如何证明植物生物刺激剂的功效声明

申继忠，余武秀

(上海艾农国际贸易有限公司，上海 200122)

已经出台的欧盟肥料法规提出基于功效声明(主张)的植物生物刺激剂定义。“植物生物刺激剂”是指促进植物营养的吸收和转化而不提供营养物质的产品，目的是改进植物的下列特征中的一项或多项: 养分利用效率，对非生物胁迫的耐受性，作物品质性状或土壤和根际土壤中被限制的营养物质的有效性。法规也明确规定了植物生物刺激剂“应具有产品标签上功效声明的效果”[1]。这就使得制造商有责任向监管机构和消费者证明产品功效声明是合理的。因此，对某一特定的植物生物刺激剂证明其农艺学上的功效声明是使其能够被投放到市场的重要因素。

目前全世界范围内生物刺激剂的监管还都处于起步阶段，有很多问题尚待明确。中国目前尚无生物刺激剂的官方定义，更没有专门的监管措施[2]。因此，作为刺激剂产品都是厂家自己的功效声明，市场上的生物刺激剂产品也相对混乱。生物刺激剂的有效成分可能具有多种生物活性，功效声明其具有刺激剂作用必须有充分的证据，这些证据可以来自田间验证试验、现有文献等多个方面。但是功效声明具有刺激剂作用必须遵守一定的原则，否则就会产生混乱。这方面的工作，目前只有欧盟和美国在进行中。欧盟生物刺激剂工业委员会(EBIC)提出了功效声明产品具有刺激剂作用应遵守的一般性原则，目的是为欧洲肥料法规中生物刺激剂产品制定标准提供参考[2]。美国环保署发布了“植物生长调节剂包括生物刺激剂产品标签声明指导草案(2019)”[3]以及“植物生长调节剂包括生物刺激剂产品声明指导草案(2020)”[4,5]。本文仅就EBIC 提出的“证明生物刺激剂功效声明的一般原则”作简要介绍，以供国内主管部门和业界参考。

1 欧盟肥料法规

新的欧盟肥料法规于2019 年6 月25 日发布，2019 年7 月15 日开始生效，2022 年7 月16 日开始全面实施[1]。

新的肥料法规将生物刺激剂纳入肥料管理范畴，与植物保护产品(农药)分开监管。新的欧盟肥料法规涵盖6 种产品(肥料、石灰质材料、土壤改良剂、生长介质、抑制剂、植物生物刺激剂)以及它们的组合物(表1)。其中生物刺激剂包括微生物刺激剂和非微生物刺激剂。在此法规中，没有微生物肥料的概念，说明此类物质都可以归入微生物类刺激剂。

表1 欧盟肥料法规包括的肥料产品类别[1]

欧盟肥料法规还对每类产品所使用的原材料进行了规范，共分为11 类原材料(表2)。其中第7 类(CMC 7)是微生物类生物刺激剂推荐使用的微生物种类。当然在实际生产中，也可以使用其他类微生物。

表2 欧盟肥料产品原料组分分类(CMCs)[1]

续表2

2022 年7 月16 日之前，还需要为法规的实施制定一系列执行标准。这项工作由欧洲标准化委员会负责。

欧洲标准化委员会(CEN)专门制定欧洲标准(ENs)，适用于整个欧洲单一市场。CEN 汇集了34个国家的国家标准机构和由数千个来自商业联盟、商业和消费者的技术专家组织、环境团体和其他社会利益相关者。它被欧洲委员会授权开发标准支持肥料产品法规的实施，在这种情况下CEN 于2017年创建了CEN/TC 455 植物生物刺激剂技术委员会，专门负责开发生物刺激剂相关标准(表3)。法国标准化协会(AFNOR)被指定为CEN/TC 455 第二工作组(WG 2)的负责机构，专门制定生物刺激剂功效声明的标准(表3)。

表3 CEN/TC 455 生物刺激剂技术分委会和工作组[6,7]

