Piezo1/JAK2信号通路与膝骨关节炎大鼠软骨细胞凋亡的关系

王勇，王强，邢宇庆，刘芙君，苏日亮，马金健

1 山东第一医科大学附属省立医院推拿科，济南 250021；2 山东中医药大学附属医院推拿科

膝骨关节炎（KOA）是临床常见的一类骨关节疾病，是引起中老年人膝痛的最常见原因，严重影响人们的生活和工作。60 岁以上的人群中，有症状的KOA 可达 50%［1］。软骨细胞凋亡被认为是 KOA 重要的病理机制之一。软骨细胞凋亡的数量与KOA的严重程度密切相关［2］。Piezo1 通道蛋白是 2010 年被发现的［3］，是一种机械敏感性离子通道蛋白，也是一种非常重要的膜通道。细胞学研究发现，Piezo1可以介导软骨细胞膜受到牵张力所形成的内电流，从而证实了其在软骨细胞力学传导中的作用［4］。KOA 患者膝关节力的传导和分布出现异常，可使软骨细胞受到异常的机械牵张应力，从而导致膝关节软骨细胞的过度凋亡［5-6］。细胞学研究发现，对软骨细胞施加不同时长的机械牵张应力，可以激活Piezo1 通道，从而介导软骨细胞的凋亡［7-8］。但是目前并无动物实验对此加以印证。研究发现，蛋白酪氨酸激酶2/信号转导子与激活子3（JAK2-STAT3）信号通路与软骨细胞凋亡密切相关［9-12］，但是目前Piezo1 与JAK2 在软骨细胞凋亡过程中的作用鲜见相关报道。2021 年1 月—7 月，我们观察了Piezo1/JAK2 信号通路与KOA 大鼠软骨细胞凋亡的关系。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂及仪器 清洁级成年雄性SD 大鼠50 只，体质量（120 ± 10）g，购于山东大学实验动物中心，合格证号：SCXK（鲁）20110014。普通饮食饲养于山东第一医科大学附属省立医院动物实验中心，适应性喂养1 周，饲养环境温度20~25 ℃，昼夜明暗交替时间为12 h/12 h。苏木精染色试剂盒（杭州昊鑫生物科技股份有限公司），小鼠抗大鼠Piezo1一抗、小鼠抗大鼠JAK2 一抗、小鼠抗大鼠p-JAK2 一抗、Caspase-3 抗体试剂盒、BCA 蛋白定量试剂盒（美国领先化学公司），HRP 标记的二抗、DAB 染色试剂盒、抗地高辛抗体、蛋白电泳Marker（济南柠檬生物技术有限公司），固绿染色液、番红O染色液、酶标仪（杭州昊鑫生物科技股份有限公司），照相显微镜（日本佳能公司），Image-Pro plus6.0 系统（美国Media Cybernetics公司）。

1.2 动物分组与模型构建 将大鼠随机分为假手术组（10只）和模型组（40只）。模型组采用Hulth 法建立大鼠KOA 模型［13］，手术当天大鼠禁食不禁水，将其仰卧固定于手术台上，经腹腔注射氯胺酮（100~200 mg/kg）麻醉后剪除其右后肢膝关节内侧绒毛，于髌骨内侧剪开皮肤，手术切口约1 cm长，逐层寻找膝关节内侧副韧带，充分暴露内侧副韧带后将其剪断；切开关节囊，观察大鼠是否存在原发性膝关节病变，剔除存在膝关节病变大鼠。将整个内侧半月板完整切除，采用虹膜剪将大鼠前后交叉韧带剪断。常规缝合手术切口，无菌包扎固定。术后肌注青霉素80 000 U，1 次/天，连续肌注3 d。伤口每日换药1次，连续换药7 d。术后第2 天正常饮食饮水，每天观察大鼠伤口有无感染和动物跛行情况，并强迫驱赶动物活动30 min。假手术组充分麻醉后立即取出右后肢膝关节软骨组织，再断颈处死。模型组分别于术后7、30、60、90 d 各取10 只断颈处死，分别取出右后肢膝关节软骨组织。所有软骨组织置于10%甲醛以及-80°C冰箱中备用。

