二甲双胍可能通过Hippo-YAP 通路抑制HER-2 阳性乳腺癌细胞的增殖和促进凋亡

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一。临床上通过肿瘤细胞的雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）、人类表皮生长因子受体－2（HER2）和Ki67增殖指数将乳腺癌患者分为4 种类型：Luminal A 型（ER+、PR+、HER2-），Luminal B型（ER+、PR+、HER2+），HER2过表达型（ER-、PR-、HER2+）和三阴性乳腺癌（ER-、PR-、HER2-）。在乳腺癌患者中，HER2阳性的患者约占到20%～30%。相较于其他类型的乳腺癌，HER2阳性乳腺癌进展速度更快、恶性程度更高，同时也更容易复发和转移，预后情况相对较差。针对HER2的靶向治疗，无论是针对胞外结构域的单克隆抗体类；如曲妥珠单抗、帕妥珠单抗及抗体－药物结合体T-DM1，还是针对胞内酪氨酸激酶结构域的酪氨酸激酶抑制剂；如拉帕替尼、诺拉替尼及阿法替尼等，都能有效地降低死亡风险或复发风险。但在靶向治疗中还是4位患者中就有一位会复发，研究表明联用结合HER2不同部位的帕妥珠单抗及选用抗体－药物结合体T-DM1可进一步提高疗效，但部分患者原发性的耐药以及大部分患者治疗1年左右出现继发性耐药，仍然成为治疗的瓶颈。

糖尿病与乳腺癌的发生有着复杂的关系。患糖尿病的女性与没有糖尿病的女性相比，前者患乳腺癌的风险增加15%～20%，二甲双胍作为临床治疗2型糖尿病的常用降糖药，在多种肿瘤中发现具有一定的抗肿瘤作用，例如胃癌、食道癌和肺癌。尤其在乳腺癌中，大量数据分析表明，二甲双胍能显著降低乳腺癌的发病风险，延长乳腺癌患者的生存时间。其机制可能与二甲双胍可降低乳腺癌合并糖尿病患者的血糖水平，改善患者胰岛素抵抗，发挥抑癌作用有关，另外，也有研究发现，二甲双胍还可以直接作用于乳腺癌细胞株MCF7，下调mTOR 信号通路，影响其增殖和迁移。尽管如此，二甲双胍对不同类型乳腺癌细胞株的作用和机制并不完全清楚，本研究检测二甲双胍对HER2阳性乳腺癌细胞株SKBR3增殖和凋亡的影响，并探讨其机制。

1 材料和方法

1.1 细胞培养

人HER2 阳性乳腺癌细胞株SKBR3 购自美国典型培养物保藏中心（美国马里兰州洛克维尔ATCC）。用含有10%胎牛血清的DMEM 培养，置于37 ℃、5%CO的细胞培养箱中培养。0.25%胰蛋白酶消化传代，每3 d传代1次，倒置显微镜下观察细胞形态。

1.2 细胞活力测定

SKBR3细胞以5000/孔的细胞密度接种在96孔板上，每孔150 μL培养基。分为3组，空白组：未接种细胞，仅加入DMEM高糖完全培养基；对照组：接种细胞且常规培养；二甲双胍（Solarbio，中国）组：分别用0、20、40、60、80、100、120 μmol/L二甲双胍处理并孵育24、48、72 h。使用CCK8试剂（Solarbio，中国）在检测吸光度，与空白相比，根据值计算细胞活力。每个处理条件重复4次，每次至少3个重复孔。IC使用GraphPad Prism软件计算。

综上所述，当前我国的环境污染以及土地资源的利用问题比较严重，人们应该引起足够的重视。在经济快去发展的今天，人们生活水平不断提高，但这种现象应该是可持续发展的，所以相关部门应该注意在经济建设的发现过程中注意环境的保护，重视土地资源可持续发展，实现经济的持续、健康的发展。