2 证明植物生物刺激剂功效声明的一般原则

2.1 生物刺激剂的定义及其对功效声明的要求

植物生物刺激剂的定义是基于产品功效声明的(欧洲委员会，2016；欧盟理事会，2018)，意思是用产品功能而不是用产品所含的成分来定义生物刺激剂。因此，证明一种产品确实是真正的生物刺激剂取决于对它的效果的证明。但是，这不能被视为要求保证产品具有特定水平的效果。在任何情况下，将生物刺激剂投放欧盟市场都不应被视为保证在所有条件下的有效性，因为许多因素可能会影响生物刺激剂在现场的性能。

制造商应该提供足够可信的数据，而不是让这个过程变成不必要的负担。为产品功效声明提供可靠的科学支持是欧洲生物刺激剂工业理事会(EBIC)工作的核心原则之一，而EBIC 也从其他部门的产品功效声明证明中获得了灵感。但是，其他类别产品的现有功效声明论证程序不能以复制/黏贴的方式自动应用于生物刺激剂，原因有：⑴ 现有生物刺激剂产品(包括微生物和非微生物产品)具有多样性以及随之而有的广泛的功效声明；⑵ 生物刺激剂的功效受多种环境因素的影响；⑶ 生物刺激剂成分之间的相互作用，以及生物刺激剂本身与其他系统因素(如天气、土壤微生物群、土壤类型、作物品种等)之间的相互作用都对其功效有影响。

为了促进提供高质量数据支持生物刺激剂的功效声明(无论是为了投放市场还是商业用途)，EBIC与主要利益攸关方共同制定指导方针，汇编生物刺激剂的可靠数据，以便获得一致和可靠的结果。

欧洲生物刺激剂工业理事会已经确定有必要制定指导方针，以满足2 个层面的要求：⑴ 生成支持生物刺激剂功效声明的数据；⑵ 使用数据支持将生物刺激剂投放欧盟市场和/或支持商业产品功效声明。

那么需要多少数据来支持产品功效声明呢?这取决于功效声明的作用多少。功效声明范围越窄，所需的数据就越少。考虑到产品效果、作物或作物分组和生长条件的多样性，制造商需要灵活设计适应特定农艺状况的试验研究。此外，应该认识到，当涉及到提高营养物质有效性的产品(特别是微生物)时，土壤类型和条件可能比作物类型本身更重要。因此，需要灵活的试验设计来适应这种情况。

产品功效声明的理由应集中在欧盟的生物刺激剂定义上。为了将产品投放欧洲市场，所有功效声明均应证明与欧盟肥料法规(欧洲委员会，2016 年；欧盟理事会，2018 年)之生物刺激剂定义中的4 种功效声明之一：提高养分利用效率、对非生物胁迫的耐受性、作物品质特征或土壤和根际被限制养分的可获得性。

由于每一类功效声明都相当宽泛，表4 给出了各类功效声明的更精确描述，以使每一类功效具体化并便于执行。

表4 生物刺激剂的功效声明类别及子类

此外，这些影响通常会转化为对农民有价值的建议。例如提高产量(这在欧盟肥料法规中没有明确提到，但可能是使用任何生物刺激剂产品的结果)和提高作物质量(这是生物刺激剂的作用)。虽然产量收益可以追溯到法规中所定义的生物刺激剂功效声明中的一种，但EBIC 已将其列为单独一类功效声明，以确保以恰当的术语描述并显示其功效。

2.2 可支持功效声明的信息类型

各种类型的数据和经验证据可以支持生物刺激剂的功效声明。可以从已发表的文献和现有数据开始，然后根据需要再使用来自控制条件和田间试验的新实验数据来补充这些信息是有意义的。

在控制条件下(温室、生长室、表型等)从欧盟以外产生的数据应该是允许的，如果测试的气候条件可以适用于欧盟内部，而且：⑴ 如果它来自制造商自己的GEP/GLP-认证的设施；⑵ 如果产生数据的独立研究合作伙伴(合同设施、大学等)被认为是有信誉的；⑶ 如果制造商能够证明所获得的方法和数据的质量与GEP/GLP-认证的设施所能达到的质量基本相当。

