非洲猪瘟诊断方法研究进展

程 晶，刘文晓，王晓玥,2，王丽萍，江 波，李永清

(1.北京市农林科学院畜牧兽医研究所，北京 100097；2.北京农学院，北京 102206；3.青岛易邦生物工程有限公司，青岛 266032)

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起的一种猪的急性、烈性传染病[1-2]。由于其接近100%的致死率，ASF给世界上许多国家的养猪业造成了毁灭性打击，因此ASF被世界动物卫生组织(World Organization for Animal Health，OIE)列为法定报告动物疫病，中国将其划分为一类动物疫病。2018年8月初，该病在中国辽宁沈阳首次发现，之后半年多的时间迅速蔓延至中国31个省份[3-4]。据不完全统计，2019年中国的总体生猪产能与2018年相比降低了40%，生猪出栏量及猪肉产量下降幅度超过20%，给中国生猪产业的发展带来了巨大的冲击[5]。

由于目前尚无有效疫苗和药物用于预防和治疗ASF，因此必须在早期发现和严格的生物安全措施的基础上消除已存在的病毒，并有效切断病毒再次进入养殖场的途径达到预防和控制的目的[6]。为控制ASF疫情的扩散，农业农村部制定并出台了一系列政策，包括《非洲猪瘟等重大动物疫病分区防控工作方案(试行)》、《非洲猪瘟疫情应急实施方案(第5版)》等。这些政策要求养殖者对ASF疫情做到尽早发现、及时确诊、果断处理。早期发现应以现场快速识别疾病为基础，然而ASF的临床症状易与经典猪瘟和高致病力猪繁殖与呼吸综合征等败血性疾病混淆，因此,进行病原检测对该病的控制至关重要。近年来，国内外科研人员在ASF诊断监测技术的研究与开发工作取得了重大成效,不仅有能检测潜伏期感染的病毒病原检测技术，也有能检测早期抗体的血清学监测技术。笔者介绍了当前ASF诊断技术的新特点，并对未来改进诊断策略前景进行了展望，以期为制定ASF的防控策略提供借鉴。

1 ASF的诊断标识

ASFV是非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属的唯一成员，是具有双层膜结构的200 nm的大型DNA病毒。 ASFV基因组为线性双链DNA，大小为170～193 kb，包括151～167个开放性阅读框，可编码近200种病毒蛋白，其中至少有54个结构蛋白[7]。研究发现，50余种病毒蛋白可在感染猪体内诱导免疫应答[8-9]，如pp220、pp62、p72、p54、p30、CD2v、p10、p12、p14.5、p17、pA104R、pB602L和pK205R等。目前已知具备诊断标识的蛋白有p30、p54、p72、pK205R、pB602L、p104R和pK145R等。ASFV重要的结构蛋白p54、p30、p73和p72可用作血清学诊断的抗原。

p54蛋白由基因E183L编码，分子质量为25 ku,该蛋白位于病毒粒子脂质外膜上，参与病毒吸附、侵入、复制及诱导特异性抗体的产生,其抗原性良好，针对p54蛋白的抗体可在猪感染ASFV 8 d后出现，并可持续数周[10-11]。

p30蛋白由CP204L基因编码，分子质量为30 ku，该蛋白也在病毒感染早期合成，与病毒入侵宿主细胞有关，抗原性强[12]。ASFV感染后2～4 h 即可表达p30蛋白，并持续表达整个感染过程，该蛋白的表达可指示病毒已侵入细胞并开始复制[13-14]，因此,p54和p30蛋白是2个在病毒感染早期表达的蛋白，可作为早期检测的靶标[15-16]。

p72蛋白由B646L(VP72)基因编码，分子质量为73.2 ku，在病毒感染的晚期阶段表达，是病毒粒子核衣壳的主要组成部分，具有很高的抗原性与免疫原性[17-18]。

CD2v蛋白(又称为PEP402R)类似于T细胞表面的CD2分子，为糖蛋白，由EP402R基因编码，表达于病毒感染晚期，其分子质量为105 ku。该蛋白与病毒毒力、宿主免疫应答及ASFV感染细胞的红细胞吸附现象有关，因此可基于CD2v的生物学特性建立红细胞吸附(haemadsorption，HAD)试验[19-21]。

此外，pK145R、pB602L和pK205R蛋白能诱导机体产生高水平的特异性抗体[22-23]，可用于ASFV的抗体与抗原检测，而病毒脱帽酶D250R或g5R对病毒复制至关重要，主要在病毒感染的早期表达，也有望作为ASFV感染早期诊断的靶抗原[24-25]。

