绵羊CCL19基因启动子活性分析及其转录调控元件筛选

翟 哲,陈 思，吴艳茹，王雪梅，李崇瑞，刘志勇，陈巧玲，王凤阳，杜 丽，李 昌，金宁一

（1.海南大学动物科技学院，海南省热带动物繁育与疫病研究重点实验室，海口市动物基因工程重点实验室，海口 570228；2.军事医学研究院军事兽医研究所，长春 130122）

趋化因子C-C基序配体19（C-C motif chemokine ligand 19，CCL19）基因编码的CCL19蛋白是机体内诱导T细胞活化、免疫耐受和炎症反应的关键调节因子，在机体免疫监测、维持机体稳态中发挥重要作用[1]。在动物体内，CCL19主要由淋巴结内的网状细胞分泌，也能够由中性粒细胞和巨噬细胞分泌[2-3]。CCL19通过与趋化因子C-C基序受体7（C-C motif chemokine receptor 7，CCR7）形成异源二聚体，诱导携带抗原的树突状细胞和淋巴细胞迁移至淋巴器官，从而启动适应性免疫应答，并同时促进淋巴细胞迁移、血小板激活、细胞骨架重排等生物学过程。研究表明，CCL19是唯一能够有效刺激CCR7磷酸化、内化的趋化因子，可导致受体脱敏和抗原递呈树突状细胞的迁移，同时还可以有效促进β-抑制蛋白募集[4-5]；CCL19可作为血小板激活过程中释放的可溶性趋化因子，是血液高凝状态下的标志物，可以诱导单核细胞聚集到病变部位，从而促进炎症反应[6-7]；CCL19还可以通过促进金属蛋白酶家族MMP-2、MMP-9的表达使细胞骨架重排和上皮细胞间充质转化，从而诱导免疫细胞向炎症部位迁移[8]。因此，CCL19被认为是通过调控炎症细胞迁移的方式促进炎症反应，启动适应性免疫应答和先天性免疫应答的重要趋化因子。最新研究表明，CCL19在肥胖机体内的脂肪组织中表达量增加，并参与代谢与局部炎症，提示CCL19可能是代谢炎症及抑制胰岛素表达的标志物[9]。

绵羊是一种对外界环境因素有较强适应能力的反刍动物。中国绵羊品种资源丰富，分布范围广泛，生活环境复杂[10-12]。不同品种绵羊对于疾病的抵抗力差异较大。因此，研究绵羊免疫相关基因功能及其作用机制，筛选和发掘绵羊免疫基因，对于探索绵羊的环境适应性以及免疫保护机制极为重要[13]。CCL19是重要的免疫基因，目前相关研究多集中在以人和小鼠为模型，启动适应性免疫应答、先天性免疫应答及炎症反应功能等方面，而关于绵羊该基因在表达调控、炎症反应等方面的机制研究相对较少。因此，本研究利用生物信息学分析绵羊CCL19基因启动子序列，预测其转录因子结合位点，确定启动子的核心启动子区域，鉴定对CCL19基因起关键转录调控作用的转录因子，以期为揭示绵羊CCL19基因的转录调控模式，阐明其在绵羊炎症反应和启动适应性免疫应答等方面的作用提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品采集

采集2只10月龄雌性健康小尾寒羊的颌下淋巴结组织，-80 ℃保存备用。

1.2 主要试剂

组织基因组DNA提取试剂盒、2×PfuPCR MasterMix、DL2000 DNA Marker、1 kb DNA Ladder、DNA胶回收纯化试剂盒、大肠杆菌DH5α感受态细胞、（无内毒素）质粒提取试剂盒、质粒小提试剂盒均购自天根生化科技（北京）有限公司；产物纯化试剂盒及定点突变试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司；T4 DNA连接酶、Lipofectamine®2000及限制性内切酶SacⅠ、Hind Ⅲ、Kpn Ⅰ均购自Thermofisher公司；胰蛋白酶、胎牛血清均购自Gibco公司；1×PBS缓冲液、DMEM高糖培养基均购自Boster公司；双荧光素酶基因内参pRL-TK载体、双荧光素酶报告基因检测试剂盒（Dual-Luciferase®Reporter Assay System）均购自Promega公司；氨苄青霉素购自北京索莱宝科技有限公司；pGL3-Basic质粒、pcDNA3.1-EGFP质粒均由海南省热带动物繁育与疫病研究重点实验室保存。

