复方苓桂颗粒薄层色谱鉴别研究

刘柳毅　刘丽君　纪秋凤　李瑞明

【摘 要】 目的：建立复方苓桂颗粒的薄层色谱（TLC）鉴别方法。方法：采用薄层色谱法分别对复方苓桂颗粒中的桂枝、茯苓、大黄在自制板与预制板上进行定性鉴别，并进行低湿（RH32%），常湿（RH65%），高湿（RH88%）的耐用性实验。结果：桂枝、茯苓、大黄供试品溶液色谱与相应对照药材色谱在相同位置上显相同颜色斑点，且预制板和自制板上都显示清晰，各湿度条件下的色谱都有明显的斑点。结论：本方法简便，专属性强，耐用性良好，阴性无干扰，可作为复方苓桂颗粒的薄层鉴别方法。

【关键词】 复方苓桂颗粒;薄层色谱法;质量标准

【中图分类号】R284.1【文献标志码】 A  【文章编号】1007-8517（2022）05-0052-06

基金项目：深圳市光明区卫生健康局中医药科研项目（GM2019020026）。

作者简介：刘柳毅（1992-），女，汉族，硕士，主管药师，研究方向为医院制剂开发研究。E-mail：liuly56@mail.sysu.edu.cn

通信作者：李瑞明（1974-），男，汉族，硕士，副主任药师，研究方向为医院制剂开发研究。E-mail：liruiming321@163.com

Study on the Ldentification of Fufang Linggui Granules By Thin-layer Chromatography

LIU Liuyi LIU Lijun JI Qiufeng LI Ruiming*

The Seventh Affiliated Hospital of Sun Yat-Sen University，Shenzhen 518107，China

Abstract：Objective

To establish the Thin-layer chromatography（TLC） identification method of Fufang Linggui Granules.

Methods Thin-layer chromatography（TLC） method was used to qualitatively identify Cinnamomi Ramulus， Poria cocos and Rhubarb in the prescription of Fufang Linggui granules on self-made plates and prefabricated plates， and carried out low-humidity（RH32%）， regular humidity（RH65%）， high humidity（RH88%） durability test.Results The chromatograms of the test solutions of Cinnamomi Ramulus， Poria cocos and Rhubarb showed the same color spots on the same position in the chromatogram of the corresponding medicinal materials. The results were clear on the prefabricated plate and the self-made plate， and the chromatograms under various humidity conditions have obvious spots. Conclusion The method is simple， with good specificity， strong durability and no interference， and can be used as the thin-layer chromatography method of Fufang Linggui Granules.

Key words：Fufang Linggui Granules; Thin-layer Chromatography（TLC）; Quality Control

自改革開放以来，随着我国人民的生活水平不断提高，越来越多的人患有与营养相关的代谢综合征（高血压、糖尿病、肥胖等）。中山大学附属第七医院秦鉴教授倡导服用加味苓桂术甘汤联合短期禁食治疗代谢综合征，对于高血脂、高血压、肥胖以及糖尿病，目前已有大量的临床病例证明有肯定疗效^[1-3]。加味苓桂术甘汤以温阳化饮第一方的经典名方“苓桂术甘汤”进行加减，由茯苓、桂枝、大黄等7味中药组成。本方重用茯苓为君药，茯苓既善渗湿健脾，又可利水扶正，桂枝温脾阳，畅营血，助运水，与茯苓合用化湿利水，具有温阳化饮，健脾祛湿的功效。为便于患者携带以及服用，我院正在将加味苓桂术甘汤自主研发成医院制剂——复方苓桂颗粒。在国内外研究报道中，仅查到黄晓红于2002年发表的硕士学位论文对苓桂术甘汤开展了质量标准研究^[4]，其薄层色谱鉴别试验主要参照《中国药典》2000年版实施，此后《中国药典》已有多版更新，且未查到国内外有类似组方的颗粒剂型的质量标准研究。为完善复方苓桂颗粒的质量标准，保证临床用药安全有效，本研究对制剂中的桂枝、茯苓、大黄进行薄层色谱鉴别研究，为复方苓桂颗粒质量标准的完善提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器 EL204电子天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）;WFH-203B 暗箱式三用紫外分析仪（上海米青科实业有限公司）;P-1薄层色谱展开缸（上海信谊仪器厂有限公司）;SHD-III循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司）;KQ5200DE型台式数控超声波清洗器（东莞市科桥超声波设备有限公司）;HH-4电子恒温水浴锅（苏州威尔实验用品有限公司）;DHG-9076A型电热恒温鼓风干燥箱台（上海精宏实验设备有限公司）。5AFB8854-D19B-4566-8745-6DE536630E59