1.3 单细胞集落形成试验

张员外的一家老小都上了天。众位神仙早在南天门外等候，请张员外当老天爷，他推辞不了，从此就当上了老天爷，这就是张玉皇。他的七个闺女就成了七仙女了。张玉皇也遇到了麻烦事：种田的要雨，卖菜的要晒葱，撑船的要风，种果树的要露水。张玉皇一听，就下了一道圣旨：“黑夜下雨白天晴，夜浇庄稼日晒葱。果树园里降甘露，河里刮风催帆行。”

1.4 流式细胞术分析细胞凋亡和周期分布

实验分组如下：对照组，常规培养；实验组，给予不同浓度（0～100 μmol/L）二甲双胍的DMEM 高糖完全培养基。收集各组细胞，通过使用补充有蛋白酶抑制剂（Thermo Fisher Scientific）的RIPA 缓冲液从细胞中提取总蛋白。等量的蛋白通过10%SDS-PAGE分离并转移到聚偏二氟乙烯膜（PⅤDF）（Millipore）。所用一抗为YAP（1∶1000;Abways）TAZ（1∶1000 稀释度；Proteintech），二抗为HRP偶联的抗鼠抗兔IgG（PⅤ-9000；北京中山金桥）。使用ECL检测试剂（PerkinElmer）观察蛋白质条带。

1.5 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）反应

使用SPSS22.0软件（SPSS，Inc，芝加哥，伊利诺伊州，美国）进行统计分析。定量数据以均数±标准差表示，多组均数间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD方法，＜0.05为差异有统计学意义。

1.6 蛋白质印迹

取对数生长期的SKBR3细胞，以5×10/孔细胞接种于6孔板各孔中，每孔3 mL培养基。分成2组：对照组：常规培养；实验组，给予含终浓度96.25 μmol/L二甲双胍的DMEM高糖完全培养基。48 h后，使用0.25%胰酶将其消化成单细胞悬液，PBS缓冲液800 r/min离心5 min，弃上清，重复2次。重悬细胞于500 μL PBS（pH7.2）缓冲液中，缓慢加入500 μL预冷75%乙醇，4 ℃固定并保存。若检测细胞凋亡，离心弃去固定液，3 mL PBS重悬5 min，1000 r/min离心5 min，弃去PBS，加入Annexin Ⅴ-荧光素（FTIC）/碘化丙啶（PI）染液双染后上机；若检测周期，1500 r/min离心5 min，弃上清，3 mL的PBS洗涤1次，加入400 μL PI和100 μL RNase A，4 ℃避光孵育过夜，流式细胞仪进行细胞周期检测。

不断更新发展的技术对现代人类社会的冲击和影响，是前所未有的。日新月异的生活源于科学技术的不断创新。金融科技行业是近几年最具发展前景的行业之一。正如经济学家杨涛先生所说：“金融科技能够使我们看到新金融的活力与魅力，我们应该重新审视金融科技。”区块链技术作为金融科技的一员，广受全球各国各行业的追捧，由于其去中心化、匿名性、自治性、数据不可篡改、透明性的特点，突破了以往的信任体系，该技术的应用场景也不断被挖掘拓宽，涉及到金融领域、实体经济领域的方方面面。该技术更是可以与包括大数据、人工智能、物联网等技术相融合应用。各个国家的政府、投资机构都大量投入资金用于区块链在各领域的应用研究。

1.7 免疫荧光实验

纤连蛋白的相对表达量从1.053降低到0.893，N－钙粘蛋白的相对表达量从1.017降低到0.603，波形蛋白的相对表达量从1.083降低到0.447，差异具有统计学意义（＜0.05，图3）。E－钙粘蛋白（E-cadherin）的相对表达量从0.823升高到1.43，但差异无统计学意义（＞0.05）。

1.8 统计分析

实验分组如下：对照组，常规培养；实验组，给予含终浓度96.25 μmol/L二甲双胍的DMEM高糖完全培养基。培养48 h后，使用RNA Isolation Kit（南京华赞生物科技有限公司）从培养细胞中提取总RNA。使用SYBR Green PreMix HS qPCR Kit（ACCURATE BIOTECHNOLOGY HUNAN CO，LTD）进行实时定量RTPCR。所有实验3次重复，并以GAPDH为内参。本研究中使用的引物对如下：

