大果木姜子主要挥发性成分防治冠心病的分子机制研究

陈思宇　唐子茜　杨欣　涂小华　袁龙飞　潘思佳　邓万娟　赵廷廷

【摘 要】 目的：采用網络药理学分析大果木姜子主要挥发性成分治疗冠心病的分子机制。方法：通过顶空固相微萃取技术分析贵州大果木姜子挥发性成分，统计相对含量大于5%挥发性成分进行靶点筛选，通过Swiss Target Prediction对主要挥发性成分进行靶点筛选，在GeneCards 数据库中以“Coronary heart disease ”为关键词检索冠心病疾病靶点，基于R 中clusterProfiler包进行GO（Gene ontology）和KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes ）富集分析，通过STRING数据库检索靶点可能的潜在相互作用。结果：桧烯（15.54%）、桉树油（6.50%）、β-石竹烯（10.04 %）相对含量大于5%，共筛选出126个靶点，基于GeneCards筛选出冠心病靶点1709个，通过FunRich取交集，筛选出大果木姜子治疗冠心病靶点66个，主要通过PPAR信号通路（PPAR signaling pathway）防治冠心病。通过蛋白相互作用分析发现alpha-2A肾上腺素能受体（Alpha-2A adrenergic receptor，ADRA2A）、alpha-2B肾上腺素能受体（Alpha-2B adrenergic receptor，ADRA2B）、Alpha-2C 肾上腺素能受体（Alpha-2C adrenergic receptor，ADRA2C）、过氧化物异构酶体增殖子激活受体（Peroxisome proliferator- activated receptor gamma， PPAR-γ）为关键靶点。结论：大果木姜子主要挥发性成分防治冠心病的关键靶点为ADRA2A、ADRA2B、ADRA2C、PPAR-γ。

【关键词】 大果木姜子;冠心病;网络药理学;通路分析

【中图分类号】R285.5【文献标志码】 A  【文章编号】1007-8517（2022）05-0033-06

基金项目：贵州中医药大学大学生创新创业训练项目[贵中医大创合字（2018）8号];贵州中医药大学科研项目[贵中医科院内（2019）21号]。

作者简介：陈思宇（1999-），女，汉族，本科，研究方向为中药网络药理学。E-mail：1208877346@qq.com

通信作者：杨欣（1987-），女，汉族，博士，副教授，研究方向为中药天然药物药效物质基础研究。E-mail：25066640 @qq.com

Study on the Molecular Mechanism of Main Volatile Components of Litsea lancilimba Merr.

in the Control of Coronary Heart Disease

CHEN Siyu TANG Zixi YANG Xin* TU Xiaohua YUAN Longfei PAN Sijia DENG Wanjuan ZHAO Tingting

Guizhou University of Traditional Chinese Medicine， Guiyang 550025，China

Abstract：Objective Using network pharmacology to analyze the molecular mechanism of the main volatile components of Litsea lancilimba Merr. in the treatment of coronary heart disease. Methods Analysis of volatile components of Litsea lancilimba Merr. by headspace solid phase microextraction technology， the relative content of volatile components were more than 5%， and the main volatile components were selected by Swiss Target Prediction. Search for coronary heart disease target with “Coronary heart disease” as key word in GeneCards database. Based on the clusterProfiler package in R for GO（Gene ontology） and KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes ） enrichment analysis. Retrieving possible potential interactions of targets through STRING databases. Results The relative contents of sabinene（15.54%）， eucalyptus oil（6.50%） and β-bamboos（10.04%）were more than 5%. A total of 126 targets were screened. 1709 coronary heart disease targets selected based on GeneCards. 66 targets for the treatment of coronary heart disease in Litsea lancilimba Merr. were selected by FunRich. Prevention and treatment of coronary heart disease mainly through PPAR signaling pathway.Protein interaction analysis revealed alpha-2A adrenergic receptor（ADRA2A）， alpha-2B adrenergic receptor（ADRA2B）， Alpha-2C adrenergic receptor（ADRA2C） and Peroxisome proliferator-activated receptor gamma（PPAR-γ） are key targets. Conclusion The key targets of the main volatile constituents of the major volatile components in the prevention and treatment of coronary heart disease are ADRA2A， ADRA2B， ADRA2C and PPAR-γ.1995F08F-1AD4-4998-96D6-3A1CB4DAB0B6