1.2 材料 复方苓桂颗粒（批号：20190316，实验室自制）;桂枝对照药材（批号：121191-201605）、茯苓对照药材（批号：121117-201509）、大黄对照药材（批号：120902-201311），以上对照药材均购自中国食品药品检定研究院;去桂枝颗粒样品、去茯苓颗粒样品、去大黄颗粒样品（批号均为20190318，药剂实验室自制）、乙醇、无水乙醇、甲醇、二氯甲烷、石油醚（60～90℃）、乙醚、乙酸乙酯、环己烷、甲酸均为分析纯;薄层层析硅胶G（批号：0130328，青岛海洋化工有限公司）、薄层层析硅胶板（批号：HC39961356，默克化工技术（上海）有限公司）。

2 方法与结果

2.1 桂枝的薄层色谱鉴别

2.1.1 溶液制备 取复方苓桂颗粒10 g，研细，加入乙醇50 mL，超声处理30 min，静止10 min，滤过，滤液置恒温水浴锅上蒸干，残渣加入5 mL乙醇使其溶解，作为供试品溶液。取桂枝对照药材5 g，与供试品溶液相同的方法进行制备对照药材溶液。取去桂枝颗粒样品10 g，按同法制备得桂枝阴性对照溶液。

2.1.2 鉴别 自制板常湿（RH65%）条件下，照薄层色谱法（《中国药典》2015版四部通则0502^[5]）进行试验，吸取供试品溶液、对照药材溶液、阴性对照溶液各10 μL，分别点于同一自制硅胶G薄层板上，以石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯（17∶3）为展开剂，展开，取出，晾干，置三用紫外分析仪（365 nm）下检视。供试品薄层色谱在对应位置上，与桂枝对照药材显示相同的浅蓝色斑点，且桂枝阴性对照无此斑点。结果如图1所示。

2.1.3 耐用性考察

2.1.3.1 不同相对湿度的比较 以“2.1.1”项下方法制备溶液为样品，取点样后的自制薄层板，分别在不同湿度的层析缸中展开，按“2.1.2”项下方法试验。低湿（RH32%）和高湿（RH88%）条件下，供试品薄层色谱在对应位置上，与桂枝对照药材显示相同的浅蓝色斑点，且桂枝阴性对照无此斑点，结果分别如图2、图3所示。

2.1.3.2 不同薄层层析硅胶板的比较 以“2.1.1”项下方法制备溶液为样品，取默克化工技术（上海）有限公司生产的薄层层析硅胶板，按照“2.1.2”项下方法在常湿（RH65%）条件试验，供试品薄层色谱在对应位置上，与桂枝对照药材显示相同的浅蓝色斑点，且桂枝阴性对照无此斑点。结果如图4所示。

2.2 茯苓的薄层色谱鉴别

2.2.1 溶液制备 取复方苓桂颗粒18 g，研细，加入甲醇30 mL，超声处理30 min，静置10 min，滤过，滤液置恒温水浴锅上蒸干，残渣加入二氯甲烷5 mL溶解，再滤过，取滤液浓缩至1 mL，作为供试品溶液。取茯苓对照药材5 g，以供试品相同的方法制备对照药材溶液。取去茯苓颗粒样品，同法制备茯苓阴性对照溶液。

2.2.2 鉴别 自制板常湿（RH65%）条件下，照薄层色谱法（《中国药典》2015版四部通则0502^[5]）进行试验，吸取上述3种溶液各6 μL，分别点于同一自制硅胶G薄层板上，以石油醚（60～90℃）-乙醚（9∶6）为展开剂，展开，取出，晾干，置三用紫外分析仪（365 nm）下检视。供试品薄层色谱在对应位置上，与茯苓对照药材显示相同颜色的斑点，且茯苓阴性对照没有此斑点。结果如图5所示。