2.2.1 使用已发表的文献和现有数据

同行评议的科学文献可以支持生物刺激剂功效声明。微生物的生物学文献可以用来描述产品的作用方式，或为支持所提出的功效声明而进行的任何已发表的相关论文中描述的初步研究等都可以采用。质量可接受的科学文献可用于支持功效声明。文献质量可以根据Klimisch 等人(1997)描述的毒理学和生态毒理学试验数据质量系统评估方法进行评估，并确定是否可为欧盟化学立法(REACH)的数据要求所接受。需要注意的是，产品内部物质组合起来可能产生各种协同效应或出现的新效应，此时仅靠文献本身就不太可能充分证明这种功效声明。

现有的科学信息和现有的田间试验数据应按照欧洲化学品管理局(ECHA)为实施欧盟化学品法规(REACH)而定义的相关性、可靠性和充分性标准进行评估后方可采用(欧洲化学品管理局2011)。

2.2.2 试验数据

生物刺激剂的功效声明可以由受控条件下(实验室、温室、生长室、表型等)和/或田间(田间试验)条件下产生的试验数据支持。来自精心设计的小型实验室和生长室研究的额外数据往往构成所提供的功效声明理由的重要组成部分。如果使用田间数据，至少必须包括一些欧盟境内的试验数据。如果来自欧盟以外的田间数据都是在与欧盟相似的地理气候条件下生成的(并且与产品使用的预期环境相对应)，则可以为欧盟所采纳。可以参考现有的“确定地理气候条件可比性的指南文件(欧洲和地中海植物保护组织，2014)”确定来自欧盟以外的数据是否合乎要求。

田间试验可提供生物刺激剂在真实条件下作用效果的必要信息。然而，对于某些功效声明如耐受盐胁迫或冷胁迫的能力，都很难人工模拟合适的田间胁迫的实际情况。在这种情况下田间试验的重点将更多地放在刺激剂对作物产量/质量等“整体”效益的影响上。而与刺激剂作用方式有关的功效声明的具体内容可在受控条件下得到验证。比如可以证明在受控的温室或实验室条件下使用生物刺激剂产品可增加磷素的可获得性，并向农民证明使用相同的产品可提高产量和/或质量这一总体效益。如果制造商只想要证明某生物刺激剂产品能溶解磷，而不想证明其随后能提高产量和/或质量，就不需要进行田间试验。

在考虑了生物刺激剂的积极和消极影响后，其农业净效益必须足以证明使用刺激剂产品的合理性。某个产品的使用效益必须与该产品设定的使用环境相适应。在某些情况下，可以接受低水平的效益，例如：⑴ 当产品将作为作物综合管理(ICM)计划的组成部分使用时，或⑵ 在特殊情况下，如有机农业生产，或在减少养分使用的同时因使用生物刺激剂产品还能保持相同的产量或质量水平的情形。

如果试验数据表明产品效果出现显著的不一致，那么就必须对不一致的原因加以解释。产品使用说明要让用户明确在什么条件下能让产品表现出最佳效果，以及哪些因素会影响产品的有效性。原因不明的产品性能的变化不应阻碍产品投放市场，但在这种情况下产品功效声明的不确定性应该在产品标签上说明。透明度对于农民做出明智的选择至关重要。

3 生物刺激剂试验/测试的总指导

通用指南统计程序的使用应适用于田间试验软件(如ARM)。

3.1 试验研究计划

试验研究计划应包括以下内容：⑴ 试验目的；⑵ 统计分析和试验设计；⑶ 试验条件；⑷ 田间试验的设计和布局；⑸ 对照数据；⑹ 刺激剂处理的应用；⑺ 评估方式。以下分别详述这些内容。

