DLGAP5 在胶质瘤组织中的表达及临床意义

白吉林 ，张权 ，张志龙 ，张墨轩 ，刘伟 ，张健

1 潍坊医学院，山东潍坊 261053；2 临沂市人民医院神经外科

胶质瘤是指起源于神经胶质细胞的肿瘤，是颅内最常见的原发性肿瘤，81%颅内恶性肿瘤为胶质瘤［1］。根据WHO 中枢神经系统肿瘤分类，胶质瘤分成Ⅰ～Ⅳ级，Ⅰ、Ⅱ级为低级别胶质瘤，Ⅲ、Ⅳ级为高级别胶质瘤。在原发性恶性中枢神经系统肿瘤中，胶质母细胞瘤（GBM，WHO Ⅳ级）的发病率最高，约占46.1%；预后最差，中位总生存期仅12～15 个月［2］。胶质瘤目前尚无根治方法，由于其具有浸润性生长的特点，常与周围正常脑组织边界不清，手术治疗常无法彻底切除，需要辅助放疗、化疗、免疫治疗、靶向治疗等手段，以延长患者生存期和提高患者生存质量［3］。因此，深入研究胶质瘤相关的分子靶点及其信号传导通路，进行有针对性的靶向治疗对于提高胶质瘤患者的生存期具有重要意义。Discs大同源相关蛋白5（DLGAP5）也称为肝癌上调蛋白（HURP），是DLGAP家族成员之一，是一种细胞周期调控基因的表达产物，具有促进微管聚合和促进纺锤体形成的功能［4］。DLGAP5 是基因编码的一种细胞周期调控的微管相关蛋白，作为Ran GTPase 效应子，参与有丝分裂着丝粒纤维的稳定调控［5］。 既往研究表明，DLGAP5 在肝癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、直肠癌中具有明显促进肿瘤生长的作用［6-8］。但是，DLGAP5 在胶质瘤发展中的作用尚不清楚。为此，本研究对DLGAP5在胶质瘤组织中的表达及其预后意义进行了探讨。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取 2010 年 7 月—2016 年 7 月在临沂市人民医院行胶质瘤切除术患者65 例，男34例、女 31 例，年龄 2～70 岁、平均年龄 44 岁。肿瘤位置：额叶 31 例，颞叶 24 例，其他 10 例；肿瘤大小：长径＜5 cm 31 例，≥5 cm 34 例；WHO 分级：Ⅰ、Ⅱ级 26例，Ⅲ、Ⅳ级 39 例；p53 分型：野生型 36 例，突变型29 例。纳入标准：①所有病例术前未进行放化疗、免疫治疗等；②所有病例具有手术指征，且自愿手术；③所有病例经术后病理证实为胶质瘤。排除标准：①伴有其他部位恶性肿瘤或者二次手术者；②病例资料已缺失者；③围术期死亡者。本研究已获得医学伦理委员会准许，患者或家属签署知情同意书。

1.2 胶质瘤DLGAP5蛋白表达检测

1.2.1 DLGAP5 表达定性检测 采用免疫组化法。将65 例患者癌旁组织及胶质瘤组织标本进行石蜡包埋，以3 µm 厚度切片，70 ℃烘烤40 min，石蜡切片常规脱蜡水化后，柠檬酸修复液中抗原修复，在冷却至室温后移至湿盒中，滴加过氧化物酶阻断剂，PBS冲洗，加入1∶200稀释DLGAP5抗体（Affinity，China），4 ℃孵育过夜后PBS漂洗。滴加反应增强液和抗鼠/兔IgG二抗在室温下孵育30 min，加入少量二甲基苯胺显色5 min，流水冲洗，苏木素复染，氨水返蓝，梯度乙醇脱水，二甲苯固定，石蜡封片，在显微镜下进行观察，细胞核和细胞质中出现棕黄色颗粒即判定为DLGAP5阳性细胞。每个切片随机选取10个视野，对每个视野中DLGAP5阳性细胞占比和染色强度水平进行评分，取平均值。染色强度评分：使用0、1、2、3分依次代表染色程度阴性、弱阳性、阳性、强阳性；DLGAP5阳性细胞占比评分：视野中无阳性细胞为0分，阳性细胞低于25%为1分，阳性细胞25%~50%为2分，阳性细胞大于50%为3分。以染色强度评分与阳性细胞占比评分综合判断阳性表达，二者评分乘积≥1时评定为DLGAP5 阳性表达，其中DLGAP5 低表达为评分≤4分、DLGAP5高表达为评分＞4分。观察结果由2名资深病理科医生双盲独立阅片判定。

