家禽通用型沙门氏菌和3种血清型沙门氏菌PCR检测方法的优化*

康翠翠，蔡晓庆，张妹，陈小娇，王秋月，陈文平

（1.北京市华都峪口禽业有限责任公司，北京 平谷 101206；2.国家蛋鸡产业技术体系平谷综合试验站，北京 平谷 101206）

沙门氏菌是一种常见的危害人与动物的革兰氏阴性菌，目前确定的沙门氏菌血清型已超过2 600种，其中肠炎沙门氏菌是引起人及动物中毒的一种重要血清型沙门氏菌，严重危害人与动物健康。鸡白痢和禽伤寒沙门氏菌不仅可以造成鸡群死亡，还可垂直传播至下一代，对养殖业造成巨大损失。目前，沙门氏菌的检测方法包括选择性增菌培养、血清型鉴定、酶联免疫吸附测定法（ELISA）、生化鉴定和以核酸为基础的聚合酶链式反应（PCR）检测。然而选择性增菌培养、生化鉴定和血清型鉴定耗费时间较长；ELISA法只适合于血清检测；以核酸为基础的PCR法检测时间短、效率高，可以检测各种样品，因此成为目前沙门氏菌检测广受欢迎的一种方法。本文在前人研究基础上，对禽源常见的通用型沙门氏菌和3种血清型沙门氏菌PCR检测程序进行优化，提高检测灵敏度，以期为后期饲料、水源或疾病诊断中沙门氏菌的检出提供更加准确的方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

标准菌株：肠炎沙门氏菌（CVCC3762）和鸡白痢沙门氏菌（CVCC533）标准菌株购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心，-80 ℃保存于本实验室。

材料：营养肉汤购自北京陆桥技术股份有限公司，动物组织/细胞基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司，2×Taq PCR mix、ddHO、DM 2000 DNA Marker均购自北京汇天东方科技有限公司，琼脂糖购自北京索莱宝科技有限公司。

1.2 试验方法

待两株标准菌株融化后，取1 μL菌液放入装有5 mL无菌肉汤培养基的无菌试管中，于恒温箱中37 ℃培养24 h后取出备用。取1.5 mL菌液于2 mL无菌离心管中，12 000 rpm/min，4 ℃离心2 min，弃去上清液，沉淀严格按照动物组织/细胞基因组DNA提取试剂盒说明书提取细菌中的DNA。DNA提取完成后利用超微量分光光度计检测所提取DNA浓度，并将DNA置于-20 ℃保存。

试验中所涉及的引物是根据参考文献设计合成的，具体序列见表1。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。基于鸡白痢沙门氏菌ipaj基因设计的引物来自于中国农业大学徐桂云实验室。

表1 沙门氏菌各血清型引物序列及原始反应程序

1.3 PCR反应条件的优化

原始PCR体系：2×Taq PCR mix 7 μL，前后引物（10 μM）各0.5 μL，DNA 1 μL，ddHO补充至15 μL。通用型沙门氏菌和3种血清型沙门氏菌反应程序见表1。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，利用凝胶成像系统进行分析。

为了确定通用型和各血清型沙门氏菌常规PCR的最佳退火温度，本试验共设计7个不同温度梯度进行扩增反应，通用型沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌的退火温度梯度依次为45.6、49.8、52.4、55.1、57.7、62.1 ℃和64.1 ℃；肠炎沙门氏菌和鸡白痢伤寒沙门氏菌的退火温度梯度为46.6、50.8、53.4、56.1、58.7、63.1 ℃和65.1 ℃。利用各沙门氏菌标准菌株进行试验，PCR扩增结束后，扩增产物用1.0%琼脂凝胶进行电泳，经凝胶成像系统分析后确定最佳退火温度。

在确定最优退火温度后，将体系中引物终浓度分别调整至0.2、0.4、0.6 μM和0.8 μM进行扩增反应，确定其最佳引物浓度。

在确定最佳退火温度及最佳引物浓度的基础上，将体系中的循环数分别按照25、30个及35个进行扩增，确定其引物最佳扩增循环数。

1.4 PCR检测限测定及对比

用ddHO对DNA进行10倍连续稀释，获得终浓度为430.0、43.0、4.3 pg/μL、430.0、43.0、4.3 fg/μL和430.0、43.0 ag/μL共8个梯度的DNA稀释液，分别利用原始反应体系（表1）及优化后的反应体系进行扩增，确定优化前后反应体系的检测限，从而确定该程序是否优化。

