蒙古黄芪根腐病病原鉴定及防治药剂室内筛选

马桂花，段晓明,2，徐文华，周渊涛，马海霞，马伟丽，祁鹤兴*

(1. 青海大学农牧学院，青海 西宁 810016； 2. 青海正德农牧开发有限公司，青海 西宁 810016；3. 中国科学院西北高原生物研究所，青海 西宁 810016)

黄芪为豆科黄芪属植物蒙古黄芪(Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge. var.mongholicus(Bge.)Hsiao)或膜荚黄芪(A.membranceus(Fisch.)Bge)的干燥根[1-2]，具有提高免疫力、保护肝脏、滋养补益、利尿消肿、抗糖尿病等多种药用价值，是中医药学公认的道地大宗药材和保健品原料[3-4]。野生黄芪产于我国东北、华北和西北等地。人工栽培黄芪主产于内蒙古、山西、甘肃、四川、陕西、黑龙江、宁夏等地[5]。近年来随着市场需求量的持续增加，黄芪种植面积不断扩大，根腐病作为一种毁灭性土传病害，在黄芪种植中发生逐年加重，严重影响其产量和品质[6]。

黄芪根腐病发生时主根最先受害，然后向侧根蔓延。植株长势弱小，叶色枯黄，严重时脱落；地下部分根表面出现病斑且表皮粗糙，维管束变褐，根系后期发黑溃烂，植株易被拔起[7]。已有研究表明，黄芪根腐病致病菌主要是镰刀菌属Fusarium真菌，该属真菌寄生或腐生生活，分布广泛，可侵染多种植物，引起根腐、茎基腐等多种病害[8]。引起黄芪根腐病的镰刀菌主要有腐皮镰刀菌(F.solani)[9]，尖孢镰刀菌(F.oxysporum)[10]，锐顶镰刀菌(F.acuminatum)[11]，芬芳镰刀菌(F.redolens)[12]，串珠镰刀菌(F.moniliforme)[13]和木贼镰刀菌(F.equisetim)[14]等。

国内外对黄芪根腐病的防治主要采用化学防治，其中高效低毒杀菌剂是化学防治的首选药剂，如多菌灵、苯醚甲环唑和甲基硫菌灵等[15-17]。生物防治方面，在我国已登记的生物农药中尚没有针对黄芪根腐病的生防药剂。在已报道的拮抗菌生物防治黄芪根腐病的研究中，主要处于对土壤微生物[18]和植物内生生防菌株[19]的室内筛选和盆栽试验阶段，效果较好的微生物包括枯草芽孢杆菌和哈茨木霉等，缺乏大规模田间应用的微生物药剂产品。

2021年，青海省中藏药种植面积为22.25万hm2，是西部地区重要的中药材种植区。蒙古黄芪是青海省中药材发展的特色产业之一，民和县、乐都县、互助县和湟中县等地都有大量的蒙古黄芪种植，但是目前尚未见对青海省蒙古黄芪根腐病的研究报道。根腐病的发生不仅影响黄芪品质，还严重影响产量和经济。因此，对黄芪根腐病病原菌进行鉴定及筛选防治药剂对于后续开展大田防治是重要的前期工作之一。

青海省民和县位于青海省东部，其东部和南部与甘肃省毗连，气候条件适合黄芪生长。但是根腐病的发生影响当地黄芪的品质和产量。本研究从青海省海东市民和县马营镇洒达庄村采集蒙古黄芪根腐病病样进行病原菌的分离、鉴定和室内药剂防治效果测定，在明确病原菌种类的前提下，筛选出能有效抑制病原菌生长的高效低毒杀菌剂，旨在为后续开展大田防治提供理论依据和基础。

1 材料与方法

1.1 材料来源

2020年6月从青海省海东市民和县马营镇洒达庄村(102°83′00.00″ E，36°31′93.00″ N,海拔2 391 m)采集具有根腐病症状的蒙古黄芪3份，及时带回实验室分离病原菌。

1.2 培养基配制

马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)配制参照祁鹤兴等[20]的方法。2%水琼脂培养基(2%WA)：琼脂 20 g加入蒸馏水并定容至1 L，121℃高压蒸汽灭菌20 min，备用。

1.3 供试杀菌剂

50%多菌灵可湿性粉剂(WP)，购自四川润尔科技有限公司。特点：广谱内吸性杀菌剂，具有保护和治疗作用。作用方式：干扰病原菌有丝分裂中纺锤体的形成，影响细胞分裂。

25%溴菌腈可湿性粉剂(WP)，购自江苏托球农化股份有限公司。特点：广谱、高效；具有保护、内吸治疗和铲除功能。作用方式：能够迅速被菌体细胞吸收，并在菌体细胞内传导，抑制病原菌氨基酸代谢酯酶系统，破坏病原菌蛋白质生物合成，从而达到抑菌、杀菌作用。

