食品中两种沙门氏菌检测方法的比较*

顾雨熹 王 锦 陈 帅 李 理 陈晋莹

(中储粮成都储藏研究院有限公司 610091)

沙门氏菌属(Salmonellaspp.)是一类肠杆菌科的革兰氏阳性菌，需氧及兼性厌氧，是主要的食源性病原体之一[1]，也是一种常见的人畜共患的病原菌，可引起人和动物肠炎热、胃炎热、败血症等[2]。

人类感染沙门氏菌的主要途径是食用了被沙门氏菌污染的蛋类、禽类肉制品和猪肉[3]。据世界卫生组织(WHO)2015年发布的统计数据，自2010年以来全球发生了涉及22种不同食源性肠道疾病5.82亿例，造成35.1万人死亡，其中伤寒沙门氏菌造成5.2万例死亡。近年来报道显示，在我国每年也有900多万人次因沙门氏菌患病，导致近800人死亡。沙门氏菌也容易成为动物源性饲料的主要污染源，其中以骨粉、鱼粉、血粉等蛋白质饲料最易被沙门氏菌污染[4]。用沙门氏菌污染的饲料饲喂动物，是引起禽伤寒、猪霍乱、鼠伤寒沙门氏菌病、猪副伤寒、马流产沙门氏菌等动物疾病的主要途径，造成的经济损失巨大，严重威胁养殖业健康和可持续发展[5]。

沙门氏菌已经成为食源性致病菌重点监控对象，但是目前还没有发现能有效预防沙门氏菌传播的药物[6]。因此，快速、准确地检测食品和饲料中的沙门氏菌是有效防控沙门氏菌感染的关键环节，重视沙门氏菌的检测工作才能最大限度防范沙门氏菌带来的食品安全隐患。截至2021年9月30日，现行有效的沙门氏菌相关检测标准共28个，其中国家标准6个，地方标准12个，行业标准10个。

食品安全国家标准GB 4789.4-2016规定了食品中沙门氏菌的检验方法，该方法为较为传统的微生物学检验法，检验鉴定程序复杂，检测周期较长。随着近年来细菌学研究的持续深入，细菌检测渐渐从表型判定转向基因鉴定。近年发展起来的PCR技术(Polymerase Chain Reaction)其本质是在体外大量扩增目的DNA片段，该技术具有检测时间少、特异性强、灵敏度高、操作简单、成本低等优点[7]。

本次研究对同一批样品分别使用微生物学检验法和PCR法进行检测。通过对比两种方法在实际检测过程中的差异，为探索沙门氏菌检测方法的优化提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品及阳性对照 待测盲样3个，均为白色粉状样品，采用西林瓶真空密封包装，由大连中食国实检测技术有限公司提供，分别编号为N1、N2、N3。

阳性对照：肠沙门氏菌肠亚种(中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号：CICC21513)，由本实验室保存。

阴性对照：灭菌ddH20。

1.1.2 培养基及试剂 培养基：缓冲蛋白胨水(BPW)；四硫磺酸钠煌绿(TTB)增菌液；亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液；亚硫酸铋(BS)琼脂；木糖赖氨酸脱氧胆盐(XLD)琼脂；营养琼脂。

试剂：DBI-05沙门氏菌干制生化鉴定试剂盒(北京产)；细菌DNA提取试剂盒(南京产)；2×Rapid Taq Master Mix(南京产)；Ultra GelRed Nucleic Acid Stain(南京产)；1×TAE缓冲液；DL2000 Plus DNA Marker(南京产)。

沙门氏菌特异性引物设计参考饲料中沙门氏菌检测PCR法中所用引物[8]，本研究所使用的PCR引物及测序均由成都某公司提供。

表1 PCR引物及测序

1.1.3 仪器与设备 高压蒸汽灭菌锅(HVE-50)；无菌操作台(SW-CJ-1FD)，苏州产；恒温培养箱(BD53)；PCR仪(ETC811),北京产；电泳仪(WIX-EP600)，北京产；凝胶成像仪(GenoSens 2100),上海产；纯水仪(Direct 16)。

1.2 试验方法

1.2.1 微生物学检验 微生物学检验方法按照国家标准GB 4789.4-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验》中规定的食品中沙门氏菌的检验方法，依据其生化特性，通过预增菌、选择性增菌、分离、纯化培养、生化鉴定5个步骤对沙门氏菌进行检测(图1)。