1.3 CCL19基因生物信息学分析

根据GenBank中绵羊CCL19基因序列（登录号：NC_040253.1）、CCL19基因转录起始位点（TSS）的位置及Ensembl数据库，选取绵羊CCL19基因5′-UTR上游1 000 bp作为CCL19基因启动子序列。利用转录因子在线分析软件JASPAR、PROMO预测CCL19基因启动子区域的转录因子结合位点；利用Promoter 2.0在线软件分析CCL19基因启动子的序列特征；利用MethPrimer软件预测CCL19基因启动子CpG岛；利用RepeatMasker程序预测序列的重复元件；利用FPROM在线软件分析TATA-box，具体软件信息见表1。

表1 生物信息学分析软件Table 1 Bioinformatics analysis softwares

1.4 CCL19基因启动子报告质粒构建

利用组织基因组DNA提取试剂盒提取绵羊颌下淋巴结组织基因组DNA，-20 ℃保存备用。利用DNAMAN软件设计CCL19基因启动子全长引物，下游引物不变，再设计各截短体上游引物，引物序列及酶切位点见表2。引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

利用表2特异性引物通过PCR扩增绵羊CCL19基因启动子序列及各截短体，序列分别命名为pGL3-P、P1、P2、P3、P4、P5、P6。PCR反应体系50 μL：2×PfuPCR MasterMix 25 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板2.5 μL，ddH2O补足体系。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸（延伸时间见表2），共30个循环；72 ℃延伸5 min；4 ℃保存。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，胶回收目的片段。利用SacⅠ和Hind Ⅲ分别对启动子1 000 bp序列及pGL3-Basic双荧光素酶质粒进行双酶切。 利用KpnⅠ和Hind Ⅲ分别对各截短体序列及pGL3-Basic双荧光素酶质粒进行双酶切。双酶切体系20 μL：载体/目的片段1 μg，SacⅠ/KpnⅠ和Hind Ⅲ各1 μL，Buffer 1 μL，ddH2O补足体系。37 ℃反应2 h，利用胶回收纯化试剂盒进行产物纯化回收。将纯化得到的目的片段与线性化质粒通过T4连接酶22 ℃连接2 h，重组载体转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，通过菌落PCR鉴定挑选出阳性单克隆菌落。过夜摇菌扩大培养，提取质粒后进行双酶切鉴定。 将重组质粒送至北京六合华大基因公司测序。测序正确的阳性单克隆菌液过夜培养，利用去内毒素的质粒提取试剂盒提取质粒准备转染293T细胞。

表2 CCL19基因启动子引物Table 2 Primers of CCL19 gene promote

1.5 293T细胞培养及转染

将293T细胞接种于含10%胎牛血清（FBS）的高糖DMEM培养基的培养皿中，在37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养。将细胞以2×104/孔的密度接种于96孔板中，12 h后当细胞密度达到90%时，将完全培养基换成无血清培养基后进行转染。其中Lipofectamine®2000体积与pGL3-Basic重组质粒/转录因子质量比为0.5 μL∶200 ng，pGL3-Basic截短体重组质粒/转录因子结合位点缺失质粒与pRL-TK质粒共转染的质量比为200 ng∶4 ng。以pGL3-Basic质粒为阴性对照、pcDNA3.1-EGFP质粒为阳性对照鉴定转染效率，每组设3个重复。转染6～8 h将无血清培养基换成完全培养基，继续培养至48 h观察荧光。

1.6 CCL19基因启动子活性分析

293T细胞转染48 h后进行双荧光素酶检测。利用双荧光素酶报告基因检测试剂盒（Dual-Luciferase®Reporter Assay System）和Spark®多功能微孔板检测仪检测萤火虫荧光素酶（F值）和海肾荧光素酶（R值）。通过计算萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的比值（Luc）检测相对荧光活性，从而确定绵羊CCL19基因的核心启动子区域及重要的转录因子结合位点。

1.7 转录因子结合位点定点突变

利用在线软件预测核心启动子区域转录因子结合位点，并设计转录因子结合位点定点突变引物（表3）。根据定点突变试剂盒说明书构建转录因子结合位点突变质粒。以pGL3-P5重组质粒为模板进行PCR反应，PCR反应体系同1.4。PCR反应条件：95 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火1 min，68 ℃延伸10 min，共18个循环；68 ℃延伸10 min。DpnⅠ限制性内切酶37 ℃酶切1 h，用DNA胶回收纯化试剂盒纯化酶切产物，与载体连接后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，菌液PCR鉴定后过夜培养，提取质粒进行酶切鉴定阳性单克隆，送往深圳六合华大基因公司测序。测序正确的阳性单克隆菌过夜培养，用去内毒素的质粒提取试剂盒提取质粒准备转染293T细胞。构建成功的转录因子结合位点缺失载体命名为pGL3-转录因子。

