TCF23基因与宁乡猪繁殖性状关联研究

唐 婧，何 俊，叶 旭，汤 香，蒋 隽※

（1.湖南农业大学教育学院，湖南 长沙 410128；2.湖南农业大学动物科技学院，湖南 长沙 410128）

1 前言

母猪的繁殖性状是重要的经济性状之一。母猪繁殖能力的提高可直接影响生猪业的生产效率和经济效益。猪育种研究者们和养猪行业一直在密切关注并研究如何改善母猪的繁殖性状[1-5]。然而，繁殖性状属于遗传力较低的性状，因此通过传统育种方法有效改善母猪的生殖性状非常缓慢。近年来，随着现代分子生物学技术的兴起和不断发展，动物遗传改良迎来了新的机遇。猪繁殖性状的遗传改良已成为新的研究浪潮。与母猪繁殖性状密切相关的基因的结构和功能将得到深入研究，以寻找相应的遗传标记[6-9]。

宁乡猪是我国著名的地方品种之一，已有上千年的繁衍历史，因其肉质优良、性情温顺以及适应性强等特性，被称为国家重要家畜基因库，然而与长白猪、大白猪等国外品种相比其繁殖力较低，这显著限制宁乡猪的扩繁增产。因此，本研究基于前期采用GWAS技术在宁乡猪中初步筛选到的候选基因TCF23，采用PCR-RFCP技术进一步研究该基因与繁殖性状的关联，为运用分子生物技术提宁乡猪繁殖性能奠定一定的基础。

2 材料与方法

2.1 试验动物

本试验从湖南省宁乡市某种猪场选择170头经产的宁乡母猪作为研究对象对试验动物进行活体采样。宁乡猪均来源一致，且饲养环境和饲料环境相同，用耳号钳采取指甲大小的耳组织，放入装有75%乙醇的1.5mL离心管中，并在离心管上做好耳样标记，放入-20℃保存。

试验研究的繁殖性状来源于种猪场的母猪记录，包括猪总产仔数（TNB）、产活仔数（NBA）、初生仔猪死亡数和仔猪成活率等头三胎的繁殖性状。

2.2 试验方法

2.2.1 耳组织样DNA提取与检测

采用传统苯酚氯仿抽提法提取宁乡猪的DNA，将提取的DNA保存于-20℃备用[10]。

2.2.2 目的DNA片段的PCR扩增

参照NCBI公布的猪TCF23基因（登录号：NC_010445.4）DNA外显子序列进行设计引物序列，运用Primer Premier 5.0软件及NCBI中的Primer-BLAST等设计PCR的引物（由长沙擎科生物科技有限公司合成）。引物序列见表1。

对宁乡猪DNA进行普通PCR扩增，PCR扩增所用的引物序列及详细扩增片段信息见表1。使用长沙博仪生物科技有限公司2×Rapid Taq Master Mix进行PCR试验，PCR总体系为50mL。反应结束后置于4℃冰箱保存备用。PCR的反应体系及程序见表2、表3。

表1 PCR引物序列列表

表2 PCR反应体系

表3 PCR反应程序

2.2.3 PCR产物检测

使用1%琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测，操作步骤如下：

（1）使用天平称取近1.0g琼脂糖粉置于200mL三角瓶中，再100mL 1×TAE，摇晃混匀，放入微波炉中加热90s至沸腾，取出晃使琼脂糖粉充分溶解。

（2）室温下冷却至55℃～70℃左右，加入核酸染料,摇晃使其混合均匀。

（3）将琼脂糖胶溶液倒入已插好梳子的样板中，注意勿出现气泡。室温下放置30min左右，代胶液完全凝固，取出梳子。

（4）取5μL待检测DNA样品与1μL 6×DNA Loading Buffer混合均匀，点入样孔。

（5）将琼脂糖凝胶置于电泳槽中，并使电泳槽中的TAE覆盖点样孔至1mm，开启电泳仪，电压调节为110V,电泳30min。

（6）电泳结束后，取出凝胶，放入凝胶成像仪下观察并拍照保存。

（7）若电泳条带整齐、明亮、无拖尾，分子量大小与目的片段相吻合，送去湖南擎科生物有限公司测序。

2.2.4 PCR-RFLP多态性检测

选用限制性内切酶做单酶反应。酶切反应体系为31mL，其中取10mLPCR反应产物，限制性内切酶1mL（10U），10×buffer Tango 2mL，加水至31mL。37℃反应8小时。酶切产物以600bp DNAMarker对照，使用2%的琼脂糖凝胶，并在120V电压下电泳35min进行检测，紫外灯下观察，并拍照判断基因型。