Key words：Litsea lancilimba Merr.; Coronary Heart Disease; Network Pharmacology; Pathway Analysis

冠心病全称冠状动脉性心脏病（Coronary heart disease，CHD），为临床常见疾病之一，严重威胁人类健康，其发病率和死亡率逐年上升。目前，从抗凝降脂、抗血小板、减弱心肌收缩力、扩冠脉等对症治疗，治疗效果显著，且起效快，但是不良反应也会导致心肌梗死危及生命^[1]。CHD是一种高危害性的心脏疾病，不做好预防会导致恶变。CHD发生、发展的相关危险因素、发病机制成为研究的热点。目前在临床上应用中药、针灸等中医疗法结合历代医家的理论与临床经验，在冠心病的治疗上发挥了较大的优势^[2]。

大果木姜子（Litsea lancilimba Merr.）是贵州苗族 、布依族民间习用药材，称为贵州十大苗药之一。具有温中散寒、理气止痛，是苗族治疗心痛、胸痹、腹痛的常用草药，药理学研究^[3]发现其在冠心病、心绞痛等心血管疾病中发挥重要作用。实验^[4]证明大果木姜子挥发油含量较高，其化学成分主要为单萜或倍半萜类，未发现对人体有害的黄樟醚等物质。因此，本研究通过前期实验获得大果木姜子挥发油的主要化学成分，对主要化学成分进行分析，获得主要化学成分治疗冠心病的关键靶点，对其进行生物信息学分析，筛选出大果木姜子主要化学成分治疗冠心病的关键靶点。

1 实验材料及方法

1.1 数据库及软件 GeneCards（https：//www.gen ecards.org/）;Cytoscape 3.5.1 （http：//www. cytoscape.org）;STRING（https：//string-db.org/）;R（https：//www.r-project.org）;Swiss Target Prediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）。

1.2 贵州大果木姜子主要挥发性化学成分靶点筛选 通过顶空固相微萃取技术（Headspace solid phase microextraction，HS-SPME）分析贵州大果木姜子挥发性成分，统计相对含量大于5%挥发性成分进行靶点筛选，通过Swiss Target Prediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）对主要挥发性成分进行靶点筛选，选择“人源”筛选其调节的靶点。

1.3 疾病靶点分析 GeneCards（https：//www. genecards.org/）数据库作为检索人类基因信息的最优解，整合了众多文献信息，覆盖了多个数据库对于基因的分析数据。在GeneCards 数据库中以“Coronary heart disease ”为关键词搜索冠心病靶点。

1.4 GO及通路富集分析 基于R 中clusterProfiler包进行GO分析，包括细胞组成（Cellular Component）、生物过程（Biological Process）和分子功能（Molecular Function）。clusterProfiler同时支持GO和KEGG的富集分析。根据靶点id进行富集分析，选择p-value<0.05为阈值。

1.5 关键靶点分析 通过STRING数据库（https：//string-db.org/）检索了编码蛋白间可能的潜在相互作用，并构建蛋白质相互作用网络，打开STRING数据库点击“SEARCH”模块。选择“Multiple proteins”输入筛选出的基因或蛋白名称，并在“Organism”中指定物种。下载STRING数据库中蛋白质相互作用网络^[5]。

3 实验结果

3.1 主要挥发性成分治疗冠心病的靶点 本实验选择相对含量大于5%的成分进行研究，其中桧烯（15.54%）、桉树油（6.50%）、β-石竹烯（10.04 %）为研究对象（表1）。基于Swiss Target Prediction数据库共筛选出126个靶点。基于GeneCards筛选出冠心病靶点1709个，通过FunRich将大果木姜子主要挥发性成分靶点与冠心病靶点取交集，共筛选出66个靶点（如图1所示）。

3.2 GO分析

3.2.1 潜在靶点生物过程分析 对66个靶点进行生物过程分析（表2）。在生物过程中，66个靶点主要参与类固醇激素介导的信号通路（Steroid hormone mediated signaling pathway）、脂质代谢过程的调节（Regulation of lipid metabolic process）、激素介导的信号通路（Hormone-mediated signaling pathway）。

3.2.2 潜在靶点细胞成分分析 对66个靶点细胞成分分析（表3），66个靶点主要存在突触前面（Presynaptic membrane）、突出后膜（Postsynaptic membrane）、突触细胞膜（Synaptic membrane）和RNA聚合酶II转录因子复合物等。