2 结果与分析

通用型沙门氏菌程序优化采用肠炎沙门氏菌标准菌株（CVCC3762）和鸡白痢沙门氏菌标准菌株（CVCC533）；鸡白痢沙门氏菌和鸡白痢伤寒沙门氏菌程序优化采用鸡白痢沙门氏菌标准菌株（CVCC533）；肠炎沙门氏菌程序优化采用肠炎沙门氏菌标准菌株（CVCC3762）。

2.1 退火温度的优化

通用型沙门氏菌和3种血清型沙门氏菌程序均按照材料与方法1.3.1中设计的退火温度进行扩增，结果如图1所示。

图1 沙门氏菌退火温度优化结果

鸡白痢沙门氏菌退火温度在45.6～64.1 ℃范围内均可以扩增出目的条带（图1 D），鸡白痢伤寒沙门氏菌在46.6～63.1 ℃范围内可扩增出目的条带（图1 E），通用型沙门氏菌在45.6～57.7 ℃、肠炎沙门氏菌在46.6～58.7 ℃范围内可扩增出目的条带（图1 A～C）。其中通用型沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌和鸡白痢伤寒沙门氏菌的退火温度分别为52.4、52.4 ℃和53.4 ℃时，目标条带相对清晰；肠炎沙门氏菌在50.8 ℃时目标条带相对清晰，因此分别选择50.8、52.4、52.4℃和53.4℃作为肠炎沙门氏菌、通用型沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌和鸡白痢伤寒沙门氏菌引物的最适退火温度进行后续试验。

2.2 引物浓度的优化

在确定最佳退火温度的基础上，分别设计0.2、0.4、0.6 μM和0.8 μM共4个不同浓度梯度的引物进行扩增反应，确定其最佳引物浓度，结果如图2所示。

图2 沙门氏菌引物浓度优化结果

通用型沙门氏菌和3种血清型沙门氏菌引物浓度在0.2～0.8 μM时扩增结果均为阳性，相对而言，引物浓度在0.4～0.8μM范围内，通用型沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌和鸡白痢伤寒沙门氏菌（图2 A，B，D，E）扩增条带均最为明显，而肠炎沙门氏菌的引物浓度在0.6～0.8 μM范围内扩增条带最为明显，因此在后续试验中通用型沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌和鸡白痢伤寒沙门氏菌引物浓度均选择0.4 μM、肠炎沙门氏菌引物浓度选择0.6 μM作为最适引物浓度。

2.3 扩增循环数的优化

按照确定的最佳退火温度及引物浓度，将反应体系分别扩增25、30个和35 个循环，结果如图3所示。其中通用型沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌循环数为25～35，肠炎沙门氏菌和鸡白痢伤寒沙门氏菌扩增循环数为30～35时扩增产物条带较为清晰，因此本试验分别将通用型沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌和鸡白痢伤寒沙门氏菌的最佳扩增循环数定为25、35、30和35进行后续试验。

图3 沙门氏菌扩增循环数优化结果

2.4 检测限

沙门氏菌检测程序优化前后检测限见图4。

图4 沙门氏菌检测程序优化优化前后检测限

通用型沙门氏菌和3种血清型沙门氏菌PCR检测方法优化后，除鸡白痢沙门氏菌外，通用型沙门氏菌、肠炎沙门氏菌和鸡白痢伤寒沙门氏菌检测灵敏度均提高。程序优化前，通用型沙门氏菌检测限为43.0～430.0 pg/μL，优化后通用型沙门氏菌检测限为43.0～430.0 fg/μL。肠炎沙门氏菌优化前检测限为43.0 pg/μL，优化后为4.3 pg/μL。鸡白痢沙门氏菌优化前后检测限无变化，均为430.0 fg/μL。鸡白痢伤寒沙门氏菌优化前后检测限分别为4.3 pg/μL 和43 fg/μL。