2.2.5 候选基因部分序列测序

通过对不同外显子进行各种酶切寻找多态位性，发现TCF23-2段上出现多态性。选取不同条带的各三个，找到相对应的猪DNA进行PCR扩增后送往湖南擎科生物有限公司测序，测序公司返回结果峰图，测序结果利用Lasergene软件中的SeqMan程序及DNAMAN生物软件查看，将测序结果与Genen Bank上猪的相应DNA序列对比，以寻找出扩增片段的碱基突变位点。

2.2.6 数据统计与分析

用SPSS20软件进行各基因突变位点多态性与性状间的关联分析，用单因素ANOVA方差分析显著性。基因间联合分析，用一般线性模型中单变量分析，联合分析中将各突变位点中个体数多的纯合基因型统一用纯合型AA表示，个体数少的纯合基因型用纯合型BB表示，杂合基因型用杂合型AB表示。分析选用Duncan多重比较检验，数据表示为平均值±标准误，P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异极显著。

3 结果与分析

3.1 基因组DNA提取效果

共提取了170头宁乡猪耳组织DNA，经分光光度计检测得出DNA的OD260/280值在1.8～2.0正常范围内无蛋白质污染。经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1。由图1可见，电泳条带整齐、明亮、无拖带现象。证明提取的DNA质量符合要求，可进行后续试验。

图1 基因组DNA电泳检测结果

3.2 PCR扩增产物检测

PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图2。由图可见，电泳条带清晰明亮，且与目的片段吻合，可知PCR扩增的产物特异性较高，可以进行下一步的试验。

图2 TCF23-2电泳检测结果

3.3 PCR-RFLP检测结果

宁乡猪基因TCF23第2外显子片段扩增产物存在两个SmaⅠ酶切位点，将产物切为380 bp、125bp和44bp三个片段，但与酶切出来的条带不符，通过测序对比发现宁乡猪基因TCF23第2外显子序列片段在122bp处突变形成酶切位点以及突变形成的位点上存在碱基突变导致每种基因型带有不同片段，其中AA型显示条带有（169bp、380bp）、（122bp、169bp、258bp）和（122bp、169bp、258bp、380bp）、GG型 显 示 条 带 有（44bp、125bp、380bp）、（44bp、122bp、125bp、258bp） 和（44bp、122bp、125bp、258bp、380bp）杂合子AG基因型显示 条 带 有（44bp、125bp、169bp、380bp）、（44bp、122bp、125bp、169bp、258bp）以 及（44bp，122bp、125bp、169bp、258bp、380bp），其中小于100bp在胶图中不能显示。如图3。

图3 引物TCF23-2 PCR产物RFLP检测图

3.4 扩增产物测序的结果

将TCF23基因（GenBank登录号为NC_010445.4）第2外显子（TCF23-2扩增片段）进行酶切所产生的不同条带，选取不同条带的各三个，找到相对应的猪DNA进行PCR扩增后送往公司测序。将TCF23-2 PCR-SmaⅠ-RFLP酶切结果与测序列结果对比验证，结果发现，在TCF23第2外显子387碱基处存在G→A类型突变（G387A）突变位点，测序比对结果见图4。将TCF23基因第2外显子387位点没有发生突变的纯合子个体为GG型，由G突变成A的纯合子个体命名为AA型，由G突变成A的杂合子个体命名为AG型，测序峰图见图5。测序分析结果与酶切结果符合。

图4 TCF23-2片段序列对比结果

3.5 SNPs及其与宁乡猪繁殖性状的关联分析

基因多态性与母猪繁殖性状的关联分析结果见表4。宁乡猪TCF23基因G387A位点上，突变AA基因型总产仔数为最高，其次为AG杂合型，野生GG基因型总产仔数为最低。其中AA基因型总产仔数高于AG基因型和GG基因型且总产仔数差异上达到了显著水平（P＜0.05），不同基因型宁乡猪的成活率、产活仔数和初生猪仔死亡均无显著差异性（P＞0.05）。

表4 三个基因多态性与繁殖性状的关联分析

4 讨论

TCF23(转录因子23)是一种蛋白编码基因，属于基因编码基本螺旋-环-螺旋转录因子家族的一个成员。参与多种细胞分化过程，有研究表明TCF23主要在成年小鼠的生殖器官如卵巢、子宫和睾丸等组织中表达，在发育中的胚胎组织中几乎检测不到TCF23[11]。KommaganiR等[12]，对卵巢切除的小鼠的子宫内膜组织RNA进行了全基因组比较转录谱分析，揭示转录因子23是人类子宫内膜间质细胞蜕膜化所必需。

目前还没有关于TCF23基因与猪繁殖状关联的相关性的报道，本研究结果表明，TCF23基因G387A位点对宁乡猪的总产仔数具有显著影响，可作为高产仔数母猪个体的遗传标记。但该位点所在的基因是否可以作为宁乡猪产仔数相关的候选基因，还须进一步对其功能进行验证。 □