HS-SPME-GC-MS联用及电子鼻分析不同提取方法油莎豆油香气特征

辛明航，曹 旭，滕 旭，包陈力根，刘婷婷,，王大为,

（1.吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林 长春 130118；2.吉林省粮食精深加工与高效利用工程研究中心，吉林 长春 130118；3.吉林省粮食精深加工与副产物高效利用技术创新重点实验室，吉林 长春 130118；4.农业农村部食用菌加工技术集成科研基地，吉林 长春 130118）

油莎豆是一种单子叶禾本科开花植物，在根茎的末端产生可食球形块茎[1]，因其气味与杏仁相似，又称地下杏仁，油脂含量在20%～30%之间[2]。在非洲和地中海的一些地区，油莎豆油早已成为日常消费的食用油，其脂肪酸组成丰富，含量最多的是油酸，但多不饱和脂肪酸（亚油酸和亚麻酸）含量相对较低[3-4]。此外，油莎豆油中还含有多种微量营养物质，其香气独特且浓郁，无不愉快气味，适合日常生活食用[5-6]。

植物油的香气在影响消费者选择上具有重要作用，挥发性化合物是其产生独特香气特征的基础物质[7]。植物油中挥发性化合物的种类很多，受多种因素影响，如油料的品种产地、成熟程度、储藏条件及提取方法的差异等[8-9]，而提取方法是影响其变化的重要因素。它们决定了挥发性化合物的组成及含量，进而影响油脂的香气特征[10]。

提取方法对植物油挥发性化合物的构成有一定影响，国内外已有一定研究，Dun Qian等[11]采用顶空-固相微萃取（headspace-solid phase microextraction，HS-SPME）联合气相色谱-质谱-嗅觉（gas chromatographymass spectrometry-olfactometry，GC-MS-O）测定研究了热榨和冷榨花生油挥发性物质的区别，发现热榨花生油的挥发性物质种类明显高于冷榨花生油，且花生经焙烤后产生了特有的吡嗪类物质。彭常梅等[12]采用HS-SPMEGC-MS联用对5 种方法提取的牡丹籽油挥发性成分进行分析比较，得出不同提取工艺对其挥发性成分有较大影响，且α-甲基肉桂醛、己醛及棕榈酸乙酯等是共有的挥发性化合物。周靖等[13]研究了不同制油工艺对番茄籽油品质的影响，研究得出压榨工艺会增加油脂氧化程度，产生醛、酮、酸等挥发性化合物。

油莎豆油研究多集中在提取工艺优化上，对不同提取方法油莎豆油挥发性物质的比较分析、根据挥发性物质构成区分不同方法及确定不同提取方法油莎豆油香气特征的研究鲜见报道。因此，本研究采用超临界CO2萃取法、压榨法、浸出法、水酶法提取油莎豆油，运用HSSPME-GC-MS对不同样品的挥发性化合物进行检测，结合电子鼻分析及相对气味活度值（relative odor activity value，ROAV），对不同提取方法油莎豆油的进行区分鉴定以及关键风味化合物进行确定，以期为油莎豆油挥发性成分研究提供参考，为油莎豆油品质控制及提取方法的鉴定提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

油莎豆由长春市万龙油莎豆公司提供，产地为吉林省长岭县；油莎豆经清洗除杂，40 ℃烘箱烘干，粉碎过60 目筛后使用；二氧化碳（纯度99.9%） 长春氧气厂；Cellulase 1.5L纤维素酶、Alcalase 2.4L碱性蛋白酶丹麦诺维信有限公司；其他试剂为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

ZYJ90型榨油机 江门市贝尔斯顿电器有限公司；HA121-50-02超临界萃取装置 南通华安超临界萃取有限公司；TSQ9000 GC-MS联用仪、TG-5 MS毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.20 μm） 赛默飞世尔科技（中国）有限公司；65 μm聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯（polydimethylsiloxane/divinylbenzene，PDMS/DVB）萃取头、SPME手柄 美国Supelco公司；HWS12型恒温水浴锅 上海一恒仪器有限公司；RE-3000旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；PNE3型电子鼻 德国Airsense公司。

1.3 方法

1.3.1 油莎豆油的制备

1.3.1.1 超临界CO2萃取法

参照文献[14]的方法，稍作修改。适量油莎豆粉装入超临界萃取装置的料缸中，设置参数：萃取压力25 MPa、萃取温度45 ℃、萃取时间3 h，萃取结束后分离釜接取油莎豆油，收集经8 000 r/min离心10 min的上层清油，置于棕色瓶中4 ℃保存。