3 讨论

鸡白痢和禽伤寒沙门氏菌不仅可以通过水平传播给同批次鸡群，还可以通过垂直传播传递给下一代，通常会造成鸡群高死亡率、产蛋率下降等，给家禽产业造成巨大的经济损失。而肠炎沙门氏菌不仅导致家禽发病，同时存在于家禽肉蛋等食品中，进而导致人类发生食物中毒。因此鸡白痢沙门氏菌和肠炎沙门氏菌的及时检出对于鸡群和人类的安全是至关重要的。然而目前用于检测鸡白痢和肠炎沙门氏菌的方法不仅耗费时间长，对于检测样品也有局限性。研究表明，以核酸为基础的PCR检测方法比传统检测方法更加快捷、准确且操作方便。以核酸为基础的PCR检测方法有普通PCR法和荧光定量PCR法，然而荧光定量PCR法对操作人员、操作环境及设备要求较高、试剂成本昂贵，并不适用于所有机构。因此普通PCR仍是目前快速、准确检测病原的一种主流方式。

目前，对于通用型沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌和肠炎沙门氏菌的检测靶基因有inv A、stn、ompA、ompC、glgC、tcpS、sdf I和SEN1392等。在PCR反应体系中，基于靶基因设计的引物的退火温度、引物浓度和循环数是至关重要的。退火温度一般低于引物Tm值5 ℃，约在50～65 ℃范围内。退火温度太高会影响引物的结合效率，太低会增加引物二聚体和非特异性产物的形成，导致特异性降低。引物浓度需选择适宜的浓度，尽可能使反应特异性和扩增效率达到最高。循环数要足够，避免出现假阴性的情况。任何一个针对靶基因设计的引物序列是不同的，其退火温度、引物浓度和循环数也应随之变化。前人研究中通常使用的引物退火温度为55～60 ℃，引物浓度为0.4 μM，循环数为30，然而此程序是否是引物的最佳扩增程序尚不知道。本研究发现针对不同的引物，其退火温度是不同的；与原先程序及文献中报道的各引物退火温度相比，本研究中最佳退火温度均降低3～6 ℃；引物浓度变化较小，只有肠炎沙门氏菌引物浓度增加至0.6 μM；对于循环数，除通用型沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌外，其它引物循环数均增加了5个。退火温度、循环数等的变化可能与仪器品牌有关。由此说明，对于每一种引物，应对其退火温度、引物浓度及循环数进行探讨，以确保检测结果的灵敏度。

经过优化后，除鸡白痢沙门氏菌外，其它沙门 氏 菌PCR检 测 限 降 至4.3 pg/μL～430.0 fg/μL，提升了10～1 000倍。其中优化后通用型沙门氏菌检测限改善最大，提升了1 000倍。杨林等发现利用相同的引物通过多重PCR法检测肠炎沙门氏菌检测限为162.0 pg/μL，鸡白痢伤寒沙门氏菌检出限为214.0 pg/μL，其检测限均在100.0 pg/μL以上。本研究中肠炎和鸡白痢伤寒沙门氏菌检测限分别为43.0 pg/μL和430.0 fg/μL，远超过前人研究，说明本研究中肠炎沙门氏菌和鸡白痢伤寒沙门氏菌程序优化效果明显。本研究中鸡白痢沙门氏菌在优化前后退火温度、引物浓度及循环数变化较小，其检测限无明显变化。张童利等人优化以SEEP9120_017695基因设计的鸡白痢沙门氏菌引物，其检测限为2.13 pg/μL。本研究中鸡白痢沙门氏菌检测限为4.3 pg/μL，与张童利等人的结果无明显差异，说明鸡白痢沙门氏菌引物程序无明显变化。但本研究中鸡白痢沙门氏菌循环数为30时即可达到检测限，与传统35个循环相比，大大节约了检测时间。

综上所述，对于各种引物，应根据自身实验设备、条件和需求进行程序优化，以便提高检测灵敏度。本研究中，沙门氏菌PCR检测方法优化后，3种血清型及1种通用型沙门氏菌的检测限均降低，检测灵敏度大大升高，为后期环境、饲料及病料中多种沙门氏菌的及时检出奠定了基础。