1.2.2 DLGAP5 表达定量检测 采用Western blotting法。在65例患者癌旁组织及胶质瘤组织标本中随机抽取10 例癌旁组织及30 例胶质瘤组织（Ⅰ、Ⅱ级胶质瘤15 例，Ⅲ、Ⅳ级胶质瘤15 例）。将胶质瘤组织在液氮作用下研磨，全蛋白提取试剂混匀后提取总蛋白，二喹啉甲酸试剂盒在酶标仪下测定各级别胶质瘤蛋白浓度。于10% SDS-PAGE 中进行蛋白分离，转膜，封闭后加入 1∶2 000 稀释 DLGAP5 抗体（Affinity，China），放置4 ℃过夜孵育PBST 洗膜，加入抗兔酶标记二抗（Cell signaling，USA），摇床孵育 1 h，PBST 洗膜 3 次，吸取 ECL 超灵敏型检测试剂均匀滴于PVDF 膜上进行化学发光显影，观察DLGAP5 表达。每例标本检测均重复3 次以上，取平均值。

1.3 DLGAP5 表达与预后关系分析 所有患者出院后通过电话定期联系或患者自行门诊复查随访，随访截至2021年7月，统计术后生存率，比较胶质瘤组织DLGAP5不同表达患者生存率的差异。

1.4 统计学方法 采用SPSS23.0 统计软件。计量资料符合正态分布以表示，组间比较采用t检验。计数资料以例数或百分比表示，比较采用方差分析或χ2检验。对DLGAP5表达与临床病理参数之间的关系进行单因素和多因素分析，使用Kaplan-Meier 法绘制DLGAP5 不同阳性表达患者的生存曲线。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DLGAP5 定性表达 免疫组化检测显示，胶质瘤组织65例份，DLGAP5均为阳性表达，其中高表达37例份，低表达28例份。WHO分级Ⅰ、Ⅱ级26例份，DLGAP5高表达10例份，高表达率为38.5%；Ⅲ、Ⅳ级39例份，DLGAP5高表达27例份，高表达率为69.2%；不同WHO分级胶质瘤组织DLGAP5表达比较差异有统计学意义（P＜0.05）。癌旁组织未见DLGAP5阳性表达。见图1。

图1 DLGAP5 分别在癌旁组织和WHO Ⅰ～Ⅳ级胶质瘤中免疫组化表达（×400）

2.2 DLGAP5 定量表达 癌旁组织、胶质瘤Ⅰ～Ⅱ级、Ⅲ～Ⅳ级组织DLGAP5相对表达量分别0.102±0.004、0.309 ± 0.237、1.108 ± 0.237，癌旁组织、胶质瘤Ⅰ～Ⅱ级、Ⅲ～Ⅳ级组织DLGAP5 相对表达量比较差异均有统计学意义（P均＜0.05）。见图2。

图2 癌旁组织和WHO Ⅰ～Ⅳ胶质瘤组织DLGAP5蛋白表达电泳图

2.3 DLGAP5 表达与胶质瘤患者临床病理参数的关系 不同WHO 分级及不同类型p53 表达患者DLGAP5 表达比较均有统计学差异（P均＜0.05），不同年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤位置患者DLGAP5 表达比较均无统计学差异（P均＞0.05）。见表1。

表1 DLGAP5表达与胶质瘤患者临床病理参数的关系［例（%）］

2.4 胶质瘤患者DLGAP5表达的影响因素 Logistic回归分析显示，WHO 分级、p53 分型是胶质瘤患者DLGAP5表达的独立影响因素（P均＜0.05）。见表2。

表2 胶质瘤患者DLGAP5表达影响因素的Logistic回归分析

2.5 DLGAP5 表达与胶质瘤患者预后的关系 随访（45.153 ± 31.232）个月，随访期间无失访患者，死亡33例，存活32例，存活率为49.2%。其中，胶质瘤组织DLGAP5 高表达患者生存率为29.7%（11/37），DLGAP5 低表达患者生存率为75.0%（21/28），DLGAP5 高表达患者生存率低于其低表达患者（P＜0.01）。胶质瘤中DLGAP5 不同表达患者生存曲线见图3。