表3 转录因子结合位点的突变引物Table 3 Mutated primers for transcription factor binding sites

1.8 数据统计分析

所有试验均重复3次，采用GraphPad Prism 8.0软件分析数据，采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）方法检验数据，结果以平均值±标准误表示，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结 果

2.1 CCL19基因启动子生物信息学分析

通过NCBI数据库下载绵羊CCL19基因启动子序列（-958/+42 bp），通过RepeatMasker软件预测发现，CCL19基因启动子序列无重复元件；采用Methprimer软件预测发现，CCL19基因启动子序列无CpG岛；利用FPROM在线软件预测发现-678/-671 bp处有TATA-box（图1）。利用Promoter 2.0软件预测发现，绵羊CCL19基因-546 bp为启动子位置，分值为0.582。利用在线软件对绵羊CCL19基因启动子进行转录因子结合位点预测，存在POU5F1、IRF家族、NF-1等转录因子结合位点（图2）。

图1 绵羊CCL19基因启动子甲基化位点和TATA-box分析Fig.1 Analysis of methylation site and TATA-box of CCL19 gene promoter in sheep

横线或方框处为潜在转录因子结合位点。图6同Potential transcription binding sites are underlined or box.The same as fig.6图2 绵羊CCL19基因启动子转录因子结合位点预测Fig.2 Transcription factor binding sites prediction of CCL19 gene promoter in sheep

2.2 CCL19基因启动子报告质粒构建及活性分析

基于预测的转录因子结合位点，采用DNAMAN设计引物CCL19-P/P1/P2/P3/P4/P5/P6对启动子序列进行PCR扩增，PCR产物通过1.0%琼脂糖凝胶电泳检测以及胶回收获得7条逐段截短的CCL19基因启动子序列（图3）。经过双酶切、连接、转化、过夜摇菌及提取质粒，双荧光素酶重组质粒经过双酶切鉴定发现，各重组质粒（pGL3-P、pGL3-P1、pGL3-P2、pGL3-P3、pGL3-P4、pGL3-P5及pGL3-P6）均出现两条带，其中一条目的片段大小分别为1 000、898、808、650、466、298及228 bp，另一条片段为pGL3-Basic质粒片段4 818 bp（图4）。将酶切正确的重组质粒送测，对测序结果用DNAMAN软件进行比对，发现各截短体序列与NCBI上CCL19基因启动子序列一致，证明双荧光素酶重组质粒构建成功。

P～P6，系列截短的片段；M，DL2000 DNA MarkerP-P6，A series of truncated segments；M，DL2000 DNA Marker图3 绵羊CCL19基因启动子不同截短片段的PCR扩增结果Fig.3 PCR amplification results of different truncated fragments of CCL19 gene promoter in sheep

P～P6，双荧光素酶质粒pGL3-P～pGL3-P6双酶切鉴定结果；M，DL2000 DNA MarkerP-P6，Results of double luciferase plasmids pGL3-P to pGL3-P6 digested by double enzymes；M，DL2000 DNA Marker图4 绵羊CCL19基因启动子的双荧光素酶重组质粒电泳图Fig.4 Electrophoresis diagram of double luciferase recombinant plasmid of CCL19 gene promoter in sheep

利用Lipofectamine®2000将构建成功的7个双荧光素酶报告载体（pGL3-P、pGL3-P1、pGL3-P2、pGL3-P3、pGL3-P4、pGL3-P5及pGL3-P6）瞬时转染293T细胞，48 h后进行双荧光素酶报告基因系统检测各截短体的相对荧光活性，结果显示，随着CCL19基因启动子逐渐截短，相对荧光活性也逐渐降低，随后略微升高后再极显著降低（P<0.01，图5）。表明在启动子-958/-857、-856/-767 bp中存在增强启动子相对荧光活性的转录因子结合位点。当截短到-256/-186 bp时，相对荧光活性变化最大。说明绵羊CCL19基因启动子1 000 bp序列具有调控基因转录的功能，且-256/-186 bp为启动子核心启动子区域。

**，差异极显著（P<0.01）。图8同**，Extremely significant difference （P<0.01）.The same as fig.8图5 绵羊CCL19基因启动子不同截短片段的相对荧光素酶活性检测Fig.5 Relative luciferase activity detection of different truncated fragments of CCL19 gene promoter in sheep

