二氢杨梅素通过抑制HMGB11改善糖尿病大鼠心功能不全

糖尿病（DM）已成为日益严重的全球健康负担，对世界各国的公共卫生都构成了巨大的挑战。糖尿病会引起并发症，如糖尿病心肌病变。与非糖尿病患者相比较，糖尿病患者更易发生心律失常。高糖高脂饮食可导致心肌电生理改变，传导速度降低，在糖尿病心肌病变的过程中增加猝死和恶性心律失常发生的几率。因此，探讨糖尿病心功能不全的发生机制与其药物治疗具有重要意义。

二氢杨梅素（DHM）是蛇葡萄属植物中发现的一种二氢黄酮类化合物，具有较强的抗炎作用。研究表明，二氢杨梅素能改善链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠心脏左室射血分数和左室短轴缩短率，对糖尿病心功能不全具有保护作用。同时也有研究证明，二氢杨梅素能通过激活自噬抑制miR-34a预防糖尿病性心肌病。然而，二氢杨梅素对糖尿病心功能不全及传导异常的保护作用机制尚未阐述清楚。

糖尿病心脏功能不全的机制非常复杂，但有证据表明，代谢改变、ROS的过度产生、炎症和自主神经功能障碍都与此有关。高迁移率族蛋白-1（HMGB1）在细胞核中高表达，当其在高糖的刺激下释放到细胞外作为信号分子诱发炎症反应。但是有关HMGB1在糖尿病心肌病变中的作用尚不清楚。已有研究表明，二氢杨梅素能下调BGC-823 细胞及人脐静脉内皮细胞HMGB1的表达，抑制炎症反应。二氢杨梅素能否通过下调高血糖所致大鼠心肌细胞的HMGB1表达和释放，抑制糖尿病心肌病变中心脏传导异常尚未见报道。

因此，本实验将通过构建2型糖尿病动物模型，探讨二氢杨梅素能否通过调控HMGB1改善糖尿病大鼠心功能不全的现象，以期为糖尿病心肌病变提供治疗的新思路。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康SPF 级雄性SD大鼠24只，6～8周龄，体质量180～220 g，购自湖南省斯莱克景达公司，动物使用许可证号SCXK（湘）2016-0002，动物实验均按照新药药效与安全性评价湖南省重点实验室动物伦理与福利委员会的指导方案和批准进行（审批号：IACUC-2020（2）031），实验遵循3R原则。

1.1.2 主要仪器与试剂 血糖仪（罗氏）；酶标仪（Thermo Scientific）；冷冻高速离心机（Eppendorf）；垂直电泳仪（Bio-Rad）；MPA 2000心功能分析系统（上海市奥尔科特生物科技有限公司）；心脏彩色超声仪（Philips）；二氢杨梅素（由心脑血管天然药物研究湖南省重点实验室提供，纯度≥98%）；链脲佐菌素（STZ，Sigma）临用前用枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液配置；二甲双胍（施贵宝）；胰岛素ELISA试剂盒（碧云天）；TG、TC、LDL、HDL试剂盒（建成生物）；苏木素伊红（HE）染色试剂盒（碧云天）；HMGB1 兔多克隆抗体（Abcam）；NFκB p65兔多克隆抗体（Abcam）；磷酸化NF-κB p65（p-NF-κB p65）兔多克隆抗体（CST）；β-actin 小鼠单克隆抗体（博士德）；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔（中杉金桥）；辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠（中杉金桥）。

订货成本是指企业在决定购买某种或是某些产品后向供应商发出订单而发生的成本，主要包括内部人员费用和管理费用。企业订购成本主要特征是与采购次数有关，而与企业订货量大小无关。

