新型滴鼻灭活鹦鹉热衣原体疫苗的免疫效力评价

陈思宇，隋卓君,王占新，李 强，陈 艺，王 飞，陈 爽,刘心怡，严专强，何 诚

(1.中国农业大学动物医学院，中巴农业科技创新与服务中心，北京100193；2.温氏食品集团股份有限公司，云浮 527499)

鹦鹉热衣原体是一类专性寄生于真核细胞内的革兰氏阴性病原体，可引起多种动物顽固性呼吸道和消化道疾病，威胁着畜牧业的健康发展[1]。鹦鹉热衣原体病在人群中也时有暴发，尤其是密切接触宠物鸟和家禽的人群。Hogerwerf等[2]统计结果显示，鹦鹉热衣原体感染造成1%社区获得性肺炎，新发和死亡病例报道不断增加，所以鹦鹉热衣原体的防治具有重大的公共卫生防控意义。寻找安全有效防治衣原体疾病的手段，研发制造新型的方便且安全有效的衣原体疫苗，防治鹦鹉热衣原体的感染成为亟需解决的问题[3-4]。

佐剂可增强动物机体对于疫苗抗原成分的特异性免疫应答,包括免疫刺激复合物(lipophilic immune response stimulating complex，ISCOM)、霍乱弧菌菌影(Vibriocholeraeghosts，VCG)、寡聚脱氧核苷酸(CpG)佐剂、壳聚糖凝胶(Gel)佐剂等。其中ISCOM拥有抗原呈递和佐剂的双重功效，刺激体内的免疫细胞活化[5]。VCG在形态结构上与天然活菌有着高度相似性，可有效增强沙眼衣原体MOMP蛋白刺激动物机体产生高水平的体液免疫应答和Th1型免疫应答，诱导树突状细胞(dendritic cell，DC)的活化和增强Toll样受体的反应性[6]。CpG 能模拟细菌 DNA 的免疫刺激活性，有效增强免疫细胞的活性，在机体抵抗病原体入侵和抗肿瘤等方面发挥一定的作用[7]。Gel有较高的生物安全性，可包裹抗原促使其持久缓慢释放。Dixit等[8]运用纳米材料作为MOMP肽M278的佐剂，两者联合制作衣原体疫苗，结果显示可诱导机体产生高水平的特异性抗体。衣原体相关的疫苗需诱导高水平细胞免疫的佐剂，以实现诱导Th1型免疫应答和消除衣原体在细胞内的寄生。

本研究旨在探究VCG和Gel复合佐剂通过呼吸道免疫途径增强鹦鹉热衣原体灭活原体(elementary body,EB)免疫应答特点，以期为鹦鹉热衣原体防控提供新的技术途径。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物 60只7日龄SPF公鸡购自北京勃林格殷格翰实验动物有限公司，实验动物质量合格证编号为110321210100412264。所有动物操作和管理严格遵循2017年修订版《实验动物管理条例》进行，试验方法及试验流程经中国农业大学实验动物保护和利用委员会(IACUC)批准。

1.1.2 免疫材料 鹦鹉热衣原体6BC株由中国农业大学动物医学院禽衣原体实验室提供。VCG和Gel均由中国农业大学动物医学院禽衣原体实验室制备。衣原体灭活抗原由鹦鹉热衣原体6BC株通过紫外线灭活30 min后备用；VCG通过抗生素处理进行杀灭。采用膜过滤法对其进行抽提和过滤，去除内毒素，保留其蛋白外壳。

1.1.3 试剂盒 鸡鹦鹉热衣原体ELISA抗体检测试剂盒由中国农业大学动物医学院研制，包被物为MOMP抗原；鸡细胞因子(白介素-4(IL-4)、IL-10、IL-12和干扰素-γ(IFN-γ))检测试剂盒均购自 Kingfisher Biotech 公司；衣原体LPS荧光染色试剂盒购自Thermo fisher公司；BrdU 细胞增殖 ELISA 检测试剂盒购自Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 试验动物分组及免疫 60只7日龄SPF公鸡随机分成4组，分别为：壳聚糖凝胶对照组(Gel组)、鹦鹉热衣原体灭活EB对照组(EB组)、EB+VCG和EB+VCG+Gel组，每组15羽。 7 日龄时，4组鸡经滴鼻途径免疫含有不同佐剂的疫苗，200 μL/羽，免疫程序为免疫2次，中间间隔14 d。试验动物分组及免疫程序见表1。