1.3 膝关节软骨组织病理变化观察 采用番红O-固绿染色法［14-15］。切除的关节软骨组织用生理盐水洗涤，拭干后用10%甲醛溶液固定24 h，以防抗原丢失；将软骨组织放入混合酸脱钙液中脱钙24 h；常规石蜡包埋，切片（厚度5 µm）。石蜡切片65 ℃脱水4 h，用不同浓度二甲苯和乙醇自动脱蜡至水；滴加苏木精，细胞核染色1~3 min，镜下观察染色深浅情况以调整染色时间；用自来水洗涤残留的苏木精；滴加盐酸乙醇分化液，分化20 s，自来水洗涤；滴加0.02%固绿水溶液，使细胞外基质染色3 min，1%冰醋酸洗涤3 次，滴加0.1%番红水溶液，3 min 后95%乙醇浸洗，无水乙醇脱水；二甲苯透明3 次，每次2 min，中性树胶封片。用显微镜（×200）观察关节软骨的结构、色泽及各层软骨细胞的形状、数量、排列、坏死程度等。

1.4 膝关节软骨细胞凋亡检测 采用TUNEL 染色法。在烤片机将待染色切片在65 ℃烘烤2 h，常规二甲苯脱蜡剂脱蜡2 次；分别用无水乙醇、90%乙醇、85%乙醇和75%乙醇脱水，直至脱蜡水化完全，PBS 浸 泡 5 min。 滴 加 3% H2O2，10 min 后 滴 加Proteinase K 工作液，37 ℃恒温消化10 min。每张切片滴加Labeling buffer标记的缓冲液20µL以保持其湿润，配制工作液后甩去多余液体，然后每张切片加工作液20 µL，湿盒内37 ℃恒温孵育2 h；滴加封闭液50µL，封闭30 min；滴加稀释的生物素化的抗地高辛抗体（1∶100 稀释）50 µL，湿盒37 ℃恒温孵育2 h。滴加SABC 抗体稀释液（1∶100 稀释）10 µL，湿盒37 ℃恒温孵育2 h。滴加DAB 显色工作液（试剂A、B、C 各50 µL，溶于 1 000 µL 蒸馏水），显色10~15 min，呈棕黄色颗粒状时显色完全，苏木精复染3 s。梯度脱水透明处理后，室温晾干后中性树胶小心封片，注意避免留气泡和溢胶，晾干。200 倍光学显微镜下观察，用Image-Pro plus6.0 软件分析阳性染色面积，并根据阳性染色情况判断软骨细胞凋亡程度。TUNEL 染色阳性区域范围越大，软骨细胞凋亡程度越严重。

1.5 膝关节软骨细胞破坏程度评价 采用Mankin's 评分，通过膝关节软骨组织病理变化的情况评价大鼠 KOA 模型［16］。Mankin's 评分越高，软骨细胞破坏越严重。

1.6 膝关节软骨组织中Piezo1、JAK2、p-JAK2、Caspase-3 蛋白表达检测 采用Western blotting 法。将膝关节软骨组织置冰上，用显微剪将组织剪碎，按20 mg 组 织 加 入 200 µL 裂 解 液 和 PMSF 混 合 液（100∶1），研磨器研磨组织；组织裂解完全后，转移至EP管中，15 000 r/min离心30 min（离心半径10 cm）；吸取上清液2 µL，用蒸馏水稀释，检测蛋白浓度。BCA法测定蛋白浓度，缓慢加入电泳缓冲液，用70 V恒压预电泳30 min。向侧孔中加入标准Marker 蛋白，首先30 V 恒压电泳，待样品浓缩在浓缩胶与分离胶之间并呈一条线后，调整电压为100 V，溴酚蓝条至胶板下缘时，停止电泳。将大小适宜的PVDF膜浸泡于甲醇中10 min，按顺序安装后闭合夹子，将夹子置转膜槽，电压100 V，电流220 mA 进行转膜。将转膜的PVDF 膜在含5%脱脂牛奶的TBST 缓冲液浸泡，室温封闭1 h，倾去封闭液，然后将PVDF 膜浸泡在稀释好的小鼠抗大鼠Piezo1、JAK2、p-JAK2 及Caspase-3 一抗（稀释比均为 1∶100）中，水平摇床4 ℃过夜，第2 天回收。加入HRP 标记的山羊抗小鼠IgG 荧光二抗（稀释比1∶100），室温孵育1 h，弃去二抗加入ECL 发光液，以GAPDH 为内参照。Image J 软件分析蛋白电泳条带灰度值。蛋白相对表达量=目的蛋白电泳条带灰度值/内参照蛋白电泳条带灰度值。