图1 沙门氏菌微生物学检测流程

1.2.1.1 预增菌 在无菌条件下，将3个待测盲样与225 mL BPW培养基混匀后，置于恒温培养箱中36±1℃培养8 h～18 h。

1.2.1.2 选择性增菌 在无菌条件下，分别取预培养的样品混合液1 mL加入10 mL TTB培养基与10 mL SC培养基。TTB培养基混合物置于恒温培养箱中42±1℃培养18 h～24 h，SC培养基混合物置于恒温培养箱中36±1℃培养18 h～24 h。

1.2.1.3 分离 在无菌条件下，分别取选择性增菌液一环，划线接种于一个BS平板和一个XLD平板，置于恒温培养箱中36±1℃分别培养40 h～48 h(BS平板)和18 h～24 h(XLD平板)。培养后观察各选择性平板上生长的菌落特征(表1)。

表1 沙门氏菌落特征

1.2.1.4 纯化培养 从选择性平板上分别挑取2个以上典型菌落接种于营养琼脂平板进行纯化培养，于36±1℃培养18 h～24 h。

1.2.1.5 生化鉴定 挑取营养琼脂平板的培养物，按照DBI-05沙门氏菌干制生化鉴定试剂盒说明书操作进行生化鉴定。

1.2.2 PCR法检验 根据沙门氏菌特征基因片段的分子生物学特性，通过预增菌、选择性增菌、模板制备、PCR扩增、电泳检测、测序验证6个步骤对沙门氏菌进行快速检测(图2)。

图2 沙门氏菌PCR法检测流程图

1.2.2.1 预增菌 将3个待测盲样、阳性对照和阴性对照，采用1.2.1中的预增菌方法进行预增菌。

1.2.2.2 选择性增菌 同1.2.1.2中的选择性增菌方法。

1.2.2.3 模板制备 使用细菌DNA提取试剂盒，提取增菌后的3个待测盲样、阳性对照样品和阴性对照样品的DNA，进行琼脂糖凝胶电泳，待测盲样和阳性对照出现明亮条带并且阴性对照无条带，则为模板制备成功且模板制备过程中没有出现人为污染。

1.2.2.4 PCR扩增(见表2)

表2 反应体系和循环参数

1.2.2.5 电泳检测 将1.5 g琼脂糖加入100 mL 1×TAE缓冲液中加热至充分溶化，冷却至60℃～65℃，加入10 μL GelRed充分混匀。根据需要在制胶器中放入合适的梳子，制成电泳胶块，放入电泳槽内。取6 μL Marker2000点样，并将7 μL～9 μL PCR扩增产物点样于同一块胶上。5 V/cm恒压电泳，至指示剂迁移至凝胶中后部，用成像仪进行凝胶成像，观察在330 bp处是否出现条带，如有则为疑似阳性样品。

1.2.2.6 测序 对于疑似阳性样品，将其扩增产物进行测序，测序结果NCBI网站上用BLAST工具(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行序列比对。

2 结果与分析

2.1 两种方法检测程序对比

沙门氏菌微生物检测的过程中，预增菌步骤所需时间为8 h～18 h，增菌步骤所需时间为18 h～24 h，纯化培养所需时间为18 h～24 h，微生物学检测在使用较为便捷的沙门氏菌生化鉴定试剂盒的情况下仍需24 h的检测时间，该法的总检测时间为68 h～90 h。

本次试验所使用的沙门氏菌PCR检测的过程中，预增菌和增菌步骤与微生物法一致，但在分子生物学检测中仅需要2 h左右即可完成初步检测，总检测时间约为28 h～44 h，如需进行测序则总检测时间再增加8 h～12 h，为36 h～56 h。

PCR法检测总时长36 h～56 h较微生物学检测总时长68 h～90 h，节约了近一半的检测时间，显著地提升了检测效率。且在前期的实验准备中，微生物学法需要准备6种培养基，PCR法仅需准备3种培养基，利用PCR法对沙门氏菌进行检测的检测成本更低、操作更简单。

