丹参酮IIA通过介导PI3K/Akt-eNOS信号通路改善野百合碱所致大鼠肺动脉高压

肺动脉高压是一种罕见但危害极大的心肺血管疾病，被称作心血管里的癌症。其发病率低，但一旦发生会增加特发性肺纤维化、慢性阻塞性肺疾病和慢性心力衰竭的风险。流行病学资料显示特发性及遗传性PAH患者在经过常规治疗后，5年生存率仅为20.8%。目前，临床上用于治疗肺动脉高压的药物不多，而且药价昂贵，这使得肺动脉高压面临用药尴尬，也是造成治疗困境的原因之一。

丹参酮IIA是中国传统中药丹参的成分，报道认为其对肺动脉高压的治疗起着重要的作用。研究证实，肺动脉平滑肌细胞增殖是肺动脉高压程度加重的原因之一，磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B-内皮型一氧化氮合酶（PI3K/Akt-eNOS）信号通路在各种细胞生长、迁移及增殖的调节中起着重要作用，内皮型一氧化氮合酶（eNOS）受磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（PKB/Akt）的调控。目前尚未有实验证据表明丹参酮IIA治疗野百合碱所致大鼠肺动脉高压与PI3K/Akt-eNOS信号通路有关。结合文献调查及前期预实验基础，我们推测丹参酮IIA可能通过调控PI3K/Akt-eNOS信号通路发挥改善肺动脉高压的作用，故本文进行了初步探索，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 实验动物

雄性无特定病原体（SPF）级Sprague-Dawley（SD）大鼠100只，体质量169～225 g，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK(京)2018-0044。SD大鼠饲养于25 ℃恒温，相对湿度50%，常规饲料与自由饮水，以及12 h光照/黑暗交替循环的屏障环境中。所有动物处理和程序均经南方医科大学动物保护和使用委员会批准。

1.2 试剂

野百合碱（MCT）（Sigma-aldrich）；PI3K 抑制剂LY294002（Sigma）；细胞核染料4'，6-diamidino-2-phenylindole （DAPI,Partec Flow Cytometry Technology）；RIPA裂解液（Cell SignalingTechnology）；超敏型电化学发光显色（ECL）试剂盒（赛默飞世尔科技公司）。

1.3 仪器

蛋白电泳仪、转膜仪及Quantity One 1-D分析软件购自Bio-Rad公司；BL-420S 生物机能实验系统购自成都泰盟科技有限公司；HistoCore Arcadia 包埋机（EG1150H）与手动转轮石蜡切片机（RM2235）购自上海莱卡仪器有限公司。

肺小动脉肌化程度如图3所示。对照组完全肌化肺小血管比例为（12±2.46）%，而模型组大鼠完全肌化肺小血管比例高达（51.37±5.45）%，差异具有统计学意义（＜0.001）。丹参酮IIA组完全肌化肺小血管比例较模型组显著降低，约占（13.17±2.95）%，差异具有统计学意义（＜0.001）。丹参酮IIA+PI3K抑制剂组为（48.25±4.13）%（=0.71），PI3K 抑制剂组为（47.39±3.14）%（=0.53），差异无统计学意义（＞0.05）。

“一体化控制法”替代基于容量的启/停循环（加载/卸载时序控制）。变速提供了更高效、更可靠的节能解决方案，它能在较宽的工作设计范围内随着数据中心热负荷的不断变化而高效地响应运行。同时，需要采用一种适用于变速设备工作特性的控制策略，使其能重新发挥所有变速设备的优势。在变速制冷系统中，所有电动设备的转速随负荷的增减而增减（此方案完全不同于在非全负荷条件下让定速设备全速运转同时采用机械限流的措施来控制流量）。压缩机一旦使用了变频器（VFD），泵和风机在非满负荷条件下的效率都会得到提高。由于泵和风机的运行遵循“功率与转速的立方成正比（P∝N3）”的定律，因此，节能的潜力是非常巨大的。

1.4 动物分组及处理

HE染色结果见图2。对照组大鼠肺组织血管厚度正常，肺小动脉（直径＜100µm）血管中层约占血管总横截面积（21.12±3.40）%，而模型组大鼠肺小动脉中膜厚度明显增加，约占血管总横截面积（46.37±2.29）%，差异具有统计学意义（＜0.001）。与模型组比较，丹参酮IIA组肺小动脉中膜厚度较模型组显著降低，约占血管总横截面积（35.28±3.46）%（=0.006），差异具有统计学意义（＜0.01）。丹参酮IIA+PI3K抑制剂组为（43.17±3.56）%（=0.59），PI3K抑制剂组为（41.24±3.34）%（=0.23），差异无统计学意义（＞0.05）。

