Box-Behnken响应面法优化壮药黄杞中总黄酮的回流提取工艺

陈丹丹　班晓敏　林夏　杨溢　岑杏蔓

【摘 要】 目的：采用Box-Behnken响应面法优化壮药黄杞的提取工艺。方法：以总黄酮为指标，以液料比、提取时间、提取次数为因素，正交试验初步筛选工艺参数，BoxBehnken 响应面法作进一步优化。结果：最优工艺条件为：提取时间1.5 h，乙醇量为10倍，提取2次。結论：方法合理可靠，稳定，可预测性较优。

【关键词】 壮药;黄杞;总黄酮; 回流提取;Box-Behnken响应面法

【中图分类号】R284.2【文献标志码】 A  【文章编号】1007-8517（2022）05-0046-06

基金项目：广西高校中青年教师科研基础能力提升项目（2019KY1531）;广西来宾市科技局科技攻关与新产品试制（来科攻202411）。

作者简介：陈丹丹（1981-），女，壮族，硕士，讲师，研究方向为生药学。E-mail：76001566@qq.com

通信作者：林夏（1987-），女，汉族，博士，讲师，研究方向为药物制剂。E-mail：237161741@qq.com

Response Surface Method Was Use to Optimize the Extraction of Astilbin and Engelitin

From Zhuang Medicine of Engelhardia Roxburghiana Wall.

CHEN Dandan1 BAN Xiaomin2 LIN Xia^1*YANG Yi3 CEN Xingman4

1.Guangxi Health Vocational and Technical College， Nanning 5300232，China;

2.Guangxi Nanning the Sixth People's Hospital，Nanning 5300232，China;

3.The 923 Logistic Support Unit hospital of the PLA，Nanning 5300232，China;

4.Guangxi Guiping People's Hospital，Guiping 537200，China

Abstract：Objective Optimization of extraction technology of Zhuang medicine Engelhardia roxburghiana Wall. by orthogonal test and Box-Behnken response surface method. Methods According to the total flavonoids， the ratio of liquid to material， extraction time and extraction times were taken as factors， and the process parameters were preliminarily selected by orthogonal， test BoxBehnken the response surface method for further optimization. Results The optimum conditions were as follows： extraction time 1.5 h， ethanol 10 times， extraction 2 times. Conclusion The method is reasonable， reliable， stable and predictable.

Key words：Zhuang Medicine;Engelhardtia Roxburghiana Wall;Total Flavonoid;Reflux Extraction;Box-Behnken Response Surface Method

黄杞是胡桃科黄杞属植物黄杞Engelhardia roxburghiana Wall.的干燥叶，主要分布在广西、广东、云南等亚热带地区。《中华本草》^[1]记载黄杞树皮行气化湿;叶可作茶饮，具有清热解毒、生津止渴、解暑利湿的作用，可用于脾胃湿滞、胸腹胀闷、感冒发烧等的治疗。1996年曾收载在《广西中药材标准》（第二册），2011年收载于《广西壮族自治区壮药质量标准·第二卷》，壮医认为黄杞味微甜，性凉。清热毒，除湿毒，调气道，谷道。用于痧病（感冒），发得（发热），东郎（食滞），货烟妈（咽炎）与中医对其的认识基本一致^[2]。作为壮族常用药之一，其药用资源丰富，药用历史悠久，壮族地区的群众常以叶煮水当茶饮，民间又称“甜茶”，可消除暑热口渴、食滞、腹痛，有降血脂，降血压等功效^[3-4]，有部分壮族群众利用黄杞的树汁或树皮的水提物来治疗麻疹、皮炎等皮肤病^[5]。研究^[6-9]表明黄杞中含有丰富的次生代谢产物，主要含有黄酮类成分，此外还有醌类、甾类、三萜类等，黄酮类成分药理作用广泛，在抗凝血，抗血栓，降血脂，降血糖等方面表现出较强的药理活性。在提取方面的报道仅见宋明明等^[10]采用正交试验优选黄杞叶总黄酮的最佳提取工艺，制剂方面未见报告。