70%甲基硫菌灵可湿性粉剂(WP)，购自济南泰禾化工有限公司。特点：广谱内吸性杀菌剂，具有内吸、预防和治疗作用。作用方式：干扰病原菌菌丝的形成，影响病菌细胞的分裂，使孢子萌发长出的芽管畸形，从而杀死病菌。

50%咯菌腈可湿性粉剂(WP)，购自先正达作物保护有限公司。特点：非内吸性的广谱杀菌剂。作用方式：抑制葡萄糖磷酰化有关酶的转移，并抑制真菌菌丝体的生长，最终导致病菌死亡。

30%噁霉灵水剂(AS)，购自江西禾益化工股份有限公司。特点：广谱内吸性杀菌剂，具有治疗、内吸和传导作用。作用方式：与土壤中的铁、铝等无机金属盐离子结合，有效抑制孢子的萌发和病原真菌菌丝体的正常生长或直接杀灭病菌。

50%苯醚甲环唑悬浮剂(SC)，购自江苏云帆化工有限公司。特点：广谱内吸性杀菌剂，具预防、保护和内吸活性。作用方式：甾醇脱甲基化抑制剂，抑制细胞壁甾醇的生物合成，阻止真菌生长。

25%硅唑·咪鲜胺水乳剂(EW)，购自上海沪联生物药业股份有限公司。特点：氟硅唑属广谱内吸性杀菌剂，具有内吸活性，保护和治疗作用。作用方式：咪鲜胺具有保护和铲除作用，破坏和阻止病菌的细胞膜重要组成成分麦角甾醇的生物合成，导致细胞膜不能形成，使病菌死亡。

45%石硫合剂可湿性粉剂(WP)，购自河北双吉化工有限公司。特点：高效广谱、持久、保护性杀菌剂。作用方式：其中的多硫化钙在空气中经氧、水和二氧化碳的影响发生化学变化，形成硫黄微粒而起杀菌作用。

8种杀菌剂均为低毒杀菌剂，作用特点、作用机制和毒性参照孙家隆和齐军山等研究结果[21]。

1.4 病原菌的分离、纯化与保存

病原菌的分离纯化参照魏琳等[22]的方法。分离到的单孢菌株采用滤纸片保存法[23]，置于—20℃冰箱长期保存。

1.5 病原菌的分类鉴定

1.5.1菌株形态学鉴定 将分离得到的单孢代表菌株接种于PDA平板上，置于25℃培养箱中光照培养7 d，挑取分生孢子制成临时玻片，在光学显微镜(40倍物镜)下观察分生孢子形态。菌株在PDA平板上生长7 d后，用直径0.5 cm的打孔器取菌饼放置在PDA平板中。每株菌株3个重复，并且每皿培养基的厚度保持一致。放置于25℃培养箱培养7 d后，观察菌落形态，并计算平均生长速率。

1.5.2菌株基因组DNA的提取 采用CATB法提取基因组DNA[22,24]，最后用25 μL TE/RNase溶解沉淀，—20℃保存备用。

1.5.3菌株序列分析 rDNA-ITS扩增引物为ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)[25]；TEF-1α基因扩增引物：EF-1(5′- ATGGGTAAGGARGACAAGAC-3′)和EF-2(5′-GGARGTACCAGTSATCATGTT-3′)[26-27]；RPB2基因扩增引物：RPB2-5F(5′-GAYGAYMGWGATCAYTTYGG-3′)和RPB2-7CR(5′-CCCATRGCTTGYTTRCCCAT-3′)[28-29]。反应体系(25 μL)：2×PCR Mix(北京天根生物科技)12.5 μL；上下游引物各(25 pmol·L-1)1.0 μL，；模板DNA(30 μg·L-1)1.0 μL；双蒸水补足至25 μL。PCR反应程序为:变性95℃，5 min;然后30个循环的变性95℃，1 min;退火55℃，1 min;延伸72℃，2 min;最后延伸72℃，10 min。用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测产物，PCR扩增产物纯化后由北京擎科新业生物技术公司进行双向测序。使用软件MAFFT对正反向序列进行拼接，拼接序列在MEGA V. 6.0.6 软件进行校正。使用PAUP* v. 4.0 alpha软件构建系统发育树，采用启发式算法(heuristic searches)进行运算。以交链格孢Alternariaalternata作为外群，运算重复 1 000 次。参照菌株序列下载自NCBI数据库。

