归芪通脉颗粒的质量标准研究

郭 丽，陈 皓，吴作敏，于晓涛，陈恒文，金少举，王 瑞*

（1. 漯河市第一人民医院 药学部，河南 漯河 462300；2. 中国中医科学院广安门医院 心血管科，北京 100053；3. 漯河医学高等专科学校 药理学教研室，河南 漯河 462002）

归芪通脉方是由黄芪、当归、党参、陈皮、蜈蚣等14味药材经科学配伍组成的医院制剂，具有补气活血，化瘀通络之功效，用于改善缺血性脑卒中恢复期的言语謇涩，肢体麻木等，在我院临床疗效良好，具有开发成为名优中成药的潜力和价值。方中君药黄芪的主要活性成分黄芪甲苷，通过抑制内皮细胞凋亡，促进内皮细胞的增殖和迁移等，对缺血缺氧性脑血管内皮损伤起到保护作用[1]；芍药苷是臣药赤芍活血化瘀的功效物质基础[2]，有研究芍药苷通过PC12细胞中的Bcl-2/Bax通路防止谷氨酸诱导的神经毒性发挥神经保护作用[3]；党参炔苷是佐药党参质量评价的指标性成分之一[4]。

归芪通脉方经提取优化工艺制备而成[5]，为了便于患者携带和服用，通过提取浓缩而后经喷雾干燥开发成为颗粒剂。为了对该制剂进行质量控制，本研究采用薄层色谱法对处方中黄芪、赤芍、党参进行定性鉴别，采用HPLC-DAD双波长检测法对羟基红花黄色素A（HSYA，红花）、毛蕊异黄酮葡萄糖苷（黄芪）、芍药苷（赤芍）和橙皮苷（陈皮）4种有效成分进行含量测定[6]，为开发治疗中风中药新药提供理论依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Shimadzu LC 20AD型HPLC仪（二级管阵列检测器）；AUW-120D型电子天平（精度为十万分之一，日本Shimadzu公司）；SB25-12D超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；DHG-9070型电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）。

1.2 试药

对照品HSYA（批号：MUST-19082111，纯度：98.11 %）、橙皮苷（批号：MUST-19030701，纯度：98.46 %）均购自成都曼思特生物科技有限公司，对照品黄芪甲苷（批号：110781-201616，纯度97.40 %）、毛蕊异黄酮葡萄糖苷（批号：111920-201606，含量：97.60 %）、芍药苷（批号：110736-201842，含量：97.40 %），对照药材党参（批号：121057-201206）均购自中国食品药品检定研究院；乙腈为色谱纯；三氯甲烷、乙酸乙酯等试剂为分析纯，水为超纯水。供试品归芪通脉颗粒（批号：20200426，20200529，20200626）及阴性样品，由漯河市第一人民医院制剂室提供。

2 方法与结果

2.1 TLC鉴别

2.1.1 黄芪TLC鉴别[7-8]精密称取归芪通脉颗粒10 g，加水20 ml使其溶解，水饱和的正丁醇提取3次，每次30 ml，合并正丁醇液，用氨试液洗涤3次，每次20 ml，再用水洗至中性，用无水硫酸钠脱水，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇1 ml溶解，作为供试品溶液；同法制成阴性样品溶液。另取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇制成每1 ml含1 mg的对照品溶液。照薄层色谱法（通则0502）试验，吸取上述3种溶液各5 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水（13:7:2）10 ℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10 %硫酸乙醇溶液，105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，日光下显相同颜色的棕褐色斑点；紫外光下显相同颜色的橙黄色荧光斑点，阴性样品在相同位置上无干扰，结果见图1。

图1 黄芪TLC鉴别

2.1.2 赤芍TLC鉴别[9]精密称取归芪通脉颗粒5 g，加水20 ml使其溶解，用水饱和的正丁醇提取3次，每次20 ml，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇1 ml溶解，作为供试品溶液；同法制成阴性样品溶液。另取芍药苷对照品，加甲醇制成每1 ml含1 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（通则0502）进行试验，吸取上述3种溶液各4 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（40:5:10:0.2）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5 %香草醛硫酸溶液，105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品在相应位置上无干扰，结果见图2。

图2 赤芍TLC鉴别

2.1.3 党参TLC鉴别[4]精密称取归芪通脉颗粒10 g，加水20 ml，置圆底烧瓶中，加盐酸3 ml，加热回流30 min，放冷，滤过，滤液用石油醚（30～60 ℃）提取2次，每次40 ml，弃去石油醚液，再用二氯甲烷提取3次，每次20 ml，合并二氯甲烷提取液，残渣加二氯甲烷1 ml使溶解，作为供试品溶液；同法制成阴性样品溶液。另取党参对照药材1 g，加水适量，煎煮1 h，放冷，滤过，滤液浓缩至约20 ml，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法（通则0502）试验，吸取上述3种溶液各4 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（20:18:0.5）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10 %硫酸乙醇溶液，105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的深褐色斑点，阴性样品无干扰，结果见图3。

图3 党参TLC鉴别

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱为Gemini Phenomenex C18（250 mm×4.6 µm，5 µm）；流动相为乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0～5 min，15 %→20 % A；5～10 min，20 %→22 % A；10～20 min，22 % A；20～40 min，22 %→80 % A；40～45 min，80 % A；45～48 min，15 % A）。经PDA全波长扫描，确定最佳检测波长为403 nm（HSYA）、220 nm（芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、橙皮苷），故采用双波长检测。流速为0.8 ml/min，柱温为25 ℃，进样量为5 µl。