图3 胶质瘤DLGAP5不同表达患者的生存曲线

3 讨论

胶质瘤是临床最为常见的颅内原发恶性肿瘤，具有复发率高、侵袭性强、生存时间短和病死率高等特点。目前，胶质瘤主要依靠CT和MRI等影像学检查进行初步诊断，治疗方式以手术切除肿瘤为主，并结合放疗和（或）化疗等综合性治疗［9］。2021 版WHO中枢神经系统肿瘤分类中，胶质瘤分级标准的更新和修改主要是以分子病理为主，改变了基于组织病理和显微镜分级的旧原则，将分子亚分型用于肿瘤的分类。但是，决定胶质瘤异质性的分子标志物较复杂，不可能通过几个基因的改变而对肿瘤产生决定性影响［10-11］；而且细胞中信号通路互相连接，单一药物治疗患者较难出现有效反应。因此，联合疗法改善肿瘤内环境、杀伤肿瘤细胞仍是目前最有效的治疗方式［12］。

近年来，高通量测序技术和基因芯片技术的发展推动了分子革命，为癌症生物学分子机制的研究提 供 了 前 所 未 有 的 机 遇［13］。 DLGAP5 又 称 为HURP、DLG7 等，位于染色体 14q22.3 区域，编码的蛋白质主要由805 个氨基酸残基构成，定位于纺锤体［5］；DLGAP5 的保守 N 端结构域可以与微管结合，具有促进微管聚合和促进纺锤体形成的功能，参与有丝分裂着丝粒纤维的稳定调控［14］。DLGAP5 水平与细胞周期有关，可在有丝分裂早期持续高表达而在后期逐渐下降，主要影响细胞周期G2/M 期细胞［15］。研究发现，结直肠癌中DLGAP5 表达与淋巴结转移状态及晚期结直肠癌分期有关，DLGAP5 表达下调导致结直肠癌的侵袭和迁移能力下降［16］。另有研究显示，在肝癌组织中DLGAP5过表达，同时促进了肝肿瘤细胞的侵袭、迁移和黏附［17］，这一现象在DLGAP5 表达下降后消失；相较于正常组织，肝癌组织中DLGAP5 启动子甲基化显著降低，猜测DLGAP5 在肝癌中的差异表达可能与DLGAP5 基因启动子的甲基化水平有关。

有研究发现，胶质瘤组织中存在多个影响肿瘤生长的蛋白因子。LMNB1、DLGAP5 在少突胶质细胞瘤、星形细胞瘤和GBM 中存在高表达，DLGAP5在胶质瘤前神经亚型、IDH1野生型患者中存在高表达，提示DLGAP5 可能在不同分子亚型胶质瘤中发挥不同作用，LMNB1、DLGAP5可能是胶质瘤的关键标志物分子。本研究发现，胶质瘤组织中DLGAP5阳性表达远高于其癌旁组织，DLGAP5 表达与不同WHO 分级和p53不同类型相关，WHO 分级和p53分型是影响胶质瘤患者DLGAP5 表达的独立危险因素，DLGAP5 高表达患者术后生存时间明显缩短。在肿瘤组织中，DLGAP5 表达与 p53 分型有关［18］，DLGAP5 过表达可以通过增加MDM2 介导的泛素化和蛋白酶体降解，降低p53野生型蛋白的稳定性，从而增强细胞增殖能力。在卵巢癌中，下调DLGAP5表达后可发生G2/M期细胞阻滞和凋亡，显著抑制细胞增殖［15］；此时，CDK1、Cyclin 和 Bcl-2 表达下调，Bax 表达增加；而在DLGAP5 显著上调后，抗凋亡因子增多，恶性肿瘤增殖加快，卵巢癌患者预后变差。研究显示，敲除DLGAP5与多西他赛对抑制细胞增殖有强烈的协同效应［19］，DLGAP5在稳定多西他赛对纺锤体形成和微管攻击方面有独特作用，在这两种因素作用下，肿瘤细胞增殖则停滞于有丝分裂中期。

综上所述，DLGAP5 在胶质瘤中组织中过表达，DLGAP5 表达程度与肿瘤组织 WHO 分级、p53 分型以及患者生存时间有关，提示DLGAP5 有可能成为判断胶质瘤预后的新型生物学标志物。但是，关于DLGAP5 在胶质瘤发生、发展中的信号通路及具体机制还需要进行更深入的研究。