越大，在网络中起枢纽作用可能性越大，核心靶点可能性越高。结果提示度值前5 的靶点依次为AKT1、CASP3、IL6、JUN、ⅤEGFA。

（3）钻孔冲洗。完成钻孔后，灌浆前应使用4/5灌浆压力的压力水对钻子进行冲洗。当冲洗水的洁净度达标＞l0min，证明钻孔合格。在对灌浆段进行冲洗的过程中，控制单孔冲洗时间必须＞0.5h。

1.2 网络药理学及分子对接研究

1.2.1 黄芪四君子汤活性成分的搜集与筛选 以黄芪四君子汤中白术、党参、茯苓、甘草以及黄芪为关键词，以口服生物利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18为条件，在TCMSP 数据库（https://tcmspw.com/tcmsp.php）中进行化合物成分进行成分的靶点预测，建立药物靶标数据库。通过在GeneCards数据库（https://www.genecards.org/）、NCBI 基因数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）以及OMIM 数据库（https://www.omim.org/）筛“cancer-related fatigue”和“breast cancer”的相关基因，并且建立数据集。将方药活性成分对应的靶点与CRF相关靶点输入韦恩图制作软件Ⅴenny 2.1取交集，寻找药物与疾病的相关靶标。（检索日期：2022年3月13日）

1.2.2 “成分-靶标”交互网络与PPI 网络的构建与GO分析、KEGG分析 将药物疾病共有靶点导入String数据库（https://string-db.org/cgi/input.pl），进行PPI网络的构建,之后将PPI网络中的蛋白进行基因本体（GO）富集分析，分别进行生物过程分析（BP）、细胞组成分析（CC）及分子功能分析（MF），对基因集合或基因簇进行功能聚类的统计分析，根据靶标数目及统计学差异绘制GO富集分析柱状图；对PPI网络中的蛋白进行京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析，得出交互网络中的直接作用靶标相关通路，对结果进行功能聚类的统计分析并绘制KEGG富集分析气泡图。

即时反馈往往能够带来更高的受众参与度以及更强的顾客互动性，这也使得用户能够更加自如地表达交换自己的感受和见解，满足情感宣泄的需要。事实上，信息传播领域中的即时反馈和延迟反馈是沟通的两种方式，前者为同步沟通，后者为异步沟通。在同步沟通模式中，信息沟通是及时的、快节奏的，互动双方能够给予即时的反馈。在异步沟通模式中，个人可以选择延迟做出反馈，沟通主体进行着更低的交流频率。也有学者研究发现，相比异步沟通而言，学习者在同步沟通中更能激发其灵感，并提升学习效果。[1]如此可见，同步沟通和异步沟通两种方式可能会给人们带来认知、心理或行为层面上的不同结果。

1.2.3 成分-疾病-通路-靶点网络构建 将成分-疾病-通路-靶点网络文件导入Cytoscape3.8.0软件构建网络，更直观地展示中药活性成分在治疗乳腺癌癌因性疲乏的多成分-多靶点的作用特点。

2.2.3 关键成分筛选结果 将筛选出的活性化学成分名称与药物活性成分MOL ID进行对接，并按degree值大小排序，从高到低前5的化合物分别为MOL000098槲皮素（quercetin）、MOL000006 木犀草素（luteolin）、MOL000422山奈酚（kaempferol）、MOL000354异鼠李素（isorhamnetin）、MOL003896 7-甲氧基-2-甲基异黄酮（7-Methoxy-2-methyl isoflavone）。degree值越高成分越重要，这些度值较高的化合物可能是黄芪四君子汤治疗CRF的关键化合物。

2 结果

2.1 临床研究结果

2.1.1 两组Piper疲乏量表积分情况比较 两组患者化疗前躯体疲乏评分、情感疲乏评分、认知疲乏评分及总分无明显差异（＞0.05），具有可比性。治疗后中药+化疗组、化疗组躯体疲乏评分、情感疲乏评分、认知疲乏评分及总分，较治疗前均有改善，且差异均有统计学意义（＜0.001）；组间比较，治疗后中药+化疗组躯体疲乏评分、情感疲乏评分、认知疲乏评分及总分较化疗组均有明显改善，具有统计学意义（＜0.001，表1，图1）。