1.3.1.2 压榨法

采用螺旋榨油机对烘干的整粒油莎豆直接进行压榨，得到油莎豆油经8 000 r/min离心10 min，将上层清油置于棕色瓶中4 ℃保存。

1.3.1.3 浸出法

参照文献[15]方法，稍作修改。称取适量油莎豆粉用无脂滤纸包裹，以石油醚为溶剂，40 ℃索氏抽提4 h，使用旋转蒸发仪在40 ℃除去石油醚，将油莎豆油置于棕色瓶中4 ℃保存。

1.3.1.4 水酶法

参照文献[16]的方法，稍作修改。称取一定量油莎豆粉，加入蒸馏水（料液比1∶7（g/mL）），调节pH 4.8，按1 200 U/g 添加纤维素酶，温度50 ℃，酶解3 h，再调节pH 9.0，按2 400 U/g添加碱性蛋白酶，酶解3 h，然后在95 ℃条件下灭酶15 min，冷却至室温后离心，将油脂置于棕色瓶中4 ℃保存。

1.3.2 HS-SPME操作条件

参照文献[17]，稍作修改。称2.00 g油莎豆油于8 mL顶空玻璃瓶中，立即进行密封，在50 ℃恒温平衡30 min。插入完成老化的65 μm PDMS/DVB萃取头，推出含涂层纤维头，萃取30 min，待萃取完毕后迅速插到GC进样口，缓慢推出纤维头，250 ℃解吸4 min，每个样品做3 次重复。

1.3.3 GC-MS分析条件

GC条件：TG-5 MS毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.20 μm）；升温程序：40 ℃保持4 min；以4 ℃/min升至85 ℃，保持2 min；以2 ℃/min升至110 ℃，保持15 min；以10 ℃/min升至280 ℃，保持3 min；载气为高纯度氦气，流速1.2 mL/min，分流比5∶1，进样口温度250 ℃。

MS条件：电子电离源；电子能量70 eV；传输管线温度280 ℃；离子源温度280 ℃；溶剂延时1 min；质量扫描范围m/z40～550。

挥发性化合物的定性或定量：对总离子流图中的各峰通过NIST及WILEY谱库进行鉴定，保留正反匹配度大于800的结果；采用峰面积归一化法对定性的物质进行定量分析[18]。

1.3.4 电子鼻分析

参照文献[19]方法，稍作修改。取2.00 g油莎豆油于20 mL顶空瓶中，置于室温平衡气体30 min，使用电子鼻电子探头测定挥发物质。测定条件：样品间隔时间1 s，清洗时间80 s，归零时间10 s，内部流量400 mL/min，进样流量100 mL/min，测量时间60 s，选取56～58 s响应值数据进行分析，每个样品重复3 次。电子鼻传感器见表1。

1.3.5 关键风味化合物确定

挥发性化合物的感觉阈值和相对含量共同决定其在气味中的作用强度，参考文献[20]计算ROAV，根据ROAV确定挥发性化合物对油莎豆油样品的贡献，以确定关键风味化合物。定义对油莎豆油样品风味贡献度最大组分ROAVstan为100，其他组分ROAV按下式计算：

式中：CA、TA为该组分的相对含量/%、感觉阈值/（μg/kg）；Cstan、Tstan为对样品风味贡献最大组分的相对含量/%、感觉阈值/（μg/kg）。

1.4 数据处理

原始数据采用Excel 2016整理，雷达图、主成分分析（principal component analysis，PCA）采用SPSS 22.0及Origin 2018进行分析作图。

2 结果与分析

2.1 油莎豆油的挥发性化合物组成分析

挥发性成分对选择植物油具有先导性作用，对植物油的风味尤为重要[21]。以相同地理环境、品种、生长期的油莎豆为原料，对不同提取方法油莎豆油挥发性化合物的组成及相对含量进行分析，除去萃取头及色谱柱流失峰，总共对101 种挥发性化合物进行鉴定，包括醛类12 种、醇类10 种、酮类5 种、烷烃类15 种、烯烃类6 种、酯类26 种、酚类8 种、醚类2 种、杂环类12 种、其他5 种。挥发性化合物的总数分别为超临界法34 种，压榨法51 种，浸出法59 种，水酶法70 种，4 种方法的共有成分22 种（表2）。Lasekan[17]采用超临界法提取经焙烤后油莎豆的油脂，并对其挥发性成分进行分析，共鉴定出75 种挥发性化合物，显著高于本实验超临界法萃取的油莎豆油，略高于水酶法的油莎豆油，分析可能是实验材料经过焙烤产生了更多的挥发性物质。

表2 不同提取方法油莎豆油挥发性化合物的组成及相对含量Table 2 Composition and relative content of volatile compounds in C.esculentus oils obtained by different methods