2 结果

2.1 二甲双胍抑制SKBR3细胞的增殖

流式细胞术凋亡检测结果显示：对照组的凋亡细胞比例仅为3.92%，而经二甲双胍处理的细胞凋亡比例明显增多，达到24.5%(图2A）。与对照组比较，SKBR3细胞经二甲双胍处理后，G1期的细胞比例明显增多，而G2/M期的细胞比例减少（图2B）。

表3还表明，在不同分位点上，β的估计值存有比较明显的差异：第一，不同分位点上，对于不同期货合约下，β存在明显差异；第二，随着分位数的增大，不同期货合约下，β有变小的趋势，由此说明，随着原油期货价格的上涨，期货价格对现货价格的引导作用不断下降。

2.2 二甲双胍促进SKBR3细胞凋亡并影响其细胞周期

与空白对照相比，二甲双胍以剂量和时间依赖的方式抑制SKBR3细胞的生长，差异具有统计学意义（＜0.01），IC值为96.25 μmol/L（72 h）（图1A）。克隆形成实验同样显示，随着二甲双胍浓度的增加，克隆形成的数量减少（图1B）。

2.3 二甲双胍能够降低SKBR3细胞中EMT的转录活性

取对数生长期的SKBR3细胞，以2×10/孔接种于提前铺有灭菌爬片的24孔板内，待细胞长至70%密度时，对照组常规培养，加药组给予终浓度为96.25 μmol/L二甲双胍，培养48 h后，使用PBS洗2次，4%多聚甲醛固定30 min后，PBS洗3次；0.1%Triton X-100作用30 min，PBS洗3次；山羊血清封闭1 h后，加入一抗抗体（YAP，1∶100），4 ℃孵育过夜；PBS洗3次，室温加入荧光二抗（1∶100）孵育2 h，避光加入DAPI（每孔10 μL）染核5 min后，PBS洗3次，取出细胞爬片放于滴有抗荧光淬灭剂的载玻片上，荧光显微镜下拍照，实验重复3次。

将SKBR3细胞接种在6孔板（100/孔）中并使其贴壁过夜。细胞用指定浓度的二甲双胍处理72 h，并用不含药物的新鲜培养基替换。在孵育10 d结束时，将平板用4%多聚甲醛固定并用0.2%结晶紫染色。

2.4 二甲双胍下调了YAP/TAZ的表达

定量PCR检测结果显示二甲双胍能够抑制YAP/TAZ mRNA水平的表达，YAP的相对表达量从1.077降低到0.293，TAZ的相对表达量从1.027降低到0.22，差异具有统计学意义（＜0.05，图4A）。同时，三个主要的YAP/TAZ下游基因EGFR相对表达量从1.013降低到0.47、CTGF 相对表达量从1.027 降低到0.28，CYR61相对表达量从1.04降低到0.13，差异具有统计学意义（＜0.05，图4B）。Western blot结果显示随着二甲双胍浓度的增高，SKBR3细胞中YAP和TAZ蛋白水平的表达逐渐降低。当二甲双胍浓度＞80 μmol/L时，YAP和TAZ表达的降低具有统计学意义（＜0.05，图4C～E）。

2.5 二甲双胍处理降低SKBR3细胞中YAP/TAZ的核定位

与对照组相比，二甲双胍处理后的SKBR3细胞中无论是荧光标记的YAP或者TAZ，其荧光的定位更多地聚集于胞浆，而细胞核中荧光的量明显的减少（图5）。相对于对照组，实验组中YAP和TAZ的细胞内分布发生改变，YAP和TAZ更多的分布于胞浆，而核内转移减少（图5）。