2.1.2 不良反应 两组受试者治疗后血、尿、大便常规，肾功能及心电图检查均无明显异常；治疗期间中药+化疗组中有2例、化疗组中有3例患者均于化疗后第5天出现肝功能损伤（以谷丙转氨酶升高为主），应用保肝药物后3～5 d转氨酶降至正常范围，考虑化疗药物所致肝功能损伤。中药+化疗组和化疗组不良事件发生率分别为4.25%（2/47）、6.38%（3/47），两组比较差异无统计学意义（＞0.05）。

2.2 网络药理学及分子对接结果

2.2.4 GO和KEGG富集分析 将获取的核心靶点信息输入DAⅤID分析平台，物种选择"Homo sapiens"，进行在线GO和KEGG富集分析。GO富集分析结果显示分子功能（MF）141个、细胞组分（CC）富集48种细胞成分，影响了生物过程（BP）2280个，主要涉及氧化应激反应、细胞对化学应激的反应、细胞对氧化应激的反应、活性氧代谢过程、凋亡信号通路的调控、上皮细胞增殖、炎症反应的调节、DNA结合转录因子活性的调控、对氧含量降低的反应、凋亡信号通路的负调控等生物过程。KEGG富集分析显示靶基因显著富集在172条信号通路（Count＞2,＜0.05），选取前20条通路进行可视化分析得到气泡图（图4，纵坐标为富集条目，横坐标表示基因所占比例，图中气泡越大代表富集基因数越多，颜色越红表示富集程度越显著），除外乙肝、前列腺癌等与“乳腺癌癌因性疲乏”不相关的通路后，主要涉及磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K-Akt）信号通路、IL-17信号通路、TNF信号通路。

1.1.7 统计学方法 所有数据均采用SPSS 22.0统计学软件分析。计量资料采用均数±标准差表示，两组间均数的比较采用独立样本检验，采用卡方检验，计数资料采用例数（构成比）表示，＜0.05为差异有统计学意义。

1.2.4 分子对接验证 将“1.2.1”中筛选出的核心活性成分与获得的关键靶点进行分子对接，验证网络药理分析结果的准确性。从PubChem 数据库（https∶//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中确定5个活性成分的化合物名称、分子量和2D 结构，然后在RCSB PDB 数据库（http://www.rcsb.org/）中下载乳腺癌CRF的5个核心靶点。运用AutoDock Ⅴina软件（http://vina.scripps.edu/）进行分子对接，Affinity（kcal/mol）值即代表两者结合能，一般认为Affinity≤-5kcal/mol，结合能力较好，若结合能值越低，配体与受体两者结合越紧密、结合越稳定。取结合能最低的前4个对接结果作图，最后选取affinity最佳构象，使用Pymol软件分析和观察对接结果，并将结果可视化处理。

患者治疗前（化疗前5 d）、一个疗程后（即化疗后的第14天），期间进行2次Piper疲乏量表自我的评价，同时记录用药过程中不良事件的发生。

2.2.1 药物与疾病的靶标筛选 本研究共筛得到黄芪四君汤250个靶标，癌因疲乏相关基因2653个、乳腺癌相关基因15 329个，将筛选出的药物靶点与疾病靶点输入韦恩图制作软件Ⅴenny 2.1（图2），得到161个共有靶点，应用cytoscape软件绘制构建PPI网络（图3），每个节点代表一个蛋白质，每条边表示活性成分与作用靶点之间的关系，节点越大、红色越深，度值（degree）越大；连线越粗表示边介数越大。

2.2.5 成分-疾病-通路-靶点网络构建 利用Cytoscape3.8.0中的Merge功能构建疾病-药材-成分-靶点网络（图5），蓝色节点为疾病即乳腺癌相关的癌因性疲乏，绿色节点表示黄芪四君子汤主要成分，淡紫色节点表示黄芪四君子汤中有代表性的活性成分，淡红色节点代表与乳腺癌相关的癌因性疲乏靶点，黄色节点代表与乳腺癌癌因性疲乏相关的通路。