3.1.1 试验目的

⑴ 试验的目的和试验场地的基本信息：应具体规定试验的目标，包括待验证的生物刺激剂的功效以及在试验中纳入其他变量(使用剂量、使用条件)；⑵ 试验是否为评估某种功效声明或其他目的(发芽试验、收获产品的质量、对后续作物的影响等)；⑶ 应提供关于试验地点的基本信息，包括完整的地址和地理坐标(如果可能)，作物和品种，关于试验地的任何有用的细节(例如光照和坡度)。

3.1.2 统计分析和试验设计

将生物刺激剂投放市场绝不应被认为是保证它在所有条件下都有效，因为许多因素可能会影响生物刺激剂的田间表现。还有许多其他因素与生物刺激剂产品有关。这些可能包括：⑴ 提供与作物综合管理系统和/或有机农业兼容的方法；⑵ 与栽培实践有更大的兼容性；⑶ 减轻替代生产系统的不良影响(对人类、有益生物、非目标生物、其他作物等)。

在这种情况下，生物刺激剂制造商应确保能够向用户提供有关产品性能的准确信息，并就如何最佳使用该产品提供建议，以使其尽可能有效和经常地发挥作用。

考虑到生物刺激剂的作用性质以及它们内在的可变性(从生理和生物敏感性到土壤气候条件，当地微生物多样性和作物遗传特性)，在受控的条件下(温室或实验室)与未经处理的对照相比可以将置信水平设置在90% (在受控条件下的最低农艺生产试验)。

为证明生物刺激剂的功效声明，至少要在欧盟进行3 次田间试验。在田间试验中，与未经处理的小区相比，如果观察到生物刺激剂表现出经常的“农学上”的积极作用趋势(不一定具有统计学上的显著性)，可以认为这足以支撑生物刺激剂的功效声明。

如果在一个季节内且在不同的地理气候条件下(与产品销售和使用地的环境条件和农艺条件相似)进行足够的试验证明功效声明是合理的，那么试验就不需要经过多个季节的试验。这些试验应该在欧盟进行。

试验设计应该以能区别处理区和未处理区的方式进行。建议有足够的重复，以确保减少数据的可变性和增加观察到处理区和未处理区之间经常性差异的机会。

如果生物刺激剂的性能受温度、土壤类型、作物或其他参数的影响，那么试验设计、执行和后续用户建议都应考虑这些因素。

如果试验设计得当，可以在一次试验中证明多种功效声明。

在产量和质量方面，未经处理的小区试验结果应反映当地生产的正常农艺预期。

研究计划应详细说明评估的内容、评估的方式、评估的时间和原因。

建议至少评估农民所关心的某一个可测量指标(如对产量和/或质量的影响)。例如，根结形成是早期的可测量的参数，但它本身不足以确认对作物产量和/或质量的影响。如果在所设计的试验中没有评估拟声明的某种生物刺激作用，那么这个作用就不能在标签上作为功效声明。例如，能增加根生长的功效声明会在试验中得到证明，但作物产量增加在试验中没有量化。此时，标签可以声称“增加了根系生长”，但不能声称“能提高产量”，因为产量的增加没有得到数据证明。

生物刺激剂对植物的药害应在试验中加以验证。如果没有观察到植物药害的证据，那么就没有必要进行额外的植物药害试验。但是，如果有植物药害的迹象，则需要植物药害数据。至少，当使用生物刺激剂时，制造商应该提供关于如何将植物药害降到最低的建议。

来自GEP/GLP 认证设施的数据可以被认为是可靠的，即使这些设施是属于制造商的(即非第三方机构)。尽管如此，还是希望制造商能证明至少某些研究是由公正和合格的第三方提供的。尽可能多地由独立和有能力的合作伙伴进行试验以支持产品功效声明，这些合作伙伴可以是⑴ 国家研究机构和推广官员；⑵ 在农业和农学领域发表研究成果的机构(包括但不限于大学、其他高等院校和私人研究机构)和研究人员；⑶ 经认证的私人研究中心(GLP/GEP或GLP/GEP 等效条件)。