续表2

续表2

从图1可以看出，4 个油莎豆油样品挥发性化合物中，酯类物质数量明显多于其他物质，其中水酶法数量最多（25 种），与其他方法相差不大；浸出法样品的烷烃类化合物相对含量最大（31.07%），另外3 种方法相差不大，在5.39%～9.32%之间；醛类与杂环类物质种类均为12 种，但醛类物质的占比远高于杂环类物质，且超临界法未检出杂环类物质；醇类、酮类、酚类及烯烃类物质相对含量较低、种类个数相对较少，但每种方法均有测出。上述可以表明，不同提取方法对油莎豆油挥发性物质种类及相对含量均存在影响。

图1 不同提取方法油莎豆油挥发性化合物种类数量（A）及相对含量（B）Fig.1 Number (A) and relative content (B) of volatile compounds in C.esculentus oils obtained by different methods

在植物油挥发性风味中醛类化合物普遍存在，主要由不饱和脂肪酸的氧化反应产生，多数醛类化合物有较好风味，对植物油风味起着积极贡献[22]。壬醛一般为油酸、亚油酸的氧化分解产物，苯甲醛一般被认为是苯丙氨酸的降解产物，为油莎豆油提供油脂、柑橘、杏仁及焦糖香气[23]，在超临界法及压榨法油莎豆油检测出的含量相对较高；徐星[24]对多种食用植物油的挥发性成分进行检测，在除亚麻籽油外的样品中均检测出壬醛及苯甲醛；α-(2-甲基亚丙基)苯乙醛为芳香醛类，产生于美拉德反应，由相应的醇醛缩合生成，具有可可、花香、蜜甜香气等[25-26]；超临界法油莎豆油中香兰素相对含量最高为6.77%，只有压榨法油莎豆油中未检测出此物质，Lasekan[17]的研究得出香兰素是油莎豆油特征香气成分之一。

醇类化合物是生成长链酯类化合物的重要前体物质，大部分醇类化合物的阈值相对较高[27-28]，对油莎豆油香气贡献较低。4 个样品中均检测出柏木脑，其阈值较低，为油莎豆油贡献木香。烷烃类化合物的香气阈值普遍较高，对植物油整体香气贡献度不大[29]；浸出法油莎豆油中检测出的戊烷相对含量较高（25.41%），作为石油醚的主要构成成分，这可能是由于浸出法提取油脂最终石油醚未除净的原因；4 个样品中检测出主要的烯烃类物质为α-蒎烯及D-柠檬烯，且这2 种化合物香气阈值较低，对油莎豆油贡献松木香、针叶香及柠檬香。

植物油中酯类化合物最主要的来源是由脂肪酸降解产生的醇与游离脂肪酸反应产生，主要贡献甜香味[30]。其中，邻苯二甲酸酯及柠檬酸三乙酯常用作塑料增塑剂，这可能来源于油莎豆油制备或检测过程中的污染；水酶法油莎豆油中酯类化合物种类（25 种）及相对含量（45.66%）明显高于其他方法，这可能是在水存在的环境中能够使油莎豆油产生更多游离脂肪酸，加速酯化反应，彭常梅等[12]的研究也表明水酶法提取植物油可能会催化产生更多的酯类化合物。

杂环类化合物大部分香气阈值较低，主要是由美拉德反应产生[11,31]。浸出法油莎豆油中发现杂环类化合物种类最多，且绝大多数是美拉德反应产物，其中2,5-二甲基-3-(3-甲基丁基)吡嗪相对含量最高，具有坚果、木香味；在浸出法核桃油及亚麻籽油中也检测出较多的杂环类化合物[10,32]。压榨法油莎豆油中仅检测出一种杂环类化合物，杂环类化合物产生较少可能是压榨前未进行炒籽处理或氨基酸和糖类化合物比例不恰当造成[33]。超临界萃取法油莎豆油中并未检测到杂环类化合物，这可能是因为超临法提取油莎豆油的环境条件不适合发生相关美拉德反应，例如物料水分较低，且环境密封无空气流通[34]。

综上分析可知，油莎豆油呈现的风味并非某一种化合物贡献，而是众多挥发性化合物作用于人的嗅觉器官产生，不同样品间的挥发性化合物种类和相对含量差距较大，可以根据其变化对不同提取方法油莎豆油进行鉴别。

2.2 油莎豆油挥发性化合物的PCA

为进一步分析不同提取方法油莎豆油挥发性化合物的差异，对油莎豆油挥发性化合物进行PCA[35]。如图2A所示，PC1和PC2的贡献率分别为45.2%和38.0%，累计贡献率为83.2%，这说明PC1及PC2可以较好反映大部分样品信息。4 个油莎豆油样品的整体区分度较好，水酶法和浸出法的样品分别处于第4、2象限，前者对PC1有正响应值，后者对PC2有正响应值，二者存在明显区别；超临界法和压榨法的样品共同处于第3象限，对PC1、PC2均为负响应值，二者距离较近，说明这2 个样品存在一定相似性，而在图2B中，3 个PC的累计贡献率为97.8%，能够反映样品信息，二者具有明显的区分度。