1.6 病原菌回接试验

病原菌回接试验步骤参照魏琳等[22]和任小霞等[30]的方法，并有所改进。将菌株接种至PDA培养基平板，25℃培养 7 d，用 0.025% Tween 20溶液洗下分生孢子并制备浓度为1×105个·mL-1的孢子悬浮液。在9 cm无菌培养皿中放置无菌滤纸，并加适量无菌水保持湿润，将健康蒙古黄芪根部截成小段放置于培养皿中，孢子悬浮液点接于根部表面，每点接种10 μL，以接种无菌水为对照。置于25℃ 培养箱黑暗保湿培养24 h，后进行12 h光照12 h黑暗培养。接种7 d后观察根部发病情况。

1.7 杀菌剂的抑菌作用测定

采用菌丝生长抑制法[31]。用分析天平准确称量杀菌剂，分别放入5 mL EP管中，加入一定体积的二甲基亚砜(DMSO)，振荡至药剂充分溶解，配制成105mg·L-1的有效成分母液，4℃黑暗保存备用。之后用DMSO稀释，制成系列浓度梯度药液，加入PDA培养基中，充分摇匀，制成含药平板(9 cm)，以加入等量DMSO的PDA培养基为对照。25%溴菌腈、50%多菌灵、50%咯菌腈和45%石硫合剂设置6个浓度梯度，分别为：0.4，0.9，1.6，3.2，6.4和12.8 mg·L-1。30%噁霉灵设置6个浓度梯度，分别为：0.5，1，2，4，8和16 mg·L-1。70%甲基硫菌灵设置7个浓度梯度，分别为：0.3，0.9，1.2，2.4，4.8，9.6和19.2 mg·L-1。50%苯醚甲环唑和25%硅唑·咪鲜胺设置7个浓度梯度，分别为：0.4，0.9，1.6，3.2，6.4，12.8和25.6 mg·L-1。

用灭菌的打孔器在菌落边缘打取直径5 mm的菌饼，接种到含药平板中央，每处理3次重复，25℃黑暗培养7 d后，用十字交叉法测量菌落直径，计算菌丝生长抑制率。

使用SPSS 17.0数据处理软件，求出斜率±标准误差、EC50(引起50%个体有效的药物浓度)、95%置信限、χ2(卡方值)和P值(显著性水平)。

2 结果与分析

2.1 蒙古黄芪根腐病田间症状及其病原菌柯赫氏法则验证

在青海民和地区，蒙古黄芪发生根腐病后，地上部分褪绿(图1a)、后期变黄枯萎(图1b)，茎基和主根变为红褐色干腐状，上有纵裂或红色条纹，侧根已腐烂或很少(图1c)，湿度大时根部长出白色或者粉色霉层(图1d)。从采集的蒙古黄芪根腐病根部共分离得到9株菌株，分离菌株经柯赫氏法则验证，对蒙古黄芪根均有致病性，接种5 d后接种部位开始形成腐烂病斑，后续出现不同程度的凹陷，并能观察到气生菌丝(图2)。从发病病斑再次分离得到病原菌，菌株形态与田间菌株一致(图3a和图3b)。

图1 田间蒙古黄芪根腐病症状Fig.1 Symptoms of root rot of A. membranaceus var. mongholicus in field注：a为地上部分早期症状；b为地上部分后期症状；c为主根症状；d为根部霉层Note:a for early symptom of aboveground part;b for late symptom of aboveground part;c for symptom of main root;d for white mold on root

图2 蒙古黄芪根腐病病原菌接种黄芪根部Fig.2 Inoculation figure of pathogens from root rot of Astragalus membranaceus var．mongholicus注：左边为无菌水对照，其余图例为黄芪根腐病菌菌株名称Note:On the left is the sterile water control,and the other legends represent the name of the root rot pathogens of Astragalus membranaceus var．mongholicus

2.2 黄芪根腐病病原菌形态学和分子生物学鉴定

对病原菌菌落形态、气生菌丝、分生孢子和产孢细胞形态进行观察(图3)，发现9株病原菌可分为4种。菌株HQ-2-2,HQ-2-2-1和HQ-7形态特征一致，菌丝平均生长速率为0.84 cm·d-1，气生菌丝稀疏，初期呈白色，生长后期有的菌丝呈棕蓝色，基质为玫瑰色；小型分生孢子无色，无隔膜，大小约(8.03～14.28) μm×(2.34～4.68) μm，大型分生孢子无色，镰刀状，2～5个隔膜，大小约(22.98～48.55) μm×(3.61～5.68) μm；产孢细胞单瓶梗，产孢梗长，分生孢子聚生于顶端。