1.7 统计学方法 采用SPSS20.0 统计软件。符合正态分布的计量资料用表示，多组比较采用方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验；指标间的相关性分析采用Pearson 相关法。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组膝关节软骨组织病理变化比较 假手术组软骨正常呈红色，软骨下骨呈蓝色。番红O-固绿染色可见软骨纵切片潮线，潮线上方透明软骨，潮线下方钙化层，钙化层底部粘合线界限明显。潮线与粘合线口间可见齿梳样结构钙化软骨，厚度可达300µm，薄处不足10µm，结构致密，潮线附近可见少量肥大软骨细胞。术后7~90 d，模型组膝关节关节软骨破坏逐渐加重。术后7 d，关节软骨变为粉红色，出现多条潮线，钙化层增厚；术后30 d，钙化层进一步变宽，伴少量血管显现；术后60~90 d，钙化层及非钙化层进一步退变，表现为局部有纤维样增生潮线距离进一步增大，软骨细胞明显减少并集中在潮线附近。

2.2 两组软骨细胞凋亡情况 假手术组及术后7、30、60、90 d 模型组 TUNEL 染色阳性区域分别为（3.17 ± 0.05）% 、（10.98 ± 2.01）% 、（18.62 ±4.37）%、（25.34 ± 6.81）%、（47.55 ± 7.10）%。与假手术组比较，术后7、30、60、90 d模型组TUNEL 染色阳性区域均增大（P均＜0.05），且随时间延长TUNEL染色阳性区域逐渐增大。

2.3 两组软骨破坏情况比较 假手术组及术后7、30、60、90 d 模型组 Mankin's 评分分别为（0.36 ±0.08）、（4.75 ± 0.72）、（7.67 ± 0.22）、（9.07 ±0.32）、（10.67 ± 0.22）分。与假手术组比较，术后7、30、60、90 d 模型组 Mankin's 评分均高（P均＜0.05），且随时间延长Mankin's评分逐渐升高。

2.4 两组膝关节软骨组织内Piezo1、JAK2、p-JAK2及Caspase-3蛋白表达比较 与假手术组比较，术后7、30、60、90 d 模型组 Piezo1、JAK2、p-JAK2 及 Caspase-3 蛋白表达均高（P＜0.05），且随时间延长各蛋白表达逐渐升高。见表1。

表1 两组膝关节软骨组织Piezo1、JAK2、p-JAK2及Caspase-3蛋白表达比较（）

表1 两组膝关节软骨组织Piezo1、JAK2、p-JAK2及Caspase-3蛋白表达比较（）

注：与假手术组比较，P＜0.05。

组别假手术组模型组术后7 d术后30 d术后60 d术后90 d n 10 Piezo1 0.21±0.02 JAK2 0.23±0.02 p-JAK2 0.24±0.01 Caspase-3 0.20±0.01 0.26±0.03*0.27±0.01*0.31±0.05*0.56±0.07*10 10 10 10 0.25±0.02*0.26±0.05*0.32±0.08*0.60±0.09*0.27±0.03*0.30±0.07*0.39±0.05*0.60±0.09*0.27±0.02*0.31±0.05*0.38±0.04*0.59±0.08*

2.5 软骨细胞凋亡情况与Mankin's 评分及Piezo1、JAK2、p-JAK2 及 Caspase-3 蛋白表达的关系 Pear-son 相关分析结果显示，关节软骨TUNEL 染色阳性区域与 Mankin's 评分（r=0.781，P＜0.05）、Piezo1 蛋白表达（r=0.577，P＜0.05）、JAK2 蛋白表达（r=0.725，P＜0.05）、p-JAK2 蛋白表达（r=0.798，P＜0.05）以及Caspase-3 蛋白表达（r=0.691，P＜0.05）存在正相关关系。

3 讨论

KOA 是临床最常见的一种无菌性炎症性骨关节病，是由多种因素导致的一种以软骨破坏、软骨下骨骨化或囊性变、滑膜炎症、关节囊挛缩、肌无力等为特征的慢性疾病。目前，大多数研究者认为，生物力学因素在KOA 的发生发展中起着至关重要的作用［17］。膝关节软骨细胞能够感受力学的变化，通过力敏感离子通道激活相关的信号传导通路影响软骨细胞的分化、凋亡等，从而影响KOA 的病程发展与变化［18］。