实验开展黄杞总黄酮提取工艺的优化研究，在单因素试验的基础上，以料液比、提取时间、提取次数为变量，总黄酮提取率为指标，利用Box-Behnken应面法进一步优化回流提取工艺，响应面优化法与已有文献报告的正交试验优化比较，更能体现不同因素之间的交互作用对药材提取率影响，更全面的和真实的反应提取过程中各个因素的交互作用，本研究的结果以期为黄杞的后续制剂开发提供了实验依据和奠定了基础^[11-19]。A67D4071-5767-49FE-868D-67CB7CFF2701

1 仪器与试药

1.1 仪器 TU-1901紫外可见分光光度计（日本岛津公司）;PRACYUM124-LCN电子分析天平（赛多利斯电子仪器公司）;KQ-250DB循环式多用真空;恒温水浴锅。

1.2 试药 黄杞采自于广西南宁宾阳县陈平镇，经本校中药鉴定教研室刘安韬副教授鉴定为胡桃科植物黄杞Engelhardia roxburghiana Wall.的干燥叶。芦丁对照品（中国上海诗丹德生物技术有限公司;批号：5981;纯度：99%）。乙醇、甲醇、氢氧化钠、硝酸铝、亚硝酸钠均为分析纯（广东光华科技股份有限公司）。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备 精密称取芦丁对照品10 mg，甲醇定容至50 mL，加無水甲醇溶解，并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为0.2 mg/mL的对照品溶液。

2.2 供试品溶液的制备 称取黄杞药粉5 g，加90%乙醇（料液比1∶10），提取2次，每次1.5 h，滤过，合并滤液，精密吸取续滤液1 mL，挥干乙醇，用20 mL水溶解，超声使其溶解，移入分液漏斗，加20 mL石油醚萃取，重复2～3次，至无色。弃去石油醚层，水层转入分液漏斗，加20 mL乙酸乙酯萃取，重复3次，弃去水层，将乙酸乙酯层置于锥形瓶中水浴挥干，加入甲醇洗涤容器，将洗涤液转移至50 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 标准曲线的绘制 精密吸取配置好的芦丁对照品0、1、2、3、4、5、6 mL，分别置25 mL量瓶中，各加水至6 mL，加5% NaNO2溶液1 mL，混匀，静置6 min，加10% Al（NO3）3溶液1 mL，摇匀，静置6 min，加4% NaOH溶液10 mL，再加水定容，摇匀，放置15 min，以相应的试剂为空白，照紫外-可见分光光度法，在500 nm波长处测定吸光度，以吸光度（A）为纵坐标，浓度为横坐标（C）进行回归，得到标准曲线为A=0.0115C-0.0099（R2=0.9991），在0.008～0.049 mg/mL范围内呈良好的线性关系。

2.3.2 精密度试验 取芦丁对照品溶液适量，按照“2.3.1”项下方法操作，连续6次，计算RSD为1.5%，表明仪器精密度良好。

2.3.3 稳定性试验 取同一份供试品溶液，按照“2.3.1”项下方法操作，在60 min内从起始时间开始每隔5 min测定1次吸光度，计算RSD为1.7%，表明溶液在60 min内稳定性良好。

2.3.4 重复性试验 取6份黄杞药材粉末，按照2.2供试品溶液的制备得供试品溶液6份，按照“2.3.1”项下方法操作，在500 nm波长处测定吸光度，各平行测定3次，取平均值，带入回归方程，计算样品中总黄酮的含量和RSD值，RSD为1.8%，表明此方法重复性性良好。

2.3.5 加样回收率试验 精密吸取6份已知总黄酮含量的供试品溶液中，每份1 mL（已测得其总黄酮含量为0.0201 mg/mL），分别加入芦丁溶液（浓度为0.01 mg/mL） 1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL各 2份，按照“2.3.1”项下进行制备并测定，结果见表1，平均回收率为98.48%，RSD=1.06%，表明该方法科学合理。

2.4 供试品中总黄酮的测定 精密吸取“2.2供试品溶液的制备”中的溶液3 mL，定容至25 mL，按照“2.3.1”项下方法操作，在500 nm波长处测定吸光度，各平行测定3次，取平均值，测定样品中总黄酮的含量。

3 单因素试验

3.1 料液比 取黄杞粉末，过20目筛，称取5 g，95%乙醇，提取1.5 h，提取2次，考察1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16料液比对总黄酮提取率的影响。结果如图1所示，提取率随着料液比的增加而升高，当料液超过到1∶14后，提取率基本变化不大，为节约溶剂，故选用1∶8、1∶10、1∶12进行响应面试验分析。