表1 试验动物分组及免疫程序

1.2.2 免疫后检测指标 首免后第7、14、21和28天采集翅静脉血液样本，分离血清，以鹦鹉热衣原体ELISA检测试剂盒检测其血清中的特异性IgG抗体水平。

脾脏淋巴细胞刺激指数和细胞因子测定：首免后28 d无菌采集10只SPF鸡脾脏，通过70 nm尼龙膜网筛制备单淋巴细胞悬液，进行计数，调整细胞量为1×106/mL。利用BrdU特异性染料进行标记，以灭活的鹦鹉热衣原体纯化EB为刺激物，感染复数(multiplicity of infection，MOI)为1时测定淋巴细胞增殖能力。利用酶标仪在450 nm波长下进行测定，淋巴刺激指数(%)=D450 nm值刺激组/D450 nm值对照组×100%。以特异性细胞因子试剂盒检测上述淋巴细胞培养上清细胞因子IL-4、IL-10、IL-12和IFN-γ含量。

CD4+T细胞与CD8+T细胞比例：调整上述单淋巴细胞悬液细胞量为1×105/mL。利用特异性抗鸡的荧光标签与淋巴细胞避光共孵育30 min， 通过流式细胞仪测定其比例，评价免疫后鸡的免疫应答状态。

1.2.3 攻毒后检测指标 首免后28 d对各组剩余的5只SPF鸡进行喉头攻毒，每只鸡100 μL (108IFU/mL)鹦鹉热衣原体EB。攻毒后检测鸡喉头排菌量，剖检后评价肺脏病变情况。

排菌量检测：攻毒后每隔3 d，用无菌医用棉签采集鸡喉头拭子，通过免疫荧光抗体试剂盒进行计数，评价各组对衣原体的清除效果。

肺脏剖检积分：攻毒后7 d，将每组5只鸡麻醉后颈动脉放血处死并进行剖检，观察各脏器的病理变化，针对肺脏损伤进行评分，得分为双侧统计总和。评分标准：单侧肺脏，单侧评分后需两侧相加：0分，肺脏正常，无明显病理变化；1分，肺脏30%左右面积出血性坏死变化；2分，肺脏60%左右面积出血性或坏死性变化；3分，肺脏80%左右面积出血性或坏死性变化；4分，肺脏全部面积出血性或坏死性病理变化[9]。

1.3 统计分析

试验数据使用SPSS 25.0软件进行统计分析，符合正态分布的数据包括淋巴细胞增殖、细胞因子浓度采用单因素方差分析进行比较，利用最小显著差异法(least significant difference，LSD)进行多重比较。抗体滴度和肺脏衣原体 DNA载量的数据，取对数转化为线性数据后，采用与上述同样的方法进行分析,结果用平均值±标准差表示。病变评分使用Wilcoxon and Mann-Whitney检验进行分析。图像均由GraphPad Prism 7.0软件生成。P<0.05表示差异显著,P<0.01表示差异极显著。

2 结 果

2.1 免疫后IgG特异性抗体水平

首免后第7、14、21和28天采集各组SPF鸡翅静脉血液，分离收集血清，检测鹦鹉热衣原体特异性抗体水平。由图1可知，IgG抗体水平呈持续上升趋势，Gel组呈现较低的IgG抗体水平;EB+VCG组诱导中等抗体水平;EB+VCG+Gel组诱导的抗体水平分别显著和极显著高于EB+VCG和EB组(P<0.05;P<0.01)。

2.2 免疫后脾脏淋巴细胞增殖特点

由图2可知，Gel组呈现最低的淋巴细胞刺激指数，EB组诱导较低的淋巴刺激指数，高于Gel组;EB+VCG和EB+VCG+Gel组诱导较高的脾脏淋巴刺激指数，且显著性高于EB组(P<0.05)，极其显著性高于Gel组(P<0.01);EB+VCG和EB+VCG+Gel组之间无显著性差异(P>0.05)。

2.3 免疫后脾脏细胞因子表达水平

IL-4、IL-10、IL-12和IFN-γ含量检测结果见图3。由图3可知，Gel和EB组细胞因子水平较低;EB+VCG和EB+VCG+Gel组诱导IL-12和IFN-γ含量，其中EB+VCG+Gel组诱导的IFN-γ含量极显著高于EB组(P<0.01)，显著高于EB+VCG组(P<0.05)；各组间IL-4和IL-10含量均无显著差异(P>0.05)。

*,差异显著(P<0.05)；**，差异极显著(P<0.01)。ns,差异不显著(P>0.05)。下同*,Significant difference (P<0.05);**,Extremely significant difference (P<0.01).ns,Difference was not significant (P>0.05).The same as below图1 免疫后IgG特异性抗体水平Fig.1 Specific IgG responses against Chlamydia psittaci post immunization