KOA 的发生发展与软骨细胞凋亡密切相关，是KOA 发生发展的重要病理机制之一，已经成为了目前研究的热点。KOA 软骨细胞凋亡的机制与信号通路的研究越来越受到重视。Piezo 离子通道属于机械敏感性离子通道，可将细胞膜接收到的机械力学信号、电信号或化学信号，传递至胞内，引起一系列 生化 反应［19］，并 能 调节 细胞 体积 的稳 态［20］。Piezo1 在哺乳动物细胞中几乎无处不在，是一种非常重要的膜通道，软骨细胞受到细胞外界环境中的力学刺激后通过Piezo1影响其增殖、分化及凋亡［21］。软骨细胞中Piezo1、Piezo2 高表达，在软骨细胞中应用 siRNA 能够抑制 Piezo1 和 Piezo2 表达，从而消除机械反应。同时，通过原子力显微镜/Ca2+成像平台检测Ca2+流入的机械响应发现，Piezo1 和Piezo2 均可导致软骨细胞在超生理压迫下的机械转导［22］。因此，本研究复制了大鼠KOA 模型，围绕不同时间节点大鼠软骨细胞Piezo1的变化展开研究。有实验发现，对细胞膜施以不同的牵张力可以激活Piezo1，加快膝关节软骨细胞的凋亡［7-8］。本实验中，我们观察了不同时间节点大鼠膝关节软骨细胞Piezo1 的表达，并与软骨细胞凋亡进行相关性分析，发现二者具有正相关性，与文献［7-8］报道一致。

JAK 蛋白包括 JAK1、JAK2、JAK3 以及 Tyk2。JAK 包含 1 个 FERM 域、1 个 SH2 相关域、1 个激酶结构域和1 个假激酶域。其中激酶域对JAK 活性至关重要，因为只有通过激酶域才能使JAK 磷酸化。JAK-STAT通路的研究主要集中在炎症性疾病、影响免疫系统的疾病及肿瘤性疾病，关于关节软骨凋亡的研究较少，目前主要集中在JAK2-STAT3 这个通路。通过检索共发现4 篇文献认为JAK2-STAT3 信号通路与软骨细胞凋亡密切相关［9-12］。我们研究发现，随着KOA 的进展，JAK2 蛋白表达升高，这与以上文献［9-12］结果一致。同时我们还发现，JAK2 蛋白表达升高与软骨细胞的凋亡密切相关，JAK2蛋白表达越高，软骨细胞凋亡越严重。Caspase途径是细胞凋亡的主要途径［23］，Caspase-3 在细胞凋亡中起至关重要的作用，是细胞凋亡过程中最重要的终末剪切酶，被称为“死亡蛋白酶”，主要在凋亡的执行阶段发挥重要作用，损伤DNA，导致其复制、转录及修复受到严重损害［24-25］。陈喜德等［26］用大鼠制作 KOA 模型，采集不同时间段模型鼠的软骨组织，并检测Caspase-3蛋白的表达，结果发现，Caspase-3与软骨细胞凋亡程度呈正比。本研究结果与文献［26］报道一致。

本研究构建了KOA 大鼠模型，随着时间延长，模型大鼠膝关节软骨TUNEL 染色的阳性区域也随之增加，Mankin's评分逐渐升高，提示大鼠膝关节的病理性破坏程度逐渐加重，KOA 逐渐进展。本研究发现，随着骨关节病变的进展，KOA 大鼠膝关节软骨内Piezo1蛋白表达也随之升高，并伴有JAK2的激活。Pearson相关性分析显示，关节软骨TUNEL染色的阳性区域与 Piezo1、JAK2、p-JAK2 及 Caspase-3 蛋白表达存在明显的正相关关系。说明Piezo1/JAK2信号通路可能参与了KOA 膝关节软骨细胞的凋亡过程。

在研究过程中，因考虑雌性大鼠性别或体内激素水平可能对本实验造成的影响，本实验未选用雌性大鼠。同时，因实验条件受限，样本量较少；也未能对JAK2 的下游信号STAT3 做进一步研究，这将是我们未来研究的方向。