1.2 方法

1.2.1 动物建模及给药 24只SD大鼠随机分为正常对照组（Contol）、2 型糖尿病组（T2DM）、阳性对照二甲双胍组（MET）、二氢杨梅素组（DHM），6 只/组，适应性喂养1周。T2DM和药物干预组，高脂高糖饮食（高脂高糖饲料的配方为10.0%猪油、20.0%蔗搪、2.5%胆固醇、1.0%胆酸纳、66.5%常规饲料）喂养6周后，一次性小剂量腹腔注射STZ（30 mg/kg），继续给予高糖高脂饲料72 h，72 h后禁食16 h，测定空腹血糖，血糖值≥16.7 mmol/L视为造模成功，造模成功后持续给予高糖高脂饮食直至实验结束。Control组大鼠给予注射等量的柠檬酸缓冲溶液。在T2DM大鼠造模成功的第2天，MET剂量采用大鼠临床等效剂量，MET成人日服剂量为1500 mg/d，按照60 kg的人计算临床剂量为25 mg/kg/d，转换为大鼠的剂量约为150 mg/kg/d，MET组大鼠灌胃MET（150 mg/kg/d），DHM组剂量参考文献中使用的剂量给予DHM 灌胃（250 mg/kg/d），连续用药8 周，T2DM组和对照组灌胃等量的生理盐水。

1.2.5 计算大鼠全心肥厚指数 全心肥厚指数（HWI）=全心质量/体质量（HW/BW）

1.2.3 心脏彩色超声仪检测大鼠心功能 用药结束后，3%戊巴比妥钠（0.3 mL/100 g）麻醉大鼠，称重记录，然后剃毛备皮，固定大鼠，对各组的大鼠行超声心动图检测，测量并记录大鼠左室射血分数（EF），左室短轴缩短率（FS），左室舒张期容积（EDⅤ），左室收缩期容积（ESⅤ）、心率（HR）、左心室舒张末期内径（LⅤIDd）及左心室收缩期内径（LⅤIDs），计算大鼠的每搏输出量（SⅤ）：EDⅤ-ESⅤ，每个值取测量3次后的平均值。

闸基高程3.9～8.2m为第②层壤土，构成地基直接持力层，具中等压缩性，微透水性，稳定性较好。高程3.3～3.3m为②1层粉土，中密，具中等透水性，渗透稳定性较差，具液化潜势。高程3.3m以下为③壤土，具中等压缩性，微透水性，土质不均匀，含腐殖质和贝壳碎屑等。

1.2.2 大鼠OGTT实验、空腹血糖、血脂、胰岛素指标检测大鼠禁食6 h后，口服1.11 mol/L葡萄糖溶液（2 g/kg），断尾取血测定0、0.5、1、1.5、2 h血清葡萄糖水平，计算大鼠口服糖耐量（OGTT）曲线下面积（AUC），AUC（mmol/Lˑmin）=30×（0.5×C0+0.5×C2+C0.5+C1+C1.5）。用血糖仪测定空腹血糖值（FBG），大鼠腹主动脉取血，4 ℃，3000 r/min，离心10 min分离血浆，胰岛素试剂盒检测胰岛素含量，计算胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）及胰岛素敏感指数（HOMA-ISI），计算公式如下：HOMA-IR=FBG（mmol/L）×FINS（mU/L）/22.5、HOMAISI=22.5/FBG（mmol/L）×FINS（mU/L），糖化血红蛋白（HbA1c）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL-C）、低密度脂蛋白（LDL-C）送湘南学院附属医院检验科进行测定。

与正常对照组比较，T2DM组空腹血糖、糖化血红蛋白、血糖AUC及胰岛素抵抗指数显著升高（＜0.01），胰岛素敏感指数显著下降（＜0.01）。与T2DM组比较，DHM组空腹血糖、糖化血红蛋白、血糖AUC及胰岛素抵抗指数显著降低（＜0.01），胰岛素敏感指数无明显升高；阳性对照组空腹血糖、血糖AUC以及胰岛素抵抗指数显著降低（＜0.01），糖化血红蛋白及胰岛素敏感指数差异无统计学意义（＞0.05，图1）。

1.2.6 心肌组织HE染色 4%多聚甲醛固定大鼠心脏组织，依次进行梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋等步骤，石蜡切片切成5 μm，进行二甲苯脱蜡、苏木精及伊红染色，分别拍照记录各组左室心肌的病理形态学改变。

1.2.9 统计学方法 数据用SPSS 22.0 统计软件进行处理，组间比较采用单因素方差分析进行统计学分析，采用Dunnett's检验的方法进行组间多重比较，＜0.05 认为差异有统计学意义。

1.2.8 Western blot检测心脏组织的蛋白表达 心肌组织在液氮中研磨至粉末状，提取心肌组织总蛋白并测定其浓度，取30 μg 蛋白样品进行SDS-PAGE 凝胶电泳，将蛋白转移至PⅤDF 膜上，以β-actin 为内参照，兔抗羊HMGB1、NF-κB p65及p-NF-κB p65 为一抗，通过Western blot测定其HMGB1、NF-κB p65及p-NF-κB p65 相对表达量，实验重复3 次。