图2 免疫后脾脏淋巴细胞增殖指数Fig.2 Proliferation index of lymphocyte in different groups after immunization

图3 免疫后脾脏上清液细胞因子含量Fig.3 Cytokine contents of spleen supernatants post immunization

2.4 免疫后脾脏淋巴细胞分化情况

免疫后采集鸡脾脏，制作单细胞淋巴悬液，通过流式细胞仪检测免疫后机体内CD4+T细胞与CD8+T细胞比例。 由图4、5可知，Gel和EB组中CD4+/CD8+T细胞比值较低；EB+VCG组和EB+VCG+Gel组CD4+/CD8+T细胞比值显著或极显著高于EB和Gel组(P<0.05；P<0.01)；EB+VCG和EB+VCG+Gel组之间无显著差异(P>0.05)。

2.5 攻毒后鹦鹉热衣原体的外排情况

采集喉头拭子，通过直接免疫荧光检测鸡的排菌量，结果见图6。由图6可知，Gel和EB组攻毒12 d后仍保持较高的排菌量，与这2组相比，EB+VCG和EB+VCG+Gel组排毒量均极显著降低(P<0.01)；EB+VCG+Gel组攻毒后第9天喉头外排衣原体水平明显降低，提示EB+VCG+Gel组诱导的免疫应答可更快地清除体内的衣原体。

2.6 攻毒后鸡肺脏病理损伤

攻毒后第7天，剖检观察各组鸡脏器的病理学变化，针对肺脏进行损伤评分。由图7、8可知，Gel和EB组表现出严重的肺部出血、纤维素样渗出，部分鸡肺脏出现实变，肺脏损伤评分较高；EB+VCG组大体病变呈现无可见的渗出性炎症，肺脏损伤评分显著低于Gel和EB组(P<0.05)，VCG+Gel+EB组肺脏损伤评分极显著低于Gel和EB组(P<0.01)，同时低于EB+VCG组，但差异不显著(P>0.05)，说明VCG可起到较好的免疫保护效力，且三者联用效果最佳。

①A，Gel组；B,EB组；C，EB+VCG组；D，EB+VCG+Gel组。图7同。②Q1,CD4+CD8-;Q2,CD4+CD8+;Q3,CD4-CD8+;Q4,CD4-CD8-①A，Gel group；B，EB group；C，EB+VCG group；D，EB+VCG+Gel group.The same as fig.7.②Q1,CD4+CD8-;Q2,CD4+CD8+;Q3,CD4-CD8+;Q4,CD4-CD8-图4 免疫后CD4+ T细胞与CD8+ T细胞流式细胞图Fig.4 CD4+ T cells and CD8+ T cells flow cytometry post immunization

图5 免疫后CD4+/CD8+ T细胞比值Fig.5 Ratio of CD4+/CD8+ T cells post immunization

图6 鹦鹉热衣原体攻毒后喉头排菌量测定Fig.6 Determination of throat excretion of Chlamydia psittaci after challenge

图7 鹦鹉热衣原体攻毒后肺脏病变情况Fig.7 Pathological changes of lung after Chlamydia psittaci challenge

图8 鹦鹉热衣原体攻毒后肺脏损伤评分Fig.8 Assessment of lung lesions post challenge

3 讨 论

本试验用的新型鹦鹉热衣原体疫苗由VCG、壳聚糖凝胶作为佐剂，其中壳聚糖凝胶与灭活的EB以静电吸附方式结合，衣原体抗原附着在壳聚糖凝胶上，保证了衣原体抗原在呼吸道黏膜上缓慢释放，实现了持续刺激呼吸道黏膜免疫。壳聚糖是一种天然阳离子多糖，其具有良好生物相容性、生物可降解性和黏膜黏附性[10]。为弥补壳聚糖不溶于水的缺点，Pawar等[11]评估了乙二醇壳聚糖(glycol chitosan，GC)纳米粒子，以获得经鼻腔施用乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的全身和黏膜免疫应答，认为GC是一种与亲水性乙二醇分支结合的水溶性两性离子壳聚糖衍生物。壳聚糖可延长并维持抗原在不同黏膜系统中的停留时间[12]。此外，壳聚糖还具有高表面积与体积比及在一系列离子条件下的稳定性，这使其适用范围更加广泛[13]。壳聚糖纳米粒子包埋的抗原可增强呼吸道的黏膜IgA反应并在感染动物中提供有效保护[14]。由于壳聚糖所具备的各项优点，美国食品药品监督管理局(FDA)批准了该聚合物可用于伤口敷料和组织工程中[15]。Li等[16]采用壳聚糖纳米颗粒作为佐剂的疫苗同时对小鼠进行肌肉和鼻内免疫，诱导了针对鹦鹉热衣原体的强烈体液、黏膜免疫和细胞介导免疫应答，从而通过降低小鼠的鹦鹉热衣原体载量并清除鹦鹉热衣原体以达到预防呼吸道衣原体感染的目的。Fairley等[17]利用聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)包裹MOMP制作疫苗，免疫小鼠后可促使其机体细胞和体液免疫应答显著增强。本试验采用的壳聚糖凝胶具有较强的黏膜吸附作用，可于免疫部位吸附抗原从而使其持久缓慢释放，以达到长期有效的刺激效果，获得持续稳定的特异性抗体水平。