2.3 转录因子结合位点定点突变及活性分析

利用JASPAR和PROMO在线软件对绵羊CCL19基因核心启动子区域进行转录因子结合位点预测，结果显示，共存在POU5F1、ZBTB26、FOXI1、GLI2和SP2 5个关键转录因子结合位点（图6）。以CCL19-P5重组质粒为模板，PCR扩增出5个不同的转录因子结合位点缺失的重组质粒pGL3-POU5F1、pGL3-ZBTB26、pGL3-FOXⅠ1、pGL3-GLI2及pGL3-SP2（图7A）。经双酶切鉴定和测序发现，构建的pGL3-转录因子重组质粒的目的片段序列与预期缺失序列一致（图7B）。

图6 绵羊CCL19基因启动子的核心启动子区域的转录因子结合位点预测Fig.6 Transcription factor binding sites prediction in the core region of CCL19 gene promoter in sheep

1～5，CCL19基因转录因子（POU5F1、FOXI1、ZBTB26、GLI2、SP2）结合位点缺失的PCR产物；M1，1 kb DNA Marker；6～11，CCL19基因结合位点缺失载体pGL3-POU5F1、pGL3-FOXI1、pGL3-ZBTB26、pGL3-GLI2、pGL3-SP2和CCL19-P5的双酶切图；M2，DL2000 DNA Marker1-5，PCR product of deletion loop expansion of CCL19 gene transcription factor（POU5F1，FOXI1，ZBTB26，GLI2 and SP2） binding sites；M1，1 kb DNA Marker;6-11，Dual enzyme digestion diagram of CCL19 gene binding site deletion vector（pGL3-POU5F1，pGL3-FOXI1，pGL3-ZBTB26，pGL3-GLI2，pGL3-SP2 and CCL19-P5）；M2，DL2000 DNA Marker图7 绵羊CCL19基因核心启动子区域转录因子结合位点缺失载体的PCR（A）和双酶切（B）电泳图Fig.7 Electrophoresis diagram of loop expansion （A） and double restriction （B） with deletion vectors of transcription factor binding sites in the core region of CCL19 gene promoter in sheep

将5个缺失成功的双荧光素酶报告载体分别与pRL-TK质粒共转染到293T细胞，48 h后进行双荧光素酶活性检测，结果见图8。由图8可知，与对照组相比，pGL3-FOXI1、pGL3-ZBTB26、pGL3-SP2的相对荧光活性极显著上升（P<0.01），说明转录因子FOXI1、ZBTB26、SP2可能对绵羊CCL19基因的转录起负调控作用；pGL3-POU5F1的相对荧光活性极显著降低（P<0.01），说明转录因子POU5F1的结合位点可能是绵羊CCL19基因转录的重要调控位点。

潜在转录因子结合位点的缺失在序列中用白色标明；预测的结合位点在序列中用黑色标明The deletion of potential transcription factor binding sites are indicated by white in the sequence；And predicted binding sites are indicated by black in sequence图8 定点缺失关键转录因子的相对荧光素酶活性测定Fig.8 Relative luciferase activity determination of site-deletions of key transcription factors

3 讨 论

趋化因子是细胞因子中最大的家族，能够引起趋化反应，协调体内细胞的定位。趋化因子在机体免疫细胞的发育成熟，先天性免疫反应和适应性免疫反应的启动，以及感染病原菌和疾病中免疫细胞的募集中均发挥着重要作用[14]。趋化因子可分为4个亚类：CXC、CC、CX3C及C。其中，CCL19作为炎性趋化因子，属于CC趋化因子家族，通过与CCR7结合，诱导免疫系统的树突状细胞、抗原参与的B细胞和记忆T细胞从而发挥作用[15-16]。研究发现，奶牛发生急性瘤胃酸中毒时，奶牛瘤胃上皮细胞内的CCL19基因表达上调[17]。Toll样受体4（TLR4）的配体细菌的脂多糖（LPS）能够刺激外周血单核细胞，激活先天性免疫保护，同时诱导CCL19基因的表达上调[18]。在HIV-1型病毒的刺激下，CCL19通过与CCR7结合能够刺激免疫细胞释放抗病毒相关的细胞因子（IFN-γ、IL-4），从而促进T细胞增殖和DC细胞对抗原的识别[1]。因此，趋化因子CCL19在机体内炎症发生、先天性免疫应答和适应性免疫应答等方面扮演着重要角色。