3.2.3 靶点分子功能分析 对66个靶点进行分子功能分析（表4）。在分子功能分析中发现，66个靶点主要具有类固醇激素受體的活性（steroid hormone receptor activity）、核受体的活性（nuclear receptor activity）、类固醇的结合（steroid binding）、核受体转录辅激活因子活性（nuclear receptor transcription coactivator activity）等。1995F08F-1AD4-4998-96D6-3A1CB4DAB0B6

3.3 通路分析 对66个靶点进行通路分析（表5）。图2为通路分析的前10项（P-Value<0.05）。在通路分析中，66个靶点参与多条信号通路，与心血管相关的通路有PPAR信号通路（PPAR signaling pathway）、血管平滑肌收缩（Vascular smooth muscle contraction）、CGMP-PKG信号传导途径（cGMP-PKG signaling pathway）等，其中PPAR信号通路为核心通路。

3.4 关键靶点分析 66个靶点使用 STRING 结合R软件进行PPI分析，66个靶点关联密切。根据Degree 绘制蛋白质节点的条形图，如图3所示。Degree>15 的节点包括alpha-2A肾上腺素能受体（alpha-2A adrenergic receptor，ADRA2A）、alpha-2B肾上腺素能受体（alpha-2B adrenergic receptor，ADRA2B）、Alpha-2C 肾上腺素能受体（alpha-2C adrenergic receptor，ADRA2C）过氧化物异构酶体增殖子激活受体（Peroxisome proliferator- activated receptor gamma， PPAR-γ），关键靶点的生物学效应见表4。

4 讨论

随着人口老龄化、人口增长，心血管疾病的患病人数也逐渐增加，同时高血脂、糖尿病、高血压等患病率的上升促使冠心病的患病人数与日俱增，不良生活方式使冠心病越来越趋于年轻化，我国心血管疾病死亡率居首位，严重影响人类的生活质量和生命健康。传统医学在冠心病治疗上有一定的优势，其中中药是冠心病治疗方法中不可缺少的部分^[6]。大果木姜子挥发油能食用和药用。目前，在心血管疾病方面开发了米槁心乐滴丸、心胃丹胶囊、米槁精油滴丸等。本研究发现大果木姜子主要挥发性成分为桧烯（15.54%）、桉树油（6.50%）、β-石竹烯（10.04 %），相对含量大于5%，通过网络药理学分析发现其调节的靶点主要参与PPAR信号通路防治冠心病。过氧化物酶体增殖物激活型受体（Peroxisome proliferator activated-receptors， PPARs）已发现有PPAR-α、PPAR-β、PPAR-γ三种亚型，其中以PPAR-γ的研究较为深入，在血管壁细胞（如内皮细胞、平滑肌细胞、单核/巨噬细胞）及心肌细胞等有表达，能改善心室重构，与心血管疾病和高血压有关^[7]。

本研究发现大果木姜子主要挥发性成分治疗冠心病的关键靶点为alpha-2A肾上腺素能受体（Alpha-2A adrenergic receptor，ADRA2A）、alpha-2B肾上腺素能受体（Alpha-2B adrenergic receptor，ADRA2B）、Alpha-2C 肾上腺素能受体（Alpha-2C adrenergic receptor，ADRA2C）过氧化物异构酶体增殖子激活受体（Peroxisome proliferator- activated receptor gamma， PPAR-γ）。其中肾上腺素能受体主要是作为媒介转导为儿茶酚胺作用的组织受体。α2肾上腺素能受体分为ADRA2A、ADRA2B、ADRA2C三种亚型。已有研究^[8]表明：对肾上腺素能α、β受体进行阻断作用，产生阻断作用可有效降低血压、预防心律失常等疾病的发生;PPAR-γ属于核受体家族成员，已有研究^[9]发现：PPAR-γ在冠心病患者血清中明显高于健康人群，然而PPAR-γ在冠心病相关研究较少，因此明确PPAR-γ在冠心病的相关性及作用机制，具有重要的临床意义^[9]。本研究将分析化学和计算机理论知识运用到科研上，加强学科之间的相互渗透、融合^[10-11]。筛选出大果木姜子挥发油的预防冠心病的关键靶点，为其挥发油药理作用的开发和应用提供理论依据。

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（收稿日期：2021-07-12 编辑：陶希睿）1995F08F-1AD4-4998-96D6-3A1CB4DAB0B6