RP-HPLC法同时测定武都花椒中3种山椒素

马君义，周慧霞，刘 潮，黄 榕，冯 珮

(1.西北师范大学 生命科学学院，甘肃 兰州 730070;2.甘肃特色植物有效成分制品工程技术研究中心，甘肃 兰州 730070)

药食兼用的花椒系芸香科(Rutaceae)花椒属(Zanthoxylum)植物花椒(ZbungeanumMaxim)或青椒(Z.schinifoliunSieb.et Zucc)的花椒[1]的干燥成熟果皮.花椒主要分布于陕西、甘肃、山东、四川等地，其含有挥发油、生物碱、山椒素等多种对人体有益的活性成分[2-5]，是我国的“八大调味品”之一.其中麻味的强弱很大程度上决定了花椒的品质，麻味的强弱与花椒中以山椒素为代表的酰胺类化合物的含量和构成有一定的联系，羟基-α-山椒素、羟基-β-山椒素和羟基-γ-山椒素是最主要的麻味成分[6-7].近年来,测定花椒麻味成分含量的方法众多，主要有紫外-可见分光光度法[8]、甲醛滴定法[9]、薄层层析法[10]、高效液相色谱法(HPLC)[11-12]等，其中前两种测定方法虽然操作简单，成本低廉，但准确度较低，误差较大.薄层层析法具有检测速度快、操作简单等优点，但检测结果存在重复性差、准确度低等局限，而高效液相色谱(HPLC)法测定花椒麻味成分的含量结果准确可靠[13].

甘肃武都是我国花椒最佳适生区之一.在2000年，武都区被国家林业局命名为“中国名特优经济林花椒之乡”；2015年，武都花椒被农业农村部登记为“农产品地理标志”，并获得了“甘肃省著名商标”；2020年，武都区因花椒被农业农村部认定为第三批“中国特色农产品优势区”.“大红袍”是武都花椒的主要品种，其粒大饱满、香味浓郁、麻味醇厚、药效成分多、精油含量高[14-15].但武都花椒作为优质产区花椒，与其他产地花椒相比，酰胺类物质及主要麻味物质特征尚不明确，为凸显武都花椒的“特别特”、“好中优”，打造“甘味”知名农产品品牌，文中建立反相高效液相色谱(RP-HPLC)法同时测定武都花椒中3种山椒素含量,这对促进我国名优特产武都花椒的质量评价、产业发展和丰富武都花椒品质基础数据等方面具有参考意义.

1 材料

1.1 材料与试剂

花椒供试品12批，来源于甘肃省陇南市武都区的6个乡镇12个村，所有检测样品均为2020年新品.

羟基-α-山椒素(批号PRF10092902， 纯度99.13%)、羟基-β-山椒素(批号PRF10031222， 纯度99.36%)、羟基-γ-山椒素标准品(批号PRF10031226， 纯度98.94%)，成都普瑞法科技开发有限公司；正己烷、甲醇均为色谱纯，山东禹王和天下新材料有限公司；磷酸，国药集团化学试剂有限公司.

1.2 仪器与设备

IKA/A11basic研磨机，德国IKA公司；UltiMate 3000高效液相色谱仪，美国Thermo Scientific Inc；Silversil-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，美国Dikma Technologies Inc；JRA-6磁力搅拌水浴锅，金坛市杰瑞尔电器有限公司；电热鼓风干燥箱，上海-恒科学仪器有限公司.

2 试验方法

2.1 供试品溶液的制备

采用有机溶剂浸提法制备样液，参照地标[16]和文献[17]，并稍有改动.将50 ℃下干燥至恒重的花椒果皮粉碎成粉末，精密称取约1 g(精确至0.0001 g)于250 mL具塞锥形瓶中，加入30 mL正己烷，封口，50 ℃水浴振荡提取3 h，0.45 μm有机相微孔滤膜抽滤，得滤渣.向滤渣中加入50 mL甲醇，50 ℃水浴振荡提取3 h，0.45 μm有机相微孔滤膜抽滤，滤渣再用30 mL甲醇重复提取3 h，抽滤，合并滤液并定容至100 mL容量瓶中.滤液经0.22 μm有机相滤头过滤并适当稀释后冷藏，取滤液待测，每个样品设3组平行.