1.5 大鼠右心室收缩压和右心室肥厚指数的测定

各组大鼠饲养4周后，终止实验，将大鼠腹腔注射戊巴比妥钠40 mg/kg进行麻醉，经颈行正中切口，找到右颈外静脉并分离出，采用经颈静脉右心导管插管的方法检测右心室收缩压（RⅤSP），记录数值，立即处死大鼠取出心脏，剪去心房和心耳，分别称量右心室、左心室和室间隔的质量，采用滤纸吸干血液后称质量，右心室肥厚指数（RⅤHI）=右心室质量/（左心室质量+室间隔质量）。

1.6 苏木精-伊红（HE）染色

取各组大鼠肺组织置于4%多聚甲醛中固定24 h，然后进行脱水、石蜡包埋和切片，最后再经过苏木精染色、1%盐酸乙醇分化、返蓝、伊红染色、脱水、透明、中性树胶封片等步骤即可观察大鼠肺血管形态。

WT%=（2×WT/ED）×100%。

图13-图15所示的是小曲拐应力、应变最大的节点1 703(从图7-图9可以看出3个小曲拐的发生最大应力、应变的节点编号均为1 703)的应力、应变随主轴转动一周的变化情况。由图中可以看出，3个小曲拐应力应变的变化规律基本一致，进一步说明了涡旋压缩机3个小曲拐受力情况与运动规律基本相同，符合小曲拐平面四杆机构的运动规律。由于涡旋压缩机电动机刚开始驱动，因此图中刚开始会出现一个突变状况，由图中看出3个小曲拐的最大应力约为11N/mm2，而最大应变约为7×10-5mm。由此可见，小曲拐的变形还很小的，因此选择的小曲拐符合涡旋压缩机防自转的要求，并为小曲拐的进一步优化设计提供重要的参考。

（WT：管壁厚度；ED：血管外径）。

布莱德先生说：“南希是我们这里的一个病人，患乳腺癌，人很年轻，只有44岁。她在这里住了四周，刚住进来的时候，非常紧张，非常恐惧。经过训练，她变得很平静了。刚才去世的时候，她十分安详。”

1.7 α-SMA免疫荧光染色

试剂盒购自研域（上海）化学试剂有限公司，操作按照试剂盒说明严格进行。

1.8 Western blot实验

（1）提取大鼠肺组织总蛋白并取10 μL进行电泳，电泳条件：电压先设为80 Ⅴ，当溴酚蓝泳动至分离胶后调升至120 Ⅴ至溴酚蓝达分离胶底部；（2）转膜：100 Ⅴ电压水浴2 h，蛋白转移至聚偏氟乙烯（PⅤDF）膜；（3）封闭：PⅤDF膜浸泡于5%牛血清白蛋白（BSA），室温下封闭2 h；（4）过夜：将磷酸化的信号通路抗体（PI3K、Akt、eNOS）用5%BSA稀释至工作浓度4 ℃孵育过夜；（5）洗膜：将辣根过氧化物酶结合的二抗用5%BSA稀释至工作浓度，与PⅤDF膜于室温下作用1 h；再次洗膜，在PⅤDF膜上滴加适量的ECL发光试剂，室温下作用1 min，用GelDocTM+系统进行曝光。用Quantity One 1-D分析软件对条带进行灰度扫描，并对其进行定量分析。

1.9 ELISA实验

取各组大鼠肺组织置于4%多聚甲醛中固定24 h，然后进行脱水、石蜡包埋和切片，再经过α-SMA免疫荧光染色以观察大鼠肺血管形态。

1.10 统计学处理

数据采用GraphPad Prism8软件进行处理，所有数据用均数±标准差表示，多组样本间差异使用单因素方差分析比较，以＜0.05为差异有统计学意义。所有的实验都是独立重复3次。

培养学生的体育核心素养，可以使学生自主健身，这有利于提高学生的身体素质，使学生掌握体育的基本知识、运动技能，掌握科学的锻炼身体的方法，养成锻炼的良好习惯，能够提高自主锻炼的能力，使学生的身体终身受益。提高他们的体育意识，增强学生的体质健康水平。可以培养学生自我锻炼、自我评价的能力，有助于培养终身体育，具有长远的意义。

2 结果

2.1 丹参酮IIA对MCT诱导大鼠右心室收缩压和右心室肥厚指数的影响

PI3K、Akt、eNOS蛋白表达情况如图4所示。与模型组比较，对照组大鼠肺组织PI3K、Akt、eNOS 蛋白磷酸化程度增加（＜0.001）；丹参酮IIA 组大鼠肺组织PI3K、Akt、eNOS蛋白磷酸化程度增加（＜0.001）；丹参酮IIA+PI3K 抑制剂组和PI3K 抑制剂组p-PI3K和p-Akt、p-eNOS 的表达与模型组相比无明显差异（＞0.05）。