为适应隐藏层输入的特点,构建短时间输入序列,通过固定步长来确定时间序列的长度。设步长取值为L,则模型输入为

3 讨论

本研究中，二甲双胍以剂量和时间依赖的方式抑制SKBR3细胞的生长，同时克隆形成实验也证实二甲双胍处理可抑制乳腺癌细胞克隆的形成，且与剂量成正比。进一步流式细胞术检测证实SKBR3细胞经二甲双胍处理后，细胞凋亡比例增加，G1期细胞比例增多，而G2/M期细胞比例减少，提示二甲双胍能促进SKBR3细胞凋亡，且阻滞细胞在G1期，进而抑制其生长。上皮-间充质转化（EMT）能将细胞间粘附紧密的不活动上皮细胞转化为独立的活动间充质细胞，其激活在HER-2阳性乳腺癌的不良预后中起着不可或缺的作用。我们研究发现二甲双胍处理能显著改变上皮-间充质转化特征蛋白的表达。间充质蛋白：纤连蛋白、N－钙粘蛋白和波形蛋白转录活性的降低以及E－钙粘蛋白转录活性的增加。说明二甲双胍处理能减少HER2阳性乳腺癌细胞的上皮-间质转化。这些结果和其他文献中二甲双胍处理的不同类型的乳腺癌细胞结果较为一致。

尽管如此，二甲双胍对乳腺癌细胞作用的机制仍不清楚。YAP/TAZ为Hippo信号通路的两个主要转录共激活因子。YAP-Hippo信号通路是由一系列蛋白激酶和转录因子组成的激酶链，从低等动物到高等动物都具有高度的保守性，是一条抑制细胞生长的信号通路。YAP/TAZ的激活，可以使细胞克服接触抑制，进入一种不受控制的增殖状态，导致细胞无限制增殖，同时抑制细胞凋亡，加快肿瘤的恶性发展。YAP的表达与各种癌症的预后不良有关，YAP可以作为致癌基因在体内外促进乳腺癌的发生和发展。近期研究发现二甲双胍可通过Hippo通路抑制肿瘤细胞活性。例如，二甲双胍通过调节YAP活性抑制胶质瘤细胞干细胞和上皮间质转化，还可以抑制黑色素瘤癌细胞的增殖。本研究，二甲双胍能显著降低YAP/TAZ基因的mRNA 和蛋白水平的表达，并且也能降低EGFR、CTGF和CYR61这3个主要的YAP/TAZ下游靶向基因的表达。说明二甲双胍的处理，可以降低YAP/TAZ的表达，从而抑制下游通路的活性，减轻其促进增殖、抑制凋亡的作用。YAP/TAZ的作用不仅与其表达量相关，还和其细胞内定位有关。在上游信号因子的作用下,YAP/TAZ磷酸化并停留在细胞质中发生SCFβ-TRCP介导的YAP/TAZ泛素化降解。如果上游信号因子被阻断或失活，YAP/TAZ 不能被磷酸化，未被磷酸化的YAP/TAZ迁移进入细胞核，并与TEAD等转录因子结合，促进下游靶基因的表达,从而启动YAP/TAZ的促增殖和抗凋亡活性，促进细胞增殖。免疫荧光实验发现，经二甲双胍处理后，SKBR3细胞中YAP/TAZ的亚细胞定位更多地位于胞浆，而细胞核中的定位减少。表明，二甲双胍能明显抑制YAP/TAZ蛋白向细胞核内的转移，从而抑制下游基因的转录。这些结果说明二甲双胍可以有效地调节该通路，从而影响细胞的增殖凋亡。

在传统的Hippo 信号通路中，LATS1/2 直接调节YAP/TAZ，促进其胞质滞留和蛋白酶体降解。我们研究了二甲双胍对Hippo信号通路核心成分YAP/TAZ的影响，结果表明二甲双胍可降低细胞中YAP/TAZ的表达，抑制其向细胞核内的转移，但并没有研究YAP/TAZ上游分子与二甲双胍的关系以及二甲双胍是如何调节YAP/TAZ表达的改变。除了Hippo信号通路，一些其他通路也可以影响YAP/TAZ。例如，ⅤGLL4可以抑制YAP介导的恶性增殖和肿瘤发生，从而发挥转录抑制功能。因此，后期实验中，我们将进一步研究二甲双胍与Hippo通路的关系。