3.2 提取时间 取黄杞粉末，过20目筛，称取5g，95%乙醇，固定料液比1∶10，提取2次，考察0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h不同时间对总黄酮提取率的影响。结果如图2所示，1 h提取率最高，随着时间的增加，总黄酮提取率变化不大，故选择1 h、1.5 h、2 h进行响应面优化分析。

3.3 提取次数 取黄杞粉末，过20目筛，称取5g，95%乙醇，固定料液比1∶10，提取1.5 h，考察1次、2次、3次、4次、5次不同提取次数对总黄酮提取率的影响。结果如图3所示，提取2次后，总黄酮提取率明显下降，说明提取2次已经提取完全。故选择1次、2次、3次进行响应面优化分析。

4 响应面优化法

4.1 优化试验 在单因素试验基础上，选择料液比（A）、提取时间（B）、提取次数（C）作为影响因素，总黄酮提取率（Y）作为评价指标，选取3因素3水平使用Design Expert 8.0.6软件进行响应面优化设计优化。因素水平及实验结果见表2，表3。

4.2 方差分析 方差分析结果见表4，在一次项中，A、B、C项，只有C项对总黄酮提取率具有统计学意义（P<0.05），交互项均不显著，说明各试验因子对响应值的影响并非简单的线性关系，失拟项F值为4.45，P=0.0924，失拟项不显著，表明回归模型和实测值能较好的拟合，可信度高，表明该模型拟合优度较好。利用软件对试验结果进行二次多元回归拟合，对表的数据进行方差分析后得到模型的二次多项回归方程为：

R=-27.972+4.197A+10.032B+5.043C+0.228AB-0.138AC-0.035BC-0.023A2-4.114B2-0.701C2A67D4071-5767-49FE-868D-67CB7CFF2701

影响因子对提取率的影響为：C>A>B。试验模型可信分析，相关系数R2=0.9609，说明模型可以理解为96.09%试验所得的黄杞总黄酮含量的变化拟合较好。分析说明，可用此试验方法来提取黄杞总黄酮的工艺研究。

4.3 响应曲面图分析 为了进一步研究变量之间的相互作用，应用Design Expert 8.0.6软件模拟得到了各因素对黄杞总黄酮提取率的3D响应曲面图和等高线图，结果如图4～图6所示。由图4～图6可知，响应面曲面开口朝下，响应面曲线变化相对陡峭，等高线呈椭圆形，说明各因素的交互作用对黄杞总黄酮提取率的影响较为明显。

4.4 黄杞总黄酮提取的优化和验证 响应面优化试验设计的最佳提取工艺为：料液比1∶10.2，提取时1.54 h，提取次1.92次，在此工艺下总黄酮提取率预测值为（7.352±0.010）%。考虑实际情况，将最佳工艺修正为：料液比：1∶10，提取时间1.5 h，提取次数2次。在修正的工艺条件下进行验证试验，重复5次，得到黄杞总黄酮提取率（7.328±0.010）%。结果见表5。

5 讨论

目前，关于壮药黄杞总黄酮提取工艺的研究报道主要是采用正交试验设计。实验先采用单因素试验考察了料液比、提取时间、提取次数对其提取率的影响，然后进行Box-Behnken 试验优化设计，最后以Design-Expert8.0.6软件进行数据回归和方差分析，将因素与结果的关系进行多项式拟合，筛选出最佳提取工艺。测得回归方程的相关系数为0.9609，表明方程拟合良好。根据响应曲面及等高线图，得到了各因素间的相互作用对黄杞总黄酮提取率的影响，响应面曲面开口朝下，响应面曲线变化相对陡峭，等高线呈椭圆形，说明各因素的交互作用对黄杞总黄酮提取率的影响较为明显。

验证试验表明，该模型方法可靠性高。最终确定最优工艺，料液比1∶10，提取时间1.5 h，提取次数2次，在此条件下壮药黄杞总异黄酮提取率为7.328%，明显高于单因素试验结果，为壮药黄杞中总黄酮的后续制剂开发奠定基础。

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（收稿日期：2021-07-14 编辑：陶希睿）A67D4071-5767-49FE-868D-67CB7CFF2701