2.2 丹参酮IIA对MCT诱导大鼠肺动脉中膜厚度影响

将购买的100只SD大鼠（动物质量合格证号：ZS-2020-0617）饲养1周后随机分为5组（20只/组）。模型组（MCT）、丹参酮IIA组（TIIA）、丹参酮IIA+PI3K抑制剂组（TP）、PI3K 抑制剂组（PI）均先颈背部皮下注射MCT 60 mg/kg进行造模，对照组（Control）注射等体积的生理盐水。造模2周后，丹参酮IIA组腹腔注射丹参酮IIA10 mg/kg、丹参酮IIA+PI3K抑制剂组腹腔注射丹参酮IIA 10 mg/kg+PI3K抑制剂1 mg/kg，PI3K抑制剂组注射PI3K抑制剂1 mg/kg，对照组和模型组腹腔注射等体积生理盐水，连续2周。

2.3 丹参酮IIA对MCT诱导大鼠肺小动脉肌化影响

2018年7月21至22日在德国汉堡举行了“汉堡作曲家国际比赛ICOM钢琴比赛”。比赛结果如下：第一名是日本的Satona Sakaguchi；第二名是日本的Mariko Nogami；第三名是俄罗斯的Andrey Denisenko。

2015 年7月至 2015年12月，3 名参加培训的医师均顺利完成基础操作训练和吻合模拟训练。经过 20 次吻合训练后，总体评分由训练前的（65.0±10.8）分提高至（92.7±3.5）分，平均吻合时间由（279.0±48.0）s 缩短至（119.3±12.5）s，运动距离由（459.0±59.2）cm 缩短至（239.3±33.9）cm，差异均有统计学意义（P 均＜0.05）。器械碰撞次数、器械离开视野次数、脱离目标次数在训练前后无明显变化（P 均＞0.05）。详见表1。

2.4 丹参酮IIA抑制PI3K/Akt-eNOS信号通路

对照组大鼠右心室收缩压和右心室肥厚指数正常，分别为（13.1±0.55）和（0.21±0.02），而模型组大鼠右心室收缩压和右心室肥厚指数明显增加，分别为（28.9±1.35）和（0.53±0.03），差异具有统计学意义（＜0.001）。丹参酮IIA组右心室收缩压和右心室肥厚指数较模型组显著降低，分别为（17.9±0.75）和（0.35±0.02），差异具有统计学意义（＜0.001）。丹参酮IIA+PI3K抑制剂组为（27.3±0.76，=0.18）和（0.5±0.02，=0.25），PI3K抑制剂组为（27.6±1.05，=0.32）和（0.49±0.02，=0.10），差异无统计学意义（＞0.05，图1）。

2.5 丹参酮IIA降低MCT诱导大鼠血清中eNOS、NO含量

对照组大鼠血清中eNOS、NO含量分别为（12.11±1.48）μmol/L和（33.61±4.03）μmol/L，模型组大鼠血清中eNOS、NO 含量降低，分别为（3.69±0.36）μmol/L 和（7.37±1.05）μmol/L，差异有统计学意义（＜0.001）；而丹参酮IIA组大鼠血清中eNOS、NO含量增加，分别为（10.78±2.37）μmol/L和（32.45±3.98）μmol/L，差异有统计学意义（＜0.001）；丹参酮IIA+PI3K 抑制剂组和PI3K抑制剂组与模型组比较，大鼠血清中eNOS、NO含量降低轻度增加，丹参酮IIA+PI3K抑制剂组大鼠血清中eNOS、NO含量分别为（4.12±2.06）μmol/L（=0.99）和（8.18±2.18）μmol/L（=0.99），PI3K抑制剂组大鼠血清中eNOS、NO 含量分别为（4.08±1.13）μmol/L（=0.99）和（7.98±1.12）μmol/L（=0.99），差异无统计学意义（＞0.05，图5）。

3 讨论

PAH被称作心血管里的癌症，是一种罕见的致命的高危心肺血管疾病，会引起各种各样的并发症，如缺氧导致的呼吸困难，甚至是呼吸功能不全以及紫绀，右心房功能不全导致的肝硬化、房颤、水肿、发育不良、急性心脏病等，在严重的时候还会导致意外的猝死。因此，采用积极有效的治疗措施是预防和治疗PAH的关键。