3.1.3 试验条件

应充分说明土地和作物的有关情况，例如：⑴ 对于一年生作物，播种或种植日期、密度、行距；⑵ 对于多年生作物，行的排列和间距或单株种植、修剪或整枝方式、砧木、冠层高度、株宽、年龄、生产过程中的天气；⑶ 对于温室作物，可以在栽培箱内、试验台上、水培养液中栽培等；⑷ 需要描述作物的栽培方法，如耕作、肥料和灌溉制度，以及任何其他额外的投入；⑸ 应说明作物在进行生物刺激剂处理时是在正常条件下生长还是在有胁迫(如干旱、霜冻、风或其他整体化学处理的影响，和/或其他有害生物如病害和杂草的影响)存在的条件下生长的；⑹ 对于土壤使用的生物刺激剂产品，应至少在试验的第1 个月每隔2 h 记录表层土壤在根区层面的温度；并应描述土壤特征，如砂土、黏土、粉砂土和有机质百分含量，以及pH 等。

3.1.4 田间试验设计和布局

试验小区的设计和布局应加以描述，最好附有平面图，小区的数量、大小和形状，无论是由小区在地面上的尺寸确定的还是由特定的植物布局确定的都可以。

应指明试验设计的类型。为未经处理的对照所作的安排应被准确地标出，以及任何其他对照方式的细节。

在保证科学设计的同时，试验小区应确保完全随机区组排列，以避免试验小区之间试验条件可能带来的任何干扰(例如在干旱胁迫缓解试验中，必须将充足供水的试验带置于试验处理的旁边作为参考)。

在试验中应保证有足够的重复，以获得12 个自由度，这样就可以证明经处理和未经处理的作物之间是否存在经常的差异。

3.1.5 对照数据

对照数据集可以是来自完全未经处理的小区，也可以来自所谓的“漏验”组(omission group)。漏验组与处理组方案相同，只是不用生物刺激剂。

为证明用于“改进营养摄取”这一功效声明要求设置的对照类型应包括：⑴ 未经任何处理的对照。⑵ 当生物刺激剂产品中含有营养素时，需要设置如下之一作为对照组，选择1：如果“支持组”提供营养元素，则单独使用“支持制剂”；选择2：不含营养元素的生物刺激剂制剂单独使用。⑶ 当产品功效声明包括抵抗非生物胁迫时，对照应包括：有胁迫的对照、无胁迫的对照、胁迫水平的表述。

3.1.6 刺激剂处理的应用

应提供有关试验产品的配方、使用方法、浓度和数量的准确信息。

为证明生物刺激剂功效声明的正当性，应以达到预期效果所需的最低推荐剂量进行试验。然而，这对于产品组成主要是环境中自然存在的物质的生物刺激剂产品可能不那么重要，除非添加量显著超过了现有的自然本底水平。此外，对于某些生物刺激剂(例如微生物生物刺激剂)，最低有效剂量的概念可能更难以在实际中确定，而一个剂量范围则可能更适合证明相关的功效声明。在这种情况下，当需要对建议的剂量作出适当解释时，可能没有必要提供田间产生的数据。这种解释应涉及微生物的作用方式和生物学，还可以包括为推荐制剂浓度和/或使用剂量提供基础的任何初步研究(包括相关已发表的同行评价论文)。

虽然制造商应该总在寻求证明推荐剂量的合理性，但缺乏精确或常规的剂量验证数据不能成为阻止生物刺激剂投放市场的理由。在此情况下，制造商根据实验室或田间试验获得的有效数据提供证明获得有益影响所需的最低剂量的信息可能就足够了。