2.2.2 溶液的制备

2.2.2.1 对照品溶液制备 精密称取对照品HSYA、芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、橙皮苷各适量，置入10 ml量瓶，加甲醇溶解并定容，配成质量浓度分别为255.10，146.10，116.10，204.80 µg/ml的混合对照品储备液。

2.2.2.2 供试品溶液制备 精密称取归芪通脉颗粒（批号：20200426）2.50 g，研细，置入25 ml量瓶，用70 %乙醇稀释至刻度，称重，超声30 min，放冷称重并补足失重，摇匀，滤过，取续滤液10 ml蒸干，残渣加70 %乙醇使溶解，转移至10 ml量瓶，作为供试品溶液。

2.2.2.3 阴性样品溶液制备 分别取缺黄芪、缺赤芍、缺红花、缺陈皮的阴性样品，按供试品溶液制备方法制成阴性样品溶液。

2.2.3 专属性考察 分别精密吸取2.2.2项下制备的混合对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液各适量，按2.2.1项下色谱条件进样测定，见图4。结果表明，供试品中HSYA、芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷和橙皮苷与其他组分的分离度大于1.5，与对照品色谱在相应的位置上具有相同的保留时间，阴性样品溶液对这4种成分的测定均无干扰。

图4 归芪通脉颗粒高效液相色谱图

2.2.4 线性关系考察 精密吸取混合对照品储备液2.5 ml，置入5 ml量瓶，用甲醇稀释至刻度，逐级稀释，制成6个浓度梯度的混合对照品溶液，依法进样测定，以质量浓度（µg/ml）为横坐标（x），4种成分的峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，结果见表1。

表1 线性关系考察结果

2.2.5 精密度试验 精密吸取2.2.2项下的混合对照品溶液，连续进样6次，按照2.2.1项色谱条件测定并记录峰面积。结果，4种成分峰面积的RSD分别为0.29 %，0.21 %，0.31 %，1.74 %（n=6），表明仪器精密度良好。

2.2.6 重复性试验 取同一批样品（批号：20200426）2.50 g，按2.2.2项下方法平行制备6份供试品溶液，按2.2.1项色谱条件分别测定峰面积。结果，4种成分峰面积的RSD分别为1.09 %，1.80 %，2.51 %，2.90 %（n=6），表明重复性良好。

2.2.7 稳定性试验 取2.2.6项下同一供试品溶液，于室温下放置0，2，4，8，12，24 h分别进样测定，记录峰面积。结果4种成分峰面积的RSD分别为1.17 %，1.07 %，2.14 %，2.98 %（n=6），表明24 h内供试品溶液稳定性良好。

2.2.8 回收率试验 取同一批次已知含量的归芪通脉颗粒适量，研细，精密称取1.25 g，共6份，分别置入25 ml量瓶，加入一定质量的混合对照品，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，制得供试品溶液，计算回收率及RSD，见表2～5。结果，HSYA、芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、橙皮苷的平均回收率分别为101.04 %，98.31 %，99.33 %，98.79 %，RSD分别为1.74 %，1.12 %，1.36 %，1.51 %。表明该方法的回收率良好。

表2 HSYA加样回收率结果（n=6）

表3 毛蕊异黄酮葡萄糖苷加样回收率结果（n=6）

表4 芍药苷加样回收率结果（n=6）

表5 橙皮苷加样回收率结果（n=6）

2.3 样品的含量测定

取10批归芪通脉颗粒，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，按2.2.1项下色谱条件进样，见表6。将所测各成分含量平均值的80 %作为内控指标，暂将含量限度定为：每1 g含红花以羟甲基红花黄色素A（C27H32O16）计不少于0.07 mg，含芍药以芍药苷（C23H28O11）计不少于0.06 mg，含黄芪以毛蕊异黄酮葡萄糖苷（C22H22O10）计不少于0.04 mg，含陈皮以橙皮苷（C28H34O15）计不少于0.10 mg。

3 讨论

3.1 TLC鉴别方法优化

在鉴别党参时先借鉴了黄芪项下的样品制备方法，所得TLC色谱图阴性有干扰且无明显特征点，后将样品酸化，置沸水浴，用二氯甲烷水解得到苷元，得到了专属性强且阴性无干扰的党参TLC色谱图。

当归、川芎中均含有阿魏酸，具有抗血栓形成和抑制血小板聚集等作用[10-11]。实验中曾尝试同时对当归、川芎进行薄层鉴别，但发现供试品与对照药材分别对应有明显的亮斑点，但缺当归和川芎的阴性对照溶液却存在干扰，又经过HPLC色谱的对比发现在标准品阿魏酸的相同保留时间和位置存在干扰峰，表明当归和川芎的薄层鉴别不具有专属性和特征性，故未列入标准。曾尝试白术的薄层鉴别，但发现阴性有干扰，故未列入标准。本研究建立的黄芪、芍药、党参的薄层鉴别方法重现性好，分离效果好，特征斑点清晰且阴性无干扰，能有效控制该制剂的质量。

3.2 HPLC含量测定方法优化

含量测定的指标选择了君、臣、佐药，首先采用HPLC-ELSD对君药黄芪甲苷进行含量测定，发现样品制备操作复杂，误差较大，故未列入标准。为减少误差，选用70 %乙醇直接稀释样品，离心取上清的方法制备样品，同时建立HSYA、芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷和橙皮苷4个含量测定，采用双波长法进行含量测定，HSYA（403 nm），芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷和橙皮苷（220 nm），并且经过方法学考察，专属性强，精密度高，重现性好。

综上所述，本研究建立归芪通脉颗粒的定性定量方法，符合中药质量标准制定的技术要求，可作为该制剂的质量控制标准。