③在县级层面上对相关法规进行配套完善。以民勤为代表，主要包括：《民勤县关于关闭部分机井及机井更新的实施意见》《民勤县机井审批管理办法》《民勤县关于严格落实“三禁”政策加强生态环境保护的意见》《民勤县水资源配置方案》《民勤县实施以水定电控水管理办法》《民勤县地下水计量控制设备管理办法》。

1.2.7 血浆中炎症因子含量测定 大鼠腹主动脉取血，4 ℃，3000 r/min，离心10 min分离血浆，HMGB1试剂盒检测血浆中HMGB1的含量。

1.2.4 心功能分析系统测定大鼠心电图 用药结束后，大鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠（0.3 mL/100 g）进行麻醉。麻醉后仰卧位固定大鼠，用针分别插入大鼠的双上肢和右下肢皮下，再用心电图电极固定在双上肢（左前为红色电极，右前为绿色电极）和右下肢（取黑色电极），使用MPA2000心功能分析系统记录标准Ⅱ导联的心电图。

其次，就是文章的内容。乍一看，似乎也未尝不可；细思量，则让人生疑。比如，中秋节，他罗列一些从古到今的名人赏月轶事，到了春节，他又搜寻出古人如何过年的传说。一年三百六十五天，春、夏、秋、冬四季歌写毕，再接着写二十四节气，拉拉杂杂地写些个无关痛痒的陈词滥调。今年发表了，明年连改都不用，仍可发表。

2 结果

2.1 DHM对T2DM大鼠糖代谢的影响

21世纪初中国推出文化“走出去”战略以来，成绩斐然，“译介在其中发挥了十分关键的作用”[1]。谢天振教授提出的“译介”致力于“揭示译语文化系统中的政治、意识形态、文学观念、经济因素等对文学翻译的操纵和影响”[2]。由此，“译介”的概念不再局限于自身框架中，它突破传统意义上的翻译研究，从其他学科汲取养分丰盈自己，获得更为长久的生命力。传播学不仅是一门探讨传播现象与规律的学科，其交叉学科的属性也使得它成为一种研究方法。从传播学的角度来审视文学作品的译介，不仅完善了传播学的知识体系，推动传播学理论建设，也为译介研究提供新思路、新方法、新收获。

2.2 DHM对T2DM大鼠脂代谢的影响

与正常对照组比较，T2DM组TC、TG、LDL-C显著升高（＜0.01），HDL-C显著下降（＜0.05）。与T2DM组比较，阳性对照组HDL-C显著升高（＜0.05），而TC、TG及LDL-C差异无统计学意义；DHM组TG显著下降（＜0.01）、HDL-C 显著升高（＜0.01），而DHM 对T2DM大鼠TC和LDL-C的影响无统计学意义（图2）。

2.3 DHM对T2DM大鼠心功能的影响

与正常对照组比较，T2DM组心脏彩超EF、FS、SⅤ显著下降（＜0.05或＜0.01），LⅤIDd、LⅤIDs显著升高（＜0.01）；与T2DM组比较，DHM组EF、FS、SⅤ显著升高（＜0.01），阳性对照组EF、FS显著升高（＜0.01），而SⅤ变化无统计学意义，阳性对照组及DHM组LⅤIDd、LⅤIDs显著下降（＜0.05或0.01，图3）。

2.4 DHM对T2DM大鼠心电图、心率及心脏指数的影响

与正常对照组比较，T2DM心电图结果显示有明显的房颤现象，心率显著下降（＜0.05），心脏指数明显升高（＜0.01）；与T2DM组比较，阳性对照组及DHM组房颤现象明显改善，心率显著升高（＜0.05或0.01），心脏指数明显下降（＜0.05或0.01，图4）。

2.5 DHM对T2DM大鼠心肌组织病理形态的影响

对各组大鼠心肌组织HE染色结果显示，正常对照组大鼠心肌细胞排列规则，无心肌纤维断裂。T2DM组大鼠心肌细胞体积增大，排列不规则，肌束间隔中有大量血细胞聚集以及炎症浸润。阳性对照组和DHM组大鼠心肌组织病理形态学变化明显改善，其中阳性对照组尚有少量血细胞聚集及炎症浸润，DHM 在改善T2DM大鼠心肌组织炎症浸润上更为明显（图5）。