2.2.6 黄芪四君汤治疗乳腺癌CRF的关键靶点验证 5种活性成分与AKT1、CASP3、IL6、JUN、ⅤEGFA 关键靶点结合能均较低、配体与受体均具有较好的结合力（图6）。其中AKT1靶点与槲皮素、木犀草素、山奈酚、异鼠李素结合活性最好（图7）。

按WHO的建议[4]，CHE是指当卫生支出大于或等于家庭支付能力的40%时；并分别利用Logistic回归模型和多元回归模型分析影响CHE发生概率以及影响医疗自付费用的主要因素。RR借用了流行病学中“相对危险度”的概念，指在其他条件一定时，特定人群人均医药费是观察人群人均医药费的倍数[5]。为消除不同人群收入差异的影响，以矫正相对风险度来反映不同收入水平人群之间疾病经济风险的高低[6]。

3 讨论

3.1 黄芪四君子汤治疗乳腺癌CRF的理论依据

乳腺癌患者经常会出现以非特异性的乏力、虚弱、气短、嗜睡或失眠、少气懒言等为主要临床表现的CRF。据调查研究显示，术前约86%的乳腺癌患者自觉轻度、中度劳累，术后则感到中度、重度疲乏，CRF是最常见的并发症，严重影响患者生活质量及治疗的依从性。目前认为其发病机制与中枢神经系统功能障碍、炎性因子释放、下丘脑调节回路紊乱、线粒体功能障碍等有关。中医则认为CRF归属于“虚劳”范畴，其表现出来的乏力、气短、精神萎靡不振等症状，以及舌质淡嫩、脉象沉细等表现，以脾胃气虚证为主，因此治疗原则应以益气健脾、扶正补虚为法。黄芪四君子汤是由黄芪合四君子汤组成。四君子汤出自《太平和剂局方》的经典方剂，方中党参（原方中人参受道地药材匮乏的影响，目前多用党参代替）性甘、微温，大补元气、补益心脾为君；白术，甘苦性温，补脾益气止汗为臣；茯苓，味甘而淡，健脾渗湿、宁心健脾为佐；炙甘草，味甘性平，甘缓和中为使，四药药性平和，不偏不盛，补而不峻，组成临床补气的基础方。黄芪，甘温升发、补诸虚不足、益元气、壮脾胃，联合四君子汤可增强健脾胃、益正气的功效，更加有效改善CRF患者乏力懒言、自汗食少等症状。现代药理研究结果表明，黄芪可通过刺激NK非特异性免疫细胞的增殖，从而拮抗肿瘤细胞的叠生。四君子汤可调整T淋巴细胞亚群的比例，增强T淋巴细胞的攻击能力，加强NK细胞的活性，从而达到增强免疫抗肿瘤的作用。黄芪四君子汤有刺激免疫系统、抑制肿瘤生长、逆转化疗耐药、缓解骨髓抑制等作用。临床研究亦证实，黄芪四君子汤可促进肿瘤术后患者的恢复，明显改善机体免疫功能。本研究的结果与文献报道一致，黄芪四君子汤在改善患者的临床症状的同时，可以明显降低患者的躯体疲乏评分、情感疲乏评分、认知疲乏评分，且改善程度明显优于单纯的西医治疗组，统计学差异显著，说明其临床疗效确切。

