高效液相色谱串联质谱法测定沧州金丝小枣中多酚类物质

刘宪军 王晓明 来创业 刘本发 王猛

摘 要：本文建立了高效液相色谱串联质谱法测定沧州金丝小枣中多酚类物质的方法。本方法线性相关系数r>0.998，检出限为2.0 mg/kg，在50.0 mg/kg、200.0 mg/kg浓度添加水平下，回收率在83.4%～99.1%，RSD值在2.87%～4.27%。该方法灵敏度高、重现性好、定性定量准确，适用沧州金丝小枣中邻苯二酚及间苯二酚的检测。

关键词：高效液相色谱串联质谱法;沧州金丝小枣;多酚

Determination of Polyphenols in Cangzhou Golden Silk Jujube by High Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry

LIU Xianjun， WANG Xiaoming， LAI Chuangye， LIU Benfa， WANG Meng*

（Cangzhou Food and Drug Inspection Institute， Cangzhou 061001， China）

Abstract： In this paper， a high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry method was established for the determination of polyphenols in Cangzhou golden silk jujube. The linear correlation coefficient of this method was r>0.998， and the detection limit was 2.0 mg/kg. At the concentration of 50.0 mg/kg and 200.0 mg/kg， the recovery rate was between 83.4% and 99.1%， and the RSD value was between 2.87% and 4.27%. The method has high sensitivity， good reproducibility， accurate qualitative and quantitative， and is suitable for the detection of catechol and resorcinol in Cangzhou golden silk jujube.

Keywords： high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry; Cangzhou golden silk jujube; polyphenols

植物多酚又被稱作植物单宁，是由复杂的酚类在植物体内经过次生代谢所产生的次生代谢产物，是存在于粮食类食品（大麦粒、高粱米、大豆等）、水果蔬菜类食品（茶叶、大葱、橘子等）或中草药植物（陈皮、石榴皮等）中的一种酚类物质，在植物体内的含量较高[1-3]。目前，食品中多酚类化合物的测定方法有多种，高锰酸钾滴定法、酒石酸亚铁分光光度法、化学发光法、原子吸收光谱法及高效液相色谱法[4-9]。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

8030 Triple Quad液相色谱-质谱联用仪，日本岛津公司;ACQUITY BEH C18液相色谱柱（2.1 mm×

50 mm，1.7 μm），美国沃特世公司;高效液相色谱仪Waterse2695（二极管阵列检测器），美国沃特世公司;电子分析天平，瑞士梅特勒公司;真空干燥箱，北京科伟永兴仪器有限公司;恒温水浴振荡器，常州国华仪器有限公司;旋转蒸发仪，德国IKA公司;超纯制水机，美国默克密理博公司;酸度计，上海仪电科学仪器股份有限公司;冷冻离心机，湖南湘智离心机仪器有限公司;甲醇、乙醇（色谱纯），美国赛默飞世尔科技有限公司;邻苯二酚标准物质（纯度均大于98%），美国默克公司;间苯三酚标准物质（纯度均大于98%），美国默克公司;其他试验检测用试剂均为分析纯，天津科密欧有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 样品前处理

将沧州金丝小枣用水清洗后，去核、切片，在真空干燥箱中真空干燥（70 ℃，95 kPa），粉碎机粉碎，过60目筛。

准确称取经粉碎后的枣粉约2.0 g（精确至1 mg）样品放于250 mL的带塞锥形瓶中，用量筒加入40%乙醇溶液40 mL，在恒温水浴振荡器中60 ℃恒温水浴振摇60 min，反复振荡浸提两次，合并两次的提取液，在60 ℃温度下水浴旋转蒸发至少于5 mL，再用10 mL水溶解残渣。冷却至室温，倒入离心管中，然后放入离心机内，在离心温度为4 ℃的条件下，10 000 r/min离心5 min，然后用针管取上清液，将上清液过0.2 μm水系微孔滤膜，得试样液，待净化。

1.2.2 聚酰胺粉净化

将1.2.1得到的试样液在聚酰胺柱上样，控制流速不超过2 mL/min，用75%乙醇溶液淋洗，收集洗脱液。洗脱液60 ℃水浴下旋转蒸发至10 mL。冷却至室温，然后于离心机上4 ℃下10 000 r/min离心

5 min，并将上清液过0.2 μm水系微孔滤膜，进行液相色谱和液相色谱-质谱法分析。

1.2.3 色谱条件

色谱柱：ACQUITY BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）;样品的进样量：5 μL;柱温箱温度设定：

30 ℃;二极管阵列检测器设置：检测波长278 nm;流动相的设定：甲醇+含0.1%甲酸的10 mmol乙酸铵水溶液（10∶90，V/V）;柱流速设定：0.3 mL/min。