⑴ 测试和参考产品：应给出试验(测试和参考)中包含的产品的信息，包括通用名称或其他指定标准(如果有)，以及每个制剂产品的确切名称或其他名称。

⑵ 使用方式：应提供如下信息以确保田间试验遵循了良好农业规范：①使用的方法和设备；②任何与预期剂量的显著偏差；③可能影响产品功效声明的操作条件(例如喷雾压力、喷嘴类型、喷雾质量和喷雾器的移动速度)；④使用次数；⑤每次使用的日期(包括年份，最好使用日-月-年格式表示使用日期)；⑥每次使用时作物的生长阶段(见BBCH 生长阶段关键词)；⑦使用剂量(mL/hm2，g/hm2或L/hm2, kg/hm2)和喷雾量(L/hm2)。

⑶ 气象数据：应记录下列气象资料：①试验员在使用刺激剂当天前后观察得到的气象资料可能影响试验结果。这取决于试验者的判断，但不需要提供像使用当天那样详细的气象资料。②必须提供试验人员在使用生物刺激剂的当天观察的气象资料，包括某些标准数据(温度、湿度、风速)；如果在叶面使用后24 h 内下雨，应予记录(涉及到产品的耐雨水冲刷性)。

⑷ 试验期间还应记录土壤数据。

3.1.7 评估方式

⑴ 评估的类型、时间和频率。⑵ 每次评估的类型和日期。⑶ 应描述使用的方法。使用的任何评估标准(尺度)都应加以说明。⑷ 对作物的直接影响。应注意每个试验小区是否存在植物药害，并准确描述所有药害症状，例如发育周期的变化、颜色变化、坏死、变形、对植物的产量和质量的影响。⑸ 当需要产量和质量数据时，应仔细记录每一种作物所需的具体参数。

3.2 试验报告

试验报告应包括：⑴ 试验目的；⑵ 供试产品和参考产品清单，包括剂量和使用次数；⑶ 评估方式；⑷ 试验结果，包括统计分析(如有)。

3.3 进行生物刺激剂田间试验的作物分组

当进行证明生物刺激剂功效声明的试验时，可参考表5 中列出的作物分组建议，选择需要试验的作物。欧洲生物刺激剂工业委员会(EBIC)建议的指导方针(表6)，可以帮助制造商确定需要的试验次数，试验次数需要视实验性质而定，并要防止评审当局对试验的过多要求。尽管已有这样的指导方针，但是制造商仍然可能需要根据特定的刺激剂功效声明调整试验。

表5 为证明生物刺激剂功效声明的作物分组建议

表6 为证明刺激剂功效声明所需要的试验次数

在适当的情况下，可以用适当的科学文献代替所建议的一个或多个试验。

4 结 论

一种产品的生物刺激剂作用需要通过其试验效果来证明，但这不是为了保证产品具有特定水平的效果。在任何情况下，都不能认为投入市场的生物刺激剂产品必须在所有情况下都有效，因为许多因素可能会影响某种生物刺激剂在田间的表现。对证明产品功效声明的要求应与任务成比例；制造商应该提供足够可信的数据，但又不能使之成为制造商不必要的负担。功效声明范围越窄，所需的数据就越少。考虑到可能的影响、作物或作物分组和生长条件的多样性，制造商需要灵活设计适应特定农艺情况的试验方案。此外，还应认识到，对于目的在于改善营养物质供应的产品(特别是微生物类刺激剂产品)而言，土壤类型和土壤条件在设计试验时可能比作物类型本身更重要。随着刺激剂产品向复杂、多组分的方向发展，田间试验将变得更加重要。要证明刺激剂产品的多重效应，特别是协同效应或新出现的效应时，则对试验设计有更高的要求。

欧洲标准化委员会(CEN)已经开始研究过程和方法，这些过程和方法将成为一套统一的欧洲标准的基础，根据欧盟肥料产品新法规来证明生物刺激剂的功效声明。这项工作包括标准的名称、生物刺激剂规格、标签、测试方法、验证产品功效声明和安全要求等。

由EBIC 制定并在本文中概述的一般原则可以为CEN 关于功效声明论证的相关标准的起草提供参考，因为这些原则的提出得益于参与生物刺激剂产品功效声明测试的专业人士之间的重要讨论。