2.2 标准品溶液的制备

分别精密称取一定量的3种山椒素标准品，用甲醇溶解配制成质量浓度均为10 mg·mL-1的标准品储备液，将储备液置于-18 ℃冰箱中保存备用.

精密吸取上述3种标准品储备液适量，置于同一容量瓶中，用甲醇稀释，制成质量浓度为150 μg·mL-1的3种山椒素的混合标准储备液.

精密吸取混合标准储备液适量，置于容量瓶中，用甲醇逐级稀释为150,100,75,50,25,12.5,6.25,3.125,1.56和0.78 μg·mL-1的3种山椒素系列混合标准溶液.

2.3 色谱分析条件

流动相：甲醇-0.1%磷酸溶液-乙腈(68∶30∶2，V/V/V)，等度洗脱30 min；检测波长：270 nm；流速：1 mL·min-1；柱温：30 ℃；进样量：20 μL.

2.4 供试品含量的测定

取20 μL花椒供试品制备液，采用高效液相色谱仪，按2.3条件依次进样，测定供试品溶液中3种山椒素的峰面积，每样平行测定3次，利用线性回归方程分别计算各样品中3种山椒素含量.

3 结果与分析

3.1 RP-HPLC分析条件的选择

HPLC测定山椒素的流动相体系主要为乙腈-水、甲醇-水[18-19]，反相梯度洗脱或等度洗脱.本试验采用甲醇-0.1%磷酸溶液(70∶30，V/V)等度洗脱时，3种山椒素能够实现很好的分离，分析时间与梯度洗脱相差不大，但羟基-α-山椒素色谱峰稍有拖尾，在流动相体系中添加2%的乙腈，拖尾现象可得到有效改善.故本试验采用甲醇-0.1%磷酸溶液-乙腈(68∶30∶2，V/V/V)作为流动相，保留时间为30 min进行等度洗脱，既能达到良好的分离度，又能实现目标物在30 min内出峰.羟基-α-山椒素、羟基-β-山椒素和羟基-γ-山椒素的最大吸收波长分别为268,268和270 nm，考虑到此批花椒样品中羟基-γ-山椒素含量最低，故选择270 nm为试验的检测波长.同时，在此波长下样品中其他组分不干扰测定.优化后的色谱条件下对标准品和供试品进行测定，结果见图1，其中混合标准品(A)中羟基-α-山椒素与羟基-β-山椒素的分离度达到1.57，供试品(B)中羟基-α-山椒素与羟基-β-山椒素的分离度为1.54，均符合《中国药典》分离度R大于1.5的规定.图1中的a峰根据相关文献报告,可能是羟基-ε-山椒素[20]，本研究中未将其列为检测对象.

图1 混合标准品(A)和供试品(B)的色谱图

3.2 标准曲线线性关系的考察

分别取各对照品混合溶液20 μL按2.3色谱条件进样分析，以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标作图，结果见图2.

图2 3种山椒素的标准曲线

进行线性拟合，得到3种山椒素的回归方程(表1).结果表明，3种山椒素在各自的浓度范围内线性关系良好.

表1 回归方程和线性范围(n=10)

3.3 方法学评价

3.3.1 精密度 取混合标准品溶液(含羟基-α-山椒素质量50 μg·mL-1、羟基-β-山椒素质量3.125 μg·mL-1、羟基-γ-山椒素质量0.78 μg·mL-1，按2.3条件连续进样6次，计算3种山椒素峰面积的相对标准偏差(RSD值，表2).结果表明，羟基-α-山椒素、羟基-β-山椒素和羟基-γ-山椒素峰面积的RSD值分别为0.62%，1.01%和0.74%，说明仪器精密度良好.

表2 精密度结果(n=6)

3.3.2 重复性 称取供试品(S3)1 g(精确至0.0001 g)，平行6份，按照2.1的制备方法制备检测溶液，再按2.3条件分别进样分析，计算S3样品中3种山椒素的含量和RSD值.重复性结果见表3.可以看出，S3样品中羟基-α-山椒素、羟基-β-山椒素和羟基-γ-山椒素含量的RSD值分别为3.69%, 3.90%和2.83%，表明该方法重复性良好.