目前，PAH治疗在用药方面存在一定的困难，一方面是无特效治疗药物，另一方面是目前绝大部分治疗药物未纳入医保，这给患者带来极大的经济负担。丹参是一种中药制剂，在市场上比较受欢迎，并且在治疗肺动脉高压中有着较好的疗效，而丹参酮IIA是其主要有效成分之一，且野百合碱诱导的肺动脉高压模型简单、可靠且在经济上适用。因而，本研究拟探究丹参酮IIA治疗野百合碱诱导大鼠肺动脉高压的作用机制。

丹参酮ⅡA是一种含量在丹参中最丰富，效果最佳的水溶性衍生物，广泛用于心血管疾病的治疗。刘礼姣等通过研究发现丹参酮IIA可通过调控低氧肺动脉平滑肌细胞中PI3K/Akt信号通路从而改善PAH中肺血管重构，但尚没有研究证实丹参酮IIA在野百合碱诱导大鼠肺动脉高压中的作用机制。PI3K/Akt-eNOS信号通路在调控炎症反应和氧化应激中起着重要的作用，也参与野百合碱诱导的大鼠PAH的发生和发展中，可阻止疾病的进程。有研究报道，PI3K和Akt是涉及细胞生长、生存的关键蛋白，PI3K/Akt-eNOS通路激活能够导致Akt的473位丝氨酸及eNOS的1179位丝氨酸磷酸化，可影响肺动脉平滑肌细胞增殖，从而抑制肺血管壁重构，舒张血管，促进NO 的合成与分泌，改善右心功能的作用，治疗肺动脉高压。李敏静等通过研究发现血府逐瘀汤治疗PAH 可能是通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路活化从而减轻肺血管重构有关。王立鹤等通过研究发现N-乙酰半胱氨酸可通过激活PI3K-Akt-eNOS-NO通路实现对慢性阻塞性肺疾病肺动脉高压大鼠的临床症状。

本研究通过测量不同组别大鼠的肺动脉压力，发现丹参酮IIA能降低MCT诱导的肺动脉高压。通过对各组大鼠肺动脉中膜厚度进行研究，发现丹参酮IIA组肺小动脉中膜厚度较模型组显著降低，而丹参酮IIA+PI3K抑制剂组和PI3K抑制剂组肺小动脉中膜厚度与模型组无显著差异，这提示丹参酮IIA可能是通过调控PI3K信号通路降低MCT诱导大鼠肺动脉中膜厚度。且通过同样的方法研究丹参酮IIA对MCT诱导大鼠肺小动脉肌化的影响，通过对比各组大鼠完全肌化肺小血管比例，发现丹参酮IIA对MCT诱导大鼠肺小动脉肌化的影响与丹参酮IIA对MCT诱导大鼠肺动脉中膜厚度影响一致，进一步证实丹参酮IIA可能是通过调控PI3K信号通路治疗肺动脉高压。

虽然本文只是从黄老师的教学语言特点来分析，但黄老师的课堂全程渗透着黄老师“本色语文，共生教学”的教学理念和“以人为本”的学生观，“本色语文”教学理念最核心的主张就是“把语文课上成语文课，用语文的方法教语文”在此可见一斑。

此外，通过对不同组别的肺动脉高压大鼠PI3K、Akt、eNOS蛋白表达进行分析，发现与模型组大鼠相比，丹参酮IIA组大鼠肺组织PI3K、Akt、eNOS蛋白磷酸化程度显著增加，而丹参酮IIA+PI3K抑制剂组和PI3K抑制剂组与模型组比较无显著性差异，这提示丹参酮IIA可能是通过激活PI3K/Akt-eNOS 信号通路发挥治疗PAH的作用，且这一作用可被PI3K 抑制剂LY294002所阻断。

肺动脉内皮细胞能够调节肺血管收缩与舒张，其结构在缺氧、炎症等因素的作用下易受损，使NO、前列环素等合成和分泌失衡，从而导致血管中膜层增厚，非肌型小动脉肌化，最终导致肺血管重构。在肺细小血管的重建中，NO起着重要作用，而在内皮细胞中下调eNOS表达可减少NO的生成。从本研究结果对各组大鼠血清中eNOS、NO含量的比较中可以看出，丹参酮IIA可以上调eNOS、NO的表达，扩张血管，利于肺动脉高压的治疗。

综上所述，本研究首次证明丹参酮IIA对野百合碱诱导大鼠肺动脉高压起着良好治疗效果的原因主要在于通过介导PI3K/Akt-eNOS信号通路实现的，这为进一步研究肺动脉高压的发病机制和治疗方法提供了科学依据。