2.2 检测结果对比

2.2.1 微生物学检测法检测结果 检测结果表明(表3)，N2为典型的含沙门氏菌属的样品，N1、N3为不含沙门氏菌属的样品。

表3 沙门氏菌微生物学检测结果

2.2.2 PCR法检测结果 选择性增菌后提取N1-N3、阳性对照样品和阴性对照样品的核酸，琼脂糖凝胶电泳结果显示模板制备成功且试验过程中没有出现人为污染。

利用试验设置的程序和引物对N1-N3样品及阳性对照进行PCR扩增，电泳结果如图3，N2和阳性对照在约330 bp处出现明亮条带。

图3 PCR法检测电泳结果图

送测序后返回的结果使用NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的BLAST功能进行序列比对。结果显示，N2扩增产物与目的片段的同源性为99%[图4(a)]，阳性对照与目的片段扩增产物的同源性为98%[图4(b)]，N2与阳性对照中均顺利扩增出目的片段，说明利用本试验中的方法检测沙门氏菌具有可行性，检测结果可靠。

(a)N2扩增序列与目的片段(Target)比对结果

(b)对照组(C)扩增序列与目的片段(Target)比对结果

为了进一步了解样品中沙门氏菌的种属，将对照组(C)的扩增序列在NCBI基因数据库中进行比对，该序列与肠沙门氏菌肠亚种(Salmonellaentericasubsp.enterica)完全一致，同源性达到100%[图5(a)]，该结果与事实相符。随后，我们将N2扩增产物序列在NCBI基因数据库中进行比对，该序列与肠沙门氏菌肠亚种的同源性最高达到99%[图5(b)]，推测N2中的沙门氏菌为肠沙门氏菌肠亚种中的一种。

(a)C(对照组)在基因数据库中的比对结果

(b)N2在基因数据库中的比对结果

通过试验证明，PCR法的检测结果与微生物学检测法的结果一致，均为：N2为含沙门氏菌的阳性样品，N1、N3为不含沙门氏菌的阴性样品。

3 分析与结论

PCR法与传统微生物学检测法得出的结果高度一致，结果均是N2为沙门氏菌阳性样品、N1和N3为沙门氏菌阴性样品，后经大连中食国实反馈该检测结果正确。说明两种方法均能在实际检测应用中得出准确的检测结果，且PCR法检测具有时间短、特异性强、灵敏度高、操作简单、成本低的应用优势[8]。

尽管PCR技术具有一定的优势，在现代食品安全检测技术中发挥着重要作用，但它还存在一些值得关注的问题。其中最常见的就是外源基因污染问题，由于PCR的灵敏度较高，且该PCR的实质是通过体外大量扩增DNA片段从而放大信号。如果检测过程中被外源DNA污染，很容易得到假阳性结果，就会严重影响检测结果的准确性[9]。

近年来，PCR技术在沙门氏菌检测中还取得了一些新的进展。有研究运用多重PCR技术检测沙门氏菌，仅需一次反应即可同时检测沙门氏菌的多个特异片段，在节约试剂、减少反应时间、大幅提高灵敏度的同时减少假阳性的出现[10]；多重PCR技术还可以用于同时检测沙门氏菌和其它有害菌，如奇异变形杆菌[11]、溶血性大肠杆菌、兰氏乳杆菌[12]、金黄色葡萄球菌、李斯特氏菌、霉菌[13]、副溶血性弧菌、霍乱弧菌[14]等。还有研究利用巢式PCR的原理通过使用两对不同的引物扩增同一条特异性片段，此法的特异性很高可以检测到最低4 CFU/25 g的沙门氏菌[15]。刘斌等[16]在PCR反应体系中加入人造扩增内标片段，可以有效排除沙门氏菌PCR检测中的假阴性结果，提高检测准确率。为了进一步提高敏感性和特异性，PCR法还可以和其它方法联合使用。比如，将PCR和DNA探针法相结合，该体系可以检测到30 pg以上的沙门氏菌DNA[17]；将PCR法和ELISA法相结合，可以检测到14 pg以上的沙门氏菌DNA[18]；将PCR技术与叠氮溴乙锭相结合，可以避免沙门氏菌检测中因死细菌[19]造成的假阳性结果；将多重PCR技术检测与毛细管电泳成像技术相结合，可以同时对五种病原进行快速检测大幅提高检测效率[20]等等。

食品中致病菌的快速检测是确保食品安全的前提，PCR法为沙门氏菌的检测提供了一种新选择，该方法的应用也为相关标准的制修定提供了理论支撑和技术支撑。由此可以预见，随着社会进步和科学技术的不断发展，PCR技术及其衍生出的新技术与其他诸如生物芯片、免疫磁珠等在食品致病菌检测中的联合使用，既能大大提高检测效率，又能保证分析结果的准确性，必将在食品微生物检测和研究领域开辟一个新的应用时代。