对CCL19基因转录调控方面的研究表明，在人树突状细胞中，CCL19基因的表达是由转录因子NF-κB、IRF和STAT家族的几个成员共同调控的[19]；在小鼠模型中，外周血单核细胞中IRF-1能够激活CCL19基因的转录表达[7]。CCL19作为绵羊体内免疫细胞富集的重要趋化因子，是绵羊机体内免疫反应的重要组成部分。然而，绵羊CCL19基因启动子的转录调控相关研究鲜见报道。本研究利用多个启动子分析软件对绵羊CCL19基因的启动子区域进行特征性分析，结果表明，CCL19基因转录起始位点上游1 000 bp的序列（-958/+42 bp）上存在NF-1、POU5F1、GATA3、IRF-1、IRF-3等多个转录因子结合位点，提示该部分序列可能是高转录活性区域。脊椎动物CpG岛（CGIs）是位于转录起始位点附近的一段短的富含GC、CpG的非甲基化序列，含有CpG岛的启动子沉默主要是通过CpG甲基化实现的[20]。鉴于CGIs通常具有调控基因转录活性和影响局部染色质结构的功能，本试验利用生物信息学软件对绵羊CCL19基因启动子序列1 000 bp序列的甲基化情况进行分析，结果显示，该序列无脊椎动物CpG岛，提示CCL19基因的调控可能不受启动子CpG岛甲基化的影响。研究表明，基因转录是由3种RNA聚合酶完成的一种保守的细胞机制，每种RNA聚合酶都有一套专门的转录因子。 转录因子可识别特定的结合位点，形成能够启动基因转录的启动前复合体[21]。 TATA-box是RNA聚合酶Ⅱ转录复合物开始组装并启动转录的位点，通常代表着该基因的转录是高度调控的[22]。 通过对绵羊CCL19基因启动子序列进行TATA-box分析发现，该启动子序列包含TATA-box（-678/-671 bp）。 以上结果表明，绵羊CCL19基因转录起始位点上游1 000 bp的序列具有很强的启动子活性。

本研究发现，绵羊CCL19基因启动子核心启动子区域为-256/-186 bp，缺失转录因子POU5F1结合位点后，序列的转录活性相对于对照组显著下降。POU5F1通常也被称为八聚体结合转录因子4（octamer-binding transcription factor 4,OCT3/4），是POU家族的同源结构域转录因子[23]。POU家族的转录因子都包含高度保守的结合DNA的POU结构域，能够特异性地结合靶基因启动子或增强子区域内的ATGCAAAT基序[24]。POU5F1基因编码的OCT4蛋白具有维持细胞多能性和分化的功能[23]。研究表明，POU5F1/OCT4可通过控制bmp2b、bmp4和vox基因的表达从而影响斑马鱼胚胎发育[25]；miR-145可通过刺激POU5F1基因的表达从而影响乳腺癌细胞的增殖、浸润和迁移[26]；POU5F1还可通过促进巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）的表达，从而促进巨噬细胞极化从而导致细胞生长和转移[27]。综上，POU5F1/OCT4在机体内的主要功能是影响胚胎发育和细胞分化，且还会刺激免疫细胞的生长转移。POU5F1同家族转录因子POU2F1过表达可以促进PD-L1的表达，从而可能参与免疫逃避的过程[28]。因此，在绵羊机体内POU5F1可能通过与CCL19基因启动子ATGCAAAT基序结合调控CCL19基因的表达，从而控制淋巴细胞活化和迁移，参与炎症反应、先天性免疫和适应性免疫过程。

本研究结果还发现，缺失FOXI1、ZBTB26、SP2转录因子结合位点后，序列的转录活性相对于对照组极显著上升。大多数转录因子对基因表达具有激活作用，但是也有部分转录抑制因子通过干扰正在作用的转录因子（间接抑制）或通过与RNA聚合酶和相关因子的转录复合物相互作用（直接抑制）直接干扰靶基因转录[29]。因此，在绵羊机体内FOXI1、ZBTB26、SP2可能是CCL19基因的转录抑制因子。本研究初步鉴定了在绵羊中POU5F1/OCT-4转录因子可能以转录调控的方式参与CCL19基因的表达，该试验结果在绵羊上首次报道，而其他物种中未见报道，具体作用机制还需要进一步的研究。

4 结 论

本研究通过体外试验确定了绵羊CCL19基因启动子核心启动子区域位于-256/-186 bp。利用在线软件预测转录因子结合位点，点突变技术缺失结合位点序列及双荧光素酶报告基因系统初步鉴定出POU家族成员POU5F1/OCT-4转录因子结合位点可能是绵羊CCL19基因的转录激活因子。