图2 不同提取方法油莎豆油挥发性化合物PCA二维图（A）和三维图（B）Fig.2 2D (A) and 3D graphs (B) of PCA of volatile compounds in C.esculentus oils obtained by different methods

2.3 油莎豆油的电子鼻分析

图3A结合表1可以得出，不同提取方法油莎豆油在传感器W2W、W2S、W1W及W1S上的响应值较大且差异明显，而在其余6 个传感器上响应值几乎重叠，说明其对芳香成分、有机硫化物、硫化物、醇类、醛酮类及甲基类灵敏。4 种方法样品在W1S上响应最为敏感且差异最明显，其次为W2S、W1W、W2W；超临界法和压榨法油莎豆油在W2S上，比其他2 种方法具有更高的响应值，结合表2发现其可能的原因是这2 种方法样品中醛类、酮类及醇类挥发性化合物总含量较高。

图3 不同提取方法油莎豆油电子鼻雷达图（A）及PCA二维图（B）Fig.3 Electronic nose radar diagram (A) and 2D graph of PCA (B) of C.esculentus oils obtained by different methods

由图3B可知，PC1、PC2的贡献率分别为80.4%、12.6%，累计贡献率为93.0%，能够反映品绝大部分信息。4 种方法油莎豆油样品区分度较好，组内重复性良好，说明不同油莎豆油样品的气味存在较大区别，电子鼻能够对4 种提取方法油莎豆油进行鉴别。超临界法及压榨法油莎豆油样品组间距离相对较近，说明这2 种样品区别较小，具有一定相似性，从图3A也可以看出，这2 种方法在各传感器的响应值接近，且在挥发性化合物PCA结果中二者组间距离也较近，结果具有一致性。

2.4 油莎豆油关键风味化合物分析

ROAV法是评价风味化合物对整体风味贡献度的一种方法。一般根据ROAV的大小将风味化合物进行分类，ROAV不小于1的组分为样品的关键风味化合物，0.1≤ROAV＜1的组分对样品的总体风味具有重要的修饰作用。

表3仅列出ROAV大于0.1的挥发性化合物，其中4 种方法油莎豆油样品中壬醛的ROAVstan均被定义为100。超临界法样品关键风味化合物的贡献度依次为壬醛＞柏木脑＞十二醛＞4-乙烯基-2-甲氧基苯酚＞D-柠檬烯＞香兰素＞α-蒎烯；压榨法样品关键风味化合物的贡献度依次为壬醛＞十二醛＞4-乙烯基-2-甲氧基苯酚＞柏木脑＞D-柠檬烯＞α-蒎烯＞正己醛；浸出法样品关键风味化合物的贡献度依次为壬醛＞2-乙基-3,6-二甲基吡嗪＞柏木脑＞2-十一酮＞香兰素＞D-柠檬烯＞壬醇＞椰子醛；水酶法样品关键风味化合物的贡献度依次为壬醛＞柏木脑＞4-乙烯基-2-甲氧基苯酚＞十二醛＞香兰素＞丙位十二内酯＞D-柠檬烯＞2-戊基呋喃；其他挥发性化合物对样品有重要的修饰作用。4 种方法油莎豆油样品中的关键风味化合物共有成分为壬醛、柏木脑及D-柠檬烯，张丽涵[37]对亚麻籽油中挥发性化合物进行分析，发现壬醛及D-柠檬烯等对亚麻籽油的呈香有较大贡献。

表3 不同提取方法油莎豆油挥发性化合物的ROAVTable 3 ROAV of volatile compounds in C.esculentus oils obtained by different methods

3 结论

通过HS-SPME-GC-MS联用及电子鼻对不同提取方法油莎豆油挥发性化合物进行分析，利用ROAV法对不同提取方法油莎豆油的关键风味化合物进行确定。结果表明，4 个油莎豆油样品中共鉴定出101 种挥发性化合物，共有成分为22 种。不同提取方法油莎豆油挥发性化合物的组成及相对含量差距较大，超临界法及压榨法样品中醛类化合物含量最大，浸出法样品中烷烃类化合物含量最大，水酶法样品中酯类化合物含量最大，且可以利用PCA将不同提取方法油莎豆油进行区分；且电子鼻与HSSPME-GC-MS分析结果有良好的一致性；4 个油莎豆油样品的关键风味化合物数量之间无较大差别，壬醛、柏木脑及D-柠檬烯为共有的关键风味化合物。