2.2.3 耐用性考察

2.2.3.1 不同相对湿度的比较 以“2.2.1”项下方法制备溶液为样品，取点样后的自制薄层板，分别在不同湿度的层析缸中展开，按“2.2.2” 项下方法试验。低湿（RH32%）和高湿（RH88%）条件下，供试品薄层色谱在对应位置上，与茯苓对照药材显示相同的浅蓝色斑点，且茯苓阴性对照无此斑点。结果分别如图6、图7所示。

2.2.3.2 不同薄层层析硅胶板的比较 以“2.2.1”项下方法制备溶液为样品，取默克化工技术（上海）有限公司生产的薄层层析硅胶板，按照“2.2.2” 项下方法在常湿（RH65%）条件试验，供试品薄层色谱在对应位置上，与茯苓对照药材显示相同的浅蓝色斑点，且茯苓阴性对照无此斑点。结果如图8所示。

2.3 大黄的薄层色谱鉴别

2.3.1 溶液制备 取复方苓桂颗粒10 g，研细后加入无水乙醇20 mL，超声处理30 min，静置10 min，滤过，滤液置恒温水浴锅上浓缩至1 mL，制成供试品溶液。取大黄对照药材1 g加甲醇5 mL，超声处理5 min，静置5 min，取上清液即为对照药材溶液。取去大黄颗粒样品10 g，按供试品方法制备得大黄阴性对照溶液。

2.3.2 鉴别 自制板常湿（RH65%）条件下，照薄层色谱法（《中国药典》2015版四部通则0502^[5]）进行试验，吸取供试品溶液6 μL，对照药材溶液2 μL，大黄阴性对照溶液6μL，分別点于同一自制硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-甲酸（12∶3∶0.1）为展开剂，展开，取出，晾干，置三用紫外分析仪（254 nm）下检视。供试品薄层色谱在对应位置上，与大黄对照药材显示相同的黄色斑点，且大黄阴性对照没有此斑点。结果如图9所示。

2.3.3 耐用性考察

2.3.3.1 不同相对湿度的比较 以“2.3.1”项下方法制备溶液为样品，取点样后的自制薄层板，分别在不同湿度的层析缸中展开，按“2.3.2” 项下方法试验。低湿（RH32%）和高湿（RH88%）条件下，供试品薄层色谱在对应位置上，与大黄对照药材显示相同的浅蓝色斑点，且茯苓阴性对照无此斑点。结果分别如图10、图11所示。

2.3.3.2 不同薄层层析硅胶板的比较 以“2.3.1”项下方法制备溶液为样品，取默克化工技术（上海）有限公司生产的薄层层析硅胶板，按照“2.3.2” 项下方法在常湿（RH65%）条件试验，供试品薄层色谱在对应位置上，与大黄对照药材显示相同的浅蓝色斑点，且大黄阴性对照无此斑点。结果如图12所示。5AFB8854-D19B-4566-8745-6DE536630E59

3 分析与讨论

复方苓桂颗粒成分较为复杂，各个成分之间极易产生干扰。薄层色谱法虽然操作简单便捷，但容易受到样品预处理方式，展开剂等相关条件影响^[6]。因此，薄层色谱鉴别的条件应根据药物组方来进行多次调整预实验，才能确定鉴别的各个条件，保证鉴别的结果。

3.1 桂枝薄层鉴别条件的选择 桂枝薄层色谱研究先参照《中国药典》2015版（一部）桂枝^[7]的方法进行鉴别。用乙醚来预处理样品，以香草醛硫酸试液为显色剂。但进行多次试验后发现，分离效果不理想，杂质较多，考虑到乙醚的毒性以及蒸干乙醚的危险性，改用其他方法。參照药典另一方法，以乙醇来对样品进行预处理，显色剂用二硝基苯肼乙醇试液，喷显色剂后，虽有相同颜色的斑点，但较弱，显色不明显。经过多次预实验，参考文献^[8-9]方法，用乙醇预处理样品，以石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯（17∶3）为展开剂，在紫外光灯365 nm下检视，斑点清晰明显，阴性无干扰。与其他方法相比，无需使用乙醚，同时也不用配置显色剂，就能取得较好的结果。