VCG佐剂具有成本低廉、易于大量制备、安全性好、长时间稳定存在等优点。Eko等[18]利用VCG作为递呈系统，递呈沙眼衣原体的MOMP蛋白，发现rVCG载体本身具有佐剂的性质，刺激宿主产生强力的Th1型免疫应答，同时产生很好的体液免疫。进一步利用rVCG平台同时表达Omp1和Omp2 2个抗原蛋白，证明二价苗的免疫效果明显优于单独任何一个抗原。此外发现二价苗rVCG-PmpD/PorB不仅能有效刺激机体的免疫应答、抵抗衣原体的感染，同时能产生免疫记忆抵抗衣原体的再次感染。潘青[19]发现，rVCG-Pmp18D能促进DC成熟，上调表达CD40、CD80、CD86、MHCⅡ分子，同时高表达细胞因子IL-1β、IL-6、IL-12 p70和MCP-1，增强DC的抗原递呈功能，促进T细胞向Th1型免疫应答分化。本试验也验证了VCG+EB组无论在诱导脾脏淋巴细胞增殖、CD4+/CD8+T细胞比例、IFN-γ和IL-2等细胞免疫应答水平，还是在特异性抗体水平上都显示了良好的增强作用。

目前，鹦鹉热衣原体在不同家禽群体饲养中呈现较高的感染率，其中肉鸽、鸭是主要的感染宿主。随着全基因测序的推广和应用，鹦鹉热衣原体致死人的报道不断增加。家禽衣原体疫苗以注射免疫为主，如鸡衣原体基因工程疫苗。对于大规模、集约化饲养及体型较大的种禽(种鸭、种鹅)，注射免疫存在种禽应激较大、人员劳动强度过大、动物福利差等不利因素。本试验结果表明，VCG+Gel+EB疫苗可通过滴鼻免疫方式诱导鸡群获得高水平的免疫保护，提示新型疫苗可采用气雾免疫的方式实现大规模免疫，增强呼吸道黏膜免疫保护，阻断鹦鹉热衣原体通过呼吸道入侵，可实现理想的免疫保护，从而阻断鹦鹉热衣原体从动物群体向人群传播。

壳聚糖凝胶可增强抗原黏附呼吸道黏膜的时间，持续刺激机体IgA反应，促使其在感染动物中提供有效保护。VCG可起到良好的递呈抗原作用[20]。本研究通过滴鼻免疫后测定IgG抗体水平、脾脏淋巴细胞增殖和细胞因子的应答特点，攻毒后喉头排出衣原体含量、肺脏损伤评分结果显示VCG+Gel+EB疫苗优于VCG+EB疫苗、灭活的EB疫苗，尤其可缩短排毒时间，这提示VCG与壳聚糖凝胶佐剂可增强鹦鹉热衣原体灭活EB抗原的免疫保护效果，VCG+Gel+EB疫苗是一种新型黏膜免疫疫苗，有望开发成为防治鹦鹉热衣原体的新型疫苗，丰富衣原体防治的技术措施。

综上，本研究研制的VCG+Gel+EB滴鼻疫苗可诱导机体产生较强的细胞免疫和体液免疫应答，获得较高的免疫攻毒保护效果，用于防治鹦鹉热衣原体。这种滴鼻免疫的接种方式也可进一步升级为气雾免疫方式，更加快速便捷，用于集约化养殖企业体重较大的种禽时可减少免疫应激，降低人员劳动强度和提高动物福利。

4 结 论

由灭活鹦鹉热衣原体EB、VCG、壳聚糖凝胶制备的新型鹦鹉热衣原体黏膜疫苗经鼻腔免疫后可提供较强的免疫保护力，阻断鹦鹉热衣原体从动物群向人群的传播。