1.2.4 质谱条件

离子源：电喷雾离子源;电离模式：负离子模式;干燥气流速：N2，12 L/min;锥孔电压：40 V;碰撞能量：30eV。

1.2.5 标液配制

标准储备液的配制：称取100 mg标准品，用20%

乙醇溶液定容至100 mL。标准使用液：用20%乙醇溶液稀释至1.0 mg/L、2.0 mg/L、5.0 mg/L、10.0 mg/L、50.0 mg/L、100.0 mg/L及200.0 mg/L。

2 结果与分析

2.1 沧州金丝小枣中多酚类物质聚酰胺层析条件的优化

对不同浓度甲醇淋洗液（35%、55%、70%、90%）洗脱得到的多酚提取液进行检测，检测结果分别为0.21 mg/g、1.25 mg/g、14.6 mg/g和0.79 mg/g，多酚的得率在70%甲醇淋洗条件下最高，均可达到80%以上。因此，70%甲醇为聚酰胺柱层析的最佳淋洗条件。

2.2 高效液相色谱条件的选择及优化

2.2.1 色谱柱的选择

本试验采用在样品中加标的方式来选择不同规格的液相色谱柱（苯基液相色谱柱、BEH C18液相色谱柱、C8液相色谱柱），分别做3次平行试验。结果表明，苯基液相色谱柱对2种化合物不能完全分离，C8液相色谱柱峰型不好，BEH C18液相色谱柱柱则可达到基线全部分离，分离度明显优于其他两种色谱柱（见图1、图2、图3），本研究最终选择BEH C18柱为分析柱。

2.2.2 流动相的选择

经比较，考察了流动相中甲醇浓度（5%、10%）对提取物中多酚类物质的保留值和分离度的影响。由图4、图5可知，流动相在10%的甲醇浓度的条件下，使保留时间较短，峰形更尖锐对称，分离较好。

2.2.3 进样量的选择

本试验分别对仪器（1 μL、2 μL、3 μL、4 μL及5 μL）不同的进样体积进行了考察。试验的结果显示随着仪器的进样体积的增加，检出限会降低，响应值也会相应的增加，但是过大的进样体积也会对色谱柱有影响，有可能会超过色谱柱的柱容量，特别是会加快色谱柱的老化报废，综合以上原因选择

2 μL的进样体积，满足检出限要求的同时也能有效地保护色谱柱。

2.2.4 柱温的比较优化

在相同的试验条件下，对不同的柱温（20 ℃、30 ℃、40 ℃及50 ℃）进行考察。结果发现不同柱温箱温度（20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃）各种条件下能满足峰分离，本着节能环保的理念，选择较常温相近的温度30 ℃作为柱温箱温度。

2.2.5 质谱条件的优化

配制浓度为1.0 μg/mL的邻二苯酚、间苯三酚的标准溶液，进行母离子扫描，确定电离方式和分子离子峰，在分别获得分子离子峰后，自动优化锥孔电压。经试验在负离子模式下邻苯二酚母离子为m/z109，[C6H6O2-H]-丰度最高，间苯三酚扫描的母离子为m/z125，[C6H6O3-H-H2O]-丰度最高，具体内容如表1所示。

2.2.6 回归方程及检出限

用标准储备液配制邻苯二酚、间苯三酚浓度分别为1.0 mg/L、5.0 mg/L、10.0 mg/L、20.0 mg/L、50.0 mg/L、100.0 mg/L及200.0 mg/L的标准溶液，在已确定的色谱条件下进行测定，峰面积（Y）对浓度（X）进行线性回归，由表2可知，在1.0～200.0 mg/L的浓度范围内有良好的线性关系，相关系数r也均大于0.998，以3倍信噪比（S/N）计算方法的检出限为2.0 mg/kg。

2.2.7 方法的回收率和精密度

通过向样品加标的方式做回收率和精密度试验，分别向样品中添加浓度50.0 mg/kg和200.0 mg/kg两个浓度的标准溶液后，按上述的方法进行前处理和上机测定，进行7次平行试验。在表3中可见，加标回收率在83.4%～99.1%，RSD在2.87%～4.27%，说明选定的方法满足检测要求。

3 结论

采用聚酰胺层析柱净化，经C18柱分离后，在278 nm下对邻苯二酚及间苯三酚进行测定，同时串联质谱进行确证。方法线性相关系数r>0.998，检出限为2.0 mg/kg，在50.0 mg/kg、200.0 mg/kg浓度添加水平下，回收率在83.4%～99.1%，RSD在2.87%～4.27%。该方法灵敏度高、重现性好、定性定量准确，适用沧州金丝小枣中邻苯二酚及间苯二酚的液相色谱法定量，质谱法辅助定性。

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