3.2 茯苓薄层鉴别条件的选择 在茯苓的薄层色谱研究中，先参照《中国药典》2015版一部茯苓以及文献^[10]方法，对样品乙醚超声处理然后蒸干溶于正己烷中，但斑点分离效果不理想，参考文献^[11]预处理方法，加乙醚水浴回流，薄层色谱中分离效果仍不理想，且乙醚毒害性较大。采用文献^[12]中的处理方法，加乙酸乙酯超声处理样品，滤过蒸干后用甲醇溶解，紫外光灯365 nm下观察拖尾严重，喷香草醛硫酸溶液后显色不明显。最后参考曲婷丽等^[13]的参苓白术颗粒的薄层色谱鉴别方法后，先加甲醇超声处理样品，滤过滤液蒸干后，用二氯乙烷溶解，展开后置紫外光365 nm下检视，斑点分离较好，阴性无干扰。和其他方法相比，该方法无需使用乙醚，安全性更好，也无需水浴回流，节省能耗。

3.3 大黄薄层鉴别条件的选择 对于大黄的薄层鉴别，首先用甲醇超声处理，再加水和盐酸回流，然后用乙醚提取，挥干后，残渣加入三氯甲烷即得到供试品溶液，但分离效果不理想且拖尾现象严重。进一步参考王畅等^[14]对榛苓颗粒的薄层色谱方法，将展开剂调整为石油醚（30～60 ℃）：甲酸∶酸乙酯（15∶1∶5），效果仍不理想，有较多杂质干扰。经过多次预实验，改进供试品的制备方法：样品加无水乙醇超声处理，滤过后水浴浓缩得到供试品溶液。展开剂选用环己烷-乙酸乙酯-甲酸（12∶3∶0.1）。在紫外光365 nm检视下，斑点分离完好，清晰，阴性无干扰。与药典记载方法以及其他文献方法相比，此方法预处理只需使用无水乙醇，且操作便捷，无需多次过滤和加热回流。另外文献中使用了三氯甲烷，三氯甲烷对人体危害性大，而本试验采用的无水乙醇增加了安全性，同时也达到了良好的效果。

3.4 薄层板的选择 不同薄层板对药材的承载量不同，分离效果可能会有差异。根据实验结果，三味药材在自制板和预制板上，都能显示清晰的斑点，分离较好，阴性都无干扰，但预制板的斑点更加清晰、圆整，分离度较高，载样量较小，预制板的分离度较低，载样量较大，加大点样量可得到满意的结果。薄层板的耐用性实验提示本方法两者都适用，而预制板效果更好。

3.5 不同相对湿度的影响 比较桂枝在3个不同湿度条件的薄层色谱图，常湿条件下斑点圆整、清晰，而低湿条件下，对应位置的色谱斑点更加清晰可见，因此该方法在低湿条件下也适用，并且效果更好。而高湿条件下，与常湿条件相比，对应位置的色谱斑点较为模糊，但斑点仍能分离完好可见，提示本方法也可适用于高湿条件下。

比较茯苓、大黄在3个不同湿度条件的薄层色谱图，与常湿色谱图相比，低湿和高湿的色谱图在对应位置上的斑点虽可见，斑点仍分离完好，但都较为模糊。说明本方法虽然可适用于低湿和高湿条件下，但效果不如常湿条件。在对照药材色谱图相应的位置上，各个湿度环境下的各供试品色谱均显示相同颜色斑点，并且阴性对照色谱上无，提示本实验方法耐用性良好。

4 结论

通过本实验项目的优化与验证，本文建立的复方苓桂颗粒的桂枝、茯苓、大黄的薄层鉴别项色谱斑点清晰，专属性强，阴性对照无干扰。实际操作简便，耐用性好，可作为复方苓桂颗粒的定性鉴别。

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（收稿日期：2021-07-02 编辑：陶希睿）5AFB8854-D19B-4566-8745-6DE536630E59