图3 蒙古黄芪根腐病病原菌代表菌株菌落、分生孢子和产孢细胞形态Fig.3 Morphology of colony,conidium and conidiogenous cell of represent root rot pathogens of Astragalus membranaceus var．mongholicus注：a为田间分离菌株；b为室内接种发病根部分离菌株；c和d为田间分离菌株分生孢子和分生孢子梗Note:a were wild isolates;b were isolates from infected root inoculated indoor;c and d were conidia and conidiophore of wild isolates

菌株HQ-8和HQ-8-1形态特征一致，生长缓慢，平均生长速率为0.51 cm·d-1，气生菌丝稀疏，初期白色，生长后期呈现蓝色，且生长时间越长颜色越深；大型分生孢子丰富，无色，1～5个隔膜，大小约为(21.22～51.05) μm×(2.23～5.14) μm，分生孢子梗轮枝状分枝，产孢细胞单瓶梗；小型分生孢子缺乏。

菌株HQ-3,HQ-5和HQ-9形态特征一致，菌丝平均生长速率为0.94 cm·d-1，气生菌丝白色，羊绒状，基质淡黄色；大型分生孢子无色，1～4个隔膜，大小约(23.01～37.93) μm×(3.93～4.60) μm，产孢细胞侧生于梗上，单瓶梗；小型分生孢子不常见。

菌株HQ-5-1菌丝平均生长速率为0.71 cm·d-1，气生菌丝生长茂盛，毛毡状，玫红色；大型分生孢子数量少，无色，1～4个隔膜，大多2个隔膜，大小约(28.77～40.21) μm×(3.09～5.73) μm，小型分生孢子极少见；产孢细胞单瓶梗，侧生于梗上。

对病原菌进行分子生物学鉴定，将所测得代表菌株的rDNA-ITS序列、TEF-1α基因序列和RPB2基因序列在GenBank中与已知的序列进行BLASTs相似性比较分析，以已在NCBI公布序列的菌株作为参考菌株，构建系统发育树，以确定菌株的分类地位。

基于菌株rDNA-ITS序列构建系统发育树(图4)，HQ-2，HQ-2-2-1和HQ-7与腐皮镰刀菌(Fusariumsolani)在同一发育分支上，亲缘关系最近；菌株HQ-3，HQ-5和HQ-9与木贼镰刀菌(Fusariumequiseti)在同一发育分支上，亲缘关系最近；菌株HQ-5-1与锐顶镰刀菌(Fusariumacuminatum)聚为1个分支，亲缘关系最近；菌株HQ-8和HQ-8-1与逗号镰刀菌(Fusariumvirguliforme)聚为1个分支，亲缘关系最近。基于TEF-1α基因序列和RPB2基因序列构建的系统发育树(图5和图6)中菌株分类地位与基于rDNA-ITS序列构建的系统发育树一致。

图4 蒙古黄芪根腐病病原菌基于rDNA-ITS序列序列联合构建的系统发育树Fig.4 The maximum parsimony tree of root rot pathogens of Astragalus membranaceus var．mongholicus inferred from combined sequences of rDNA-ITS

图5 蒙古黄芪根腐病病原菌基于TEF-1α基因序列联合构建的系统发育树Fig.5 The maximum parsimony tree of root rot pathogens of Astragalus membranaceus var．mongholicus inferred from combined sequences of TEF-1α gene

因此，结合形态学特征，菌株HQ-2-2，HQ-2-2-1和HQ-7为腐皮镰刀菌；菌株HQ-8和HQ-8-1为逗号镰刀菌；菌株HQ-3，HQ-5和HQ-9为木贼镰刀菌；菌株HQ-5-1为锐顶镰刀菌。