3.2 黄芪四君子汤治疗乳腺癌CRF的活性成分的分析

经网络药理学筛选Degree值较高的黄芪四君子汤主要活性成分槲皮素、木犀草素、山奈酚、异鼠李素、7-甲氧基-2-甲基异黄酮均属于黄酮类化合物，根据这些药物活性成分与乳腺癌癌因性疲乏相关靶标的相关性分析，证实了其在改善乳腺癌CRF 中起到的主要作用。槲皮素通过调节信号通路的活性和基因的表达发挥抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗衰老等生物活性，槲皮素还可以增强了血清、肝脏和腓肠肌中的谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）和过氧化氢酶（CAT）活性，提高抗氧化和糖原储存能力以达到抗疲劳作用。木犀草素可对白血病、肝癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、结直肠癌等多种恶性肿瘤有抑制作用，且对乳腺癌有独特优势，可通过AKT/mTOR信号通路表观遗传调控MMP9的表达来抑制三阴性乳腺癌细胞的增殖和转移；还可通过下调NFE2L2基因的表达从而抑制乳腺癌干细胞以抑制乳癌进展；其衍生物可增强抗氧化酶的活性，增加肝脏和骨骼肌中的抗炎细胞的水平，进一步发挥抗疲劳和抗氧化作用。山奈酚抑制乳腺癌细胞增殖，诱导细胞周期阻滞、凋亡和DNA损伤；对异鼠李素已有研究发现，可通过对PI3K/AKT、NF-κB、MAPK 等信号通路的调节发挥抗肿瘤、抗炎、抗氧化、保护心脑血管等作用。故综合此次分析预测及相关研究结果，推测黄芪四君子汤的主要活性成分可能是通过抗氧化、提升糖原储存能力、抑制肿瘤增殖、杀死肿瘤干细胞达到治疗CRF作用的。

3.3 黄芪四君子汤治疗TNBC的关键靶点、通路结果及分子对接结果分析

蛋白互助网络显示AKT1、CASP3、IL6、JUN、ⅤEGFA等靶点度值大，说明其在黄芪四君子汤治疗乳腺癌CRF机制中有重要作用，其中AKT1的度值最大；KEGG富集结果提示PI3K-Akt信号通路是重要相关通路。AKT1属于丝氨酸/苏氨酸激酶（AKT）家族的一种异构体，Akt是属于PI3K/Akt信号通路的节点分子，Akt异常活化可通过PI3K/Akt 信号通路调控mTOR、PDL1、NFκB、ⅤEGF、MAPK、FoxO、cell cycle、Apoptosis(细胞凋亡)、P53等下游靶蛋白，促进乳腺癌细胞的生长、增殖及迁移；黄芪四君子汤中的野生党参与人参相似补益功效，可通过激活PI3K/Akt/Nrf2通路降低骨骼肌氧化应激，改善老年大鼠疲劳综合征；亦可通过PI3K/Akt/mTOR信号通路介导肌肉蛋白质合成和参与骨骼肌肥大达到抗疲劳作用。而PI3K/AKT信号通路是重要枢纽角色，通过PI3K/AKT信号通路可影响下游多种细胞因子的活化状态，在乳腺癌细胞增殖、凋亡和迁移以及疲劳综合征中扮演重要角色。为了进一步验证黄芪四君子汤对乳腺癌CRF的治疗作用的药效物质基础，本研究对方药的核心化合物与关键疾病靶点进行分子对接分析，数据显示黄芪四君子汤核心化合物与AKT1、CASP3、IL6、JUN、ⅤEGFA 关键蛋白结合力良好。AKT1与黄芪四君子汤中多种主要活性成分结合能最低、结合最稳定，那么AKT1很有可能是关键的核心靶点。综上，黄芪四君子汤中的槲皮素、木犀草素、山奈酚、异鼠李素主要活性成分可能通过作用于AKT1、CASP3、IL6、JUN、ⅤEGFA等核心靶点调控PI3K/AKT、IL-17、TNF等信号通路达到CRF的治疗作用，而通过AKT1调控PI3K/AKT信号通路可能是黄芪四君子汤治疗CRF的最主要作用机制。

综上所述，黄芪四君子汤中的槲皮素、木犀草素、山奈酚、异鼠李素主要活性成分可能通过作用于AKT1、CASP3、IL6、JUN、ⅤEGFA 等核心靶点，调控PI3K/AKT、IL-17、TNF等信号通路达到CRF的治疗作用，而通过AKT1调控PI3K/AKT信号通路可能是黄芪四君子汤治疗CRF的最主要作用机制，为下一步提取中药有效成分，研制乳腺癌CRF药物提供了研究基础。