表3 重复性结果(n=6)

3.3.3 稳定性 称取供试品(S3)1 g(精确至0.0001 g)，按照2.1的方法制备检测溶液，再按2.3的条件分别于0,2,4,6,8,10和12 h进样分析，记录S3样品中3种山椒素的峰面积和RSD值.稳定性结果见表4，由表4可知，在12 h内S3样品中羟基-α-山椒素峰、羟基-β-山椒素和羟基-γ-山椒素峰面积的RSD值分别为4.88%,4.73%和4.82%，表明供试品的稳定性良好，对进样时间无特殊要求.

表4 稳定性结果(峰面积)

3.3.4 加标回收率 精密吸取1 mL已知含量(表5)的花椒提取物溶液3份于Eppendorf管中，分别加入混合标准品溶液(含羟基-α-山椒素82.35 μg、羟基-β-山椒素6.38 μg和羟基-γ-山椒素1.90 μg)1 mL，混匀，按2.3项下色谱条件分别进样分析，每个样品平行进样3次，计算S3样品中3种山椒素的加标回收率和RSD值.结果见表5.由表5可知，羟基-α-山椒素的加标回收率为104.86%、RSD值为3.32%，羟基-β-山椒素的加标回收率为91.43%、RSD值为3.60%，羟基-γ-山椒素的加标回收率为93.58%、RSD值为3.66%，表明该方法准确性良好.

表5 加标回收率结果

3.3.5 检测限和定量限 精密吸取混合标准品溶液，用甲醇逐级稀释定容成一系列的溶液.以信噪比为3∶1时的质量浓度作为检出限，信噪比为10∶1时的质量作为定量限.由表6可知，羟基-α-山椒素、羟基-β-山椒素和羟基-γ-山椒素的检测限分别为0.059,0.092和0.037 μg·mL-1，按进样量为20 μL换算，其定量限分别为3.91,6.16和2.45 ng.

表6 检测限和定量限

3.4 供试品山椒素的含量

甘肃武都6个乡镇12个村的12批次地标产品“大红袍”系列武都花椒中3种山椒素的含量见表7.由表7可知，12批次的武都花椒样品中羟基-α-山椒素含量为(71.75±2.70)～(191.65±2.35) mg·g-1，羟基-β-山椒素含量为(8.32±0.33)～(22.93±0.71) mg·g-1，羟基-γ-山椒素含量为(2.45±0.04)～(4.05±0.10)mg·g-1，其RSD值分别为1.23%～3.99%,3.11%～4.98%和0.94%～3.54%.3种山椒素的均值高达143.51 mg·g-1，且羟基-α-山椒素的含量远高于羟基-β-山椒素和羟基-γ-山椒素的含量.且不同产地的花椒山椒素含量存在差异，这可能与花椒种植地环境条件和气候因素有关.有研究表明，花椒的品质和产量受产地温度、平均相对湿度、年日照时数、降雨量、降雨坡度方向、海拔和管理方式等因素有关[21-22]

表7 武都花椒中3种山椒素的含量

4 结论

建立了测定花椒中3种山椒素含量的RP-HPLC的方法，该方法稳定性好、精密度高、重复性好.用此方法测定麻味物质含量的结果显示12个花椒样品均含有羟基-α-山椒素、羟基-β-山椒素和羟基-γ-山椒素，且均以羟基-α-山椒素的含量为最高，其中，羟基-α-山椒素含量为(71.75±2.70)～(191.65±2.35) mg·g-1，羟基-β-山椒素含量为(8.32±0.33)～(22.93±0.71) mg·g-1，羟基-γ-山椒素含量为(2.45±0.04)～(4.05±0.10) mg·g-1.

从花椒种植地域分布来看，在所考察的乡镇中，汉林镇、桔柑镇、蒲池乡、郭河乡、马街镇和安化镇均适于花椒的种植，尤其是蒲池乡下坝村，其花椒中3种山椒素总量高达(217.90±2.35) mg·g-1，其次是郭河乡候家湾村(171.73±5.0) mg·g-1、郭河乡符家山村(163.47±4.85) mg·g-1、安化镇曾街村(158.81±3.37) mg·g-1.

本研究利用RP-HPLC对武都花椒麻味物质中的3种山椒素进行定量分析，完善了“甘味”知名农产品武都花椒的基础数据，可为武都花椒质量评价和质量标准的制定提供参考，对促进武都地方经济发展和乡村振兴具有重要意义.