2.6 DHM对T2DM大鼠心肌组织及血浆中HMGB1蛋白的影响

与正常对照组比较，T2DM组HMGB1蛋白在心肌组织中的表达及血浆中的释放显著升高（＜0.01）；与T2DM组比较HMGB1蛋白在DHM组心肌组织中的表达及血浆中的释放显著降低（＜0.01），而阳性对照组差异无统计学意义（图6）。

合理确定各因子权重对评价系统非常重要。目前，确定权重的方法有很多种，分为主观赋权法和客观赋权法。基于层次分析法和熵值法的指标融合权重，使主观和客观相结合，计算权重更加合理、真实。

2.7 DHM对T2DM大鼠心肌组织p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白的影响

与正常对照组比较，T2DM组心肌组织中p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白比值显著升高（＜0.05）；与T2DM组比较阳性对照组与DHM组心肌组织中p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白比值显著降低（＜0.05或0.01，图7）。

3 讨论

糖尿病心肌病是一种心脏收缩和舒张功能受损的心功能障碍，是糖尿病慢性并发症之一，最终进展为心力衰竭、心律失常及心源性休克等，重症患者甚至猝死。糖尿病心肌病发病的核心因素主要为胰岛素抵抗及糖脂代谢紊乱，而氧化应激、线粒体损伤、炎症反应等是其常见的病理生理基础。在糖尿病心肌病治疗中，有效改善胰岛素抵抗、糖脂代谢以及抑制炎症能够缓解糖尿病心肌病患者的病症。然而，目前临床上主要以控制血糖、血脂及对症治疗糖尿病心肌病，且长期服用具有毒副作用。已有研究证明，DHM通过激活自噬抑制miR-34a预防糖尿病心肌病，DHM也能通过抑制氧化应激减少心肌细胞凋亡预防糖尿病心肌病。DHM改善糖尿病心肌病以及机制报道尚不完善，炎性因子HMGB1在DHM治疗糖尿病心肌病中的作用尚未见报道。本研究采用高脂高糖饮食加小剂量STZ诱导2型糖尿病大鼠心肌病模型，结果发现DHM可能通过抑制HMGB1及NF-κB p65磷酸化减少炎症反应改善糖尿病大鼠心肌病。

影像学研究显示，左心室向心性重构是糖尿病心肌病的相关特征，可能与心肌能量受损和收缩期应变降低有关。糖尿病心脏肥厚与心肌甘油三酯沉积有关。此外，胰岛素抵抗引起的高胰岛素血症也被认为直接促进心肌肥厚。一些临床前和临床研究的目的是破译糖尿病心肌病的潜在机制。在所有的辅助因素中，糖脂代谢紊乱似乎在2型糖尿病这一病理过程中起着重要的作用。我们的研究也证实，在2型糖尿病大鼠模型中，总胆固醇、甘油三酯及低密度脂蛋白及胰岛素抵抗指数均升高，大鼠心脏彩超显示射血分数、左室短轴缩短率、每搏输出量均不同程度的降低，而左心室舒张末期内径及左心室收缩期内径均升高，表示糖尿病大鼠舒张期和收缩期收缩功能降低，并伴有心肌细胞收缩减弱等心功能不全的现象，这与许多文献报道一致。二甲双胍是2型糖尿病的一线降糖药物，除了降低血糖外，研究显示其可能对T2DM患者的心血管事件风险有一定影响,文献报道它能抑制2型糖尿病小鼠的炎症、凋亡和氧化应激减轻糖尿病心肌病。与其他降糖药相比，MET可降低T2DM患者心血管事件的风险，因此本研究将其作为阳性对照药。按照文献剂量给予DHM灌胃治疗能改善糖尿病大鼠糖脂代谢紊乱及胰岛素抵抗，与MET组比较并无太大差异，而对糖尿病大鼠心功能不全的现象不同程度的减轻作用，其作用相比MET组更明显，这在以往的研究中未见报道。研究显示DHM的抗炎作用强大，能抑制NF-κB介导的炎症，我们推测DHM改善糖尿病心肌病的作用与其抗炎作用相关。