2.3 病原菌对杀菌剂的敏感性

通过测定8种杀菌剂对腐皮镰刀菌HQ-2-2、逗号镰刀菌HQ-8、木贼镰刀菌HQ-3和锐顶镰刀菌HQ-5-1菌丝生长的抑制作用，发现硅唑·咪鲜胺对4种镰刀菌的抑制作用最强，EC50分别为0.195,0.281,0.588和0.266 mg·L-1。多菌灵对腐皮镰刀菌、木贼镰刀菌和锐顶镰刀菌的抑制作用较强，EC50分别为0.340，0.113和0.869 mg·L-1，但是对逗号镰刀菌的抑制作用较差，EC50为1.183 mg·L-1。咯菌腈对逗号镰刀菌、木贼镰刀菌和锐顶镰刀菌的抑制作用较强，EC50分别为0.153，0.269和0.390 mg·L-1，但是对腐皮镰刀菌的抑制作用较差，EC50为1.925 mg·L-1。锐顶镰刀菌对苯醚甲环唑较为敏感，EC50为0.306 mg·L-1，其他3种镰刀菌对苯醚甲环唑敏感性较差，EC50在1.529～2.354 mg·L-1之间。4种镰刀菌对甲基硫菌灵和噁霉灵的敏感性较差，EC50在1.018～2.746 mg·L-1之间；溴菌腈和石硫合剂对4种镰刀菌的抑制作用最差，EC50在2.196～4.360 mg·L-1之间(表1)。

表1 8种杀菌剂对蒙古黄芪根腐病病原菌的抑菌活性测定Table 1 Determination of the inhibition effects of eight fungicides against root rot pathogens of Astragalus membranaceus var. mongholicus

续表1

3 讨论

本研究经柯赫式法则验证、形态学和系统发育分析发现，引起青海民和地区蒙古黄芪根腐病的病原菌有腐皮镰刀菌、逗号镰刀菌、木贼镰刀菌和锐顶镰刀菌。镰刀菌引起的根腐病属于土传病害，病原菌可能是通过带菌种子和种苗等方式进行远距离传播而来[32]，也可能是土著病原菌。镰刀菌属真菌可引起三七、川穹、板蓝根、白芷、白术、当归、柴胡等多种中草药的根腐病，从而造成严重的产量和经济损失。化学防治方面，多菌灵、福美双和苯醚甲环唑等化学药剂对多种药用植物根腐病具有较好的防治效果[33]。

通过对8种高效低毒杀菌剂进行筛选研究发现硅唑·咪鲜胺对4种镰刀菌的抑制作用最强，目前，尚未见使用硅唑·咪鲜胺防治黄芪根腐病的相关报道。范钱等[17]研究发现多菌灵对山西省浑源县黄芪根腐病主要致病菌尖孢镰刀菌和腐皮镰刀菌具有较好的抑制效果。我们也发现多菌灵对腐皮镰刀菌、木贼镰刀菌和锐顶镰刀菌的抑制作用较强，而对逗号镰刀菌的抑制作用较差。范钱等[17]同时报道苯醚甲环唑对尖孢镰刀菌和腐皮镰刀菌的EC50分别为0.107 6 mg·L-1和66.055 9 mg·L-1。我们发现苯醚甲环唑对锐顶镰刀菌的抑制作用较好，EC50为0.306 mg·L-1，对其他3种镰刀菌的抑制作用较差。朱蕾[15]报道甲基硫菌灵对蒙古黄芪根腐病病原菌尖孢镰刀菌和腐皮镰刀菌的抑制效果显著，EC50分别为0.659 9和0.564 3 mg·mL-1。何晨等[16]研究发现甲基硫菌灵(502.5 g·hm-2)浸根处理黄芪一年龄种苗可以有效防治根腐病菌尖孢镰刀菌和腐皮镰刀菌。但是我们发现甲基硫菌灵对蒙古黄芪4种病原菌的抑制效果较差，EC50在1.529～2.354 mg·L-1之间。与文献报道存在药效差异可能与病原种类和菌株的个体差异有关。

本研究筛选得到的室内防治效果较好的药剂硅唑·咪鲜胺、多菌灵、苯醚甲环唑等都属于广谱、高效、低毒杀菌剂，没有致残、致畸、致突变的作用。目前，青海省黄芪根腐病防治研究还处于起步阶段，连作障碍是导致黄芪根腐病的主要原因之一，在没有有效的大田防治药剂之前应提倡间作。后续我们将开展化学防治大田试验及生物防治菌株的筛选工作，为实现该病害的综合防治奠定基础。

4 结论

本研究从青海民和地区采集蒙古黄芪根腐病样本3份，从中分离得到9株病原菌，经形态学和分子生物学鉴定发现蒙古黄芪根腐病是由4种镰刀菌引起的。其中逗号镰刀菌引起黄芪根腐病为国内首次报道。针对分离鉴定的蒙古黄茂根腐病病原菌，筛选到了适宜的高效低毒杀菌剂硅唑·咪鲜胺和多菌灵，为蒙古黄芪根腐病的化学防治提供了候选药剂，也为药剂的轮换使用提供了科学依据。