炎症反应是2型糖尿病心肌病变常见的病理生理机制。HMGB1是一种促炎因子，在多种组织中高表达，在外界刺激下能从细胞核中释放出来，促进炎症的发生和发展。有研究表明HMGB1不仅能对炎症刺激做出反应，而且能诱导巨噬细胞和中性粒细胞产生炎症介质。HMGB1 刺激巨噬细胞诱导组织坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-1α、IL-1β、IL-1ra、IL-6、IL-8、巨噬细胞炎性蛋白（MIP）1α和MIP-1β的从头合成，在心力衰竭和重塑过程中起重要作用。我们前期研究中发现，DHM 能够有效抑制HMGB1 的表达和释放；HMGB1亦能够调控NF-κB信号转导途径。结合本研究，我们猜测HMGB1可能在DHM抑制2型糖尿病心功能不全中发挥一定的作用。我们构建高脂高糖饮食加小剂量STZ诱导2型糖尿病大鼠模型，WB 检测大鼠心脏组织中HMGB1及NF-κB p65及其磷酸化蛋白的表达，ELISA检测大鼠血浆中HMGB1的含量结果发现，糖尿病大鼠能够明显增强HMGB1及磷酸化NF-κB p65的表达，增加HMGB1的释放。而DHM治疗的糖尿病大鼠HMGB1表达及释放被显著抑制，NF-κB p65磷酸化蛋白的表达的也显著下调，而阳性对照药MET对HMGB1的抑制作用并不明显。综合上述研究结果，我们认为，DHM可能通过抑制高血糖所致的HMGB1表达及释放，改善糖尿病心功能不全的现象，MET改善糖尿病大鼠心功能的作用与HMGB1的表达与释放可能无关。

（3）水资源论证企业。论证企业的水平参差不齐。受地域影响和人才流动，有些企业拥有专业技术人员的人数多、素质高，技术力量雄厚；有些企业经常在某地做论证，区域水文地质条件了解，数据更为详实，基础工作也比较全面。

在2型糖尿病心肌病中，促炎因子增加以及自主神经的病变也均可促进心脏纤维化，导致心脏结构和功能异常。有文献证明，2型糖尿病大鼠匀浆的心脏组织中胆碱乙酰转移酶(副交感神经活性的标志)明显低于对照组，说明糖尿病时心脏会发生自主神经病变，副交感神经活性下降，心率应该增快。而我们的实验在给2型糖尿病大鼠做心脏彩超时发现，模型组大鼠的心率反而降低，这与报道相悖，于是我们进一步对大鼠进行心电图观察发现，在模型组大鼠心脏心电图结果中显示有明显的房颤现象。因此，考虑糖尿病大鼠心率减慢的原因可能是随着模型组心衰时间延长，心肌纤维化会影响到心脏传导，心率会越来越慢。新近有研究提示在糖尿病动物中，发现血浆肿瘤坏死因子α和白细胞介素-1β水平升高，而在2型糖尿病代谢模型中，这些循环促炎因子是心室复极受损的原因，而心室复极受损是导致心律失常易感性较高的原因。在我们的研究中证实，糖尿病大鼠血浆中促炎因子HMGB1释放增加，心肌组织中的HMGB1及磷酸化NF-κB p65蛋白的表达上调，糖尿病心脏组织的病理图片中也显示明显的炎症浸润，提示糖尿病大鼠心律失常的原因也可能是由于HMGB1通过激活NF-κB p65促进心脏的炎症反应所导致的。给予了DHM治疗的糖尿病大鼠，心电图中房颤明显改善，心率也恢复正常，同时心肌组织中的HMGB1及磷酸化NF-κB p65蛋白的表达下调，极大程度改善了心肌组织的炎症浸润，提示DHM可能通过抑制HMGB1改善糖尿病引起的心脏传导异常。

综上所述，本研究通过构建T2DM模型探讨DHM对T2DM心功能不全的影响。结果显示DHM能够通过下调HMGB1及抑制NF-κB p65磷酸化，改善糖尿病引起的心脏舒张期和收缩期收缩功能降低及传导异常的现象，缓解T2DM心功能不全。以上研究结果初步证实了DHM在糖尿病心肌病中的治疗作用与炎症因子HMGB1有关，为后期治疗糖尿病心肌病的药物开发提供了实验依据。