2 ASF的诊断与检测技术

迄今为止，开发的ASF诊断与检测技术均是针对ASFV的结构蛋白及其编码基因。OIE推荐的实验室诊断方法包括两大类：一类是抗原检测法，包括病毒分离、病毒抗原及基因组DNA的检测；另一类是抗体检测，包括间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay,IFA)、酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)、免疫印迹试验等。病毒分离鉴定是ASF诊断的经典方法，始于20世纪60年代。该方法必须在生物安全3级(biosafety level 3,BSL-3)及以上实验室进行，对操作人员的技术要求较高，且需进行原代细胞培养，费时费力，因此该方法不再被推荐为ASF诊断的选择。HAD试验也曾是OIE推荐的ASFV特异性检测方法之一。大多数ASFV分离毒株在接种细胞48～72 h后出现红细胞吸附现象，由于猪红细胞能吸附在感染ASFV的单核细胞或巨噬细胞表面，形成特征性玫瑰花环，因此，HAD试验通常用于对分离培养的病毒进行鉴定，但该方法依赖于原代猪组织细胞培养，故耗时3～10 d，且会漏检一些无红细胞吸附能力的毒株，因此,不适合ASF的快速诊断[26-27]。

现行的检测方法主要集中于病毒核酸检测和血清学检测。前者包括不同类型的PCR基因扩增方法，后者则主要为IFA、ELISA及免疫胶体金等抗原抗体检测技术，由于各种检测方法的原理和适用场景不同，需根据当地实验室的诊断能力及样本质量选择适合的方法。为此，研究者也针对各种实际情况改进和创新了不同的检测技术。

2.1 病毒核酸检测方法

ASFV的病毒核酸检测方法主要有常规PCR、实时荧光定量PCR、微滴数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)、交叉引物扩增技术(crossing-priming amplification,CPA)、环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)、重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA)等。中国动物疾病预防控制中心已开展了2个批次ASF现场快速检测试剂评价工作。实时荧光定量PCR和LAMP为中国农业农村部推荐使用的现场快速诊断方法，目前公布的已批准或待批准(通过复核)的34个ASF现场快速检测试剂名单中，28个是实时荧光定量PCR，6个为等温扩增方法[28]。

2.1.1 基于常规PCR的核酸检测方法 PCR为ASFV的检测提供了一种广泛用于ASFV实验室诊断的灵敏、特异、快速的方法。目前基于所有ASFV毒株VP72序列高度保守区域的新型PCR显示出比OIE认可的常规PCR更高的灵敏度，且在此基础上建立的巢式PCR及多重PCR具有更高的灵敏度。PCR还具有对样品纯度要求低等优点，当腐败的组织样品不适合进行病毒分离或样品中的病毒已被灭活时，其仍是非常有效的检测方法，但常规PCR检测的样品数量少，不适合大规模检测[29-30]。然而，在此基础上发展的等温扩增技术，如RPA、CPA、LAMP及ddPCR则从不同方面克服了常规PCR的缺陷。

RPA和重组酶介导扩增技术(recombinase aided amplification,RAA)是利用重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶在37 ℃恒温下的核酸快速扩增技术。二者原理相同，唯一不同的是RPA所用重组酶来源于T4噬菌体，而RAA使用的是从细菌或真菌中获得的重组酶。二者的原理是重组酶与引物形成蛋白-DNA复合物，能在双链DNA中寻找同源序列。引物找到同源序列后，会发生链交换反应并启动DNA合成。反应过程迅速，可在10 min之内获得可检出水平的扩增产物。Ceruti等[31]以ASFV p72蛋白的编码基因B646L为模板，开发了一种以中性红为指示剂的实时RPA检测技术。该检测技术的分析灵敏度为3.5拷贝/μL，其敏感性和特异性均为100%,与OIE推荐的实时荧光定量PCR方法的符合率为100%，且只需简单的DNA分离步骤就能快速检测ASFV。研究表明，RPA/RAA可与横向流动检测(lateral flow assay，LFA)结合使用，可更直观地观察结果。Wang等[32]利用RPA扩增产物与LFA相结合，开发出金纳米粒子试纸条，该方法反应迅速，可特异性识别感染ASFV和经典猪瘟病毒(classical swine fever,CSFV)的血液样本中的ASFV，检测限(limit of detection,LOD)为102拷贝/μL，且实现快速扩增后对产物的肉眼观察，整个过程无需任何昂贵的仪器。Zhang等[33]利用RAA与LFA结合建立了一种灵敏、特异、快速和简单的即时检测血液样本中ASFV的方法RAA-LFA。RAA-LFA从采样到最终诊断确定的完整工作流程可在30 min内以最少的设备要求完成，包括简单稀释和煮沸5 min处理血样，在37 ℃水浴中使用RAA法等温扩增10 min，以及在室温下使用LFA视觉读数10～15 min，其结果比OIE推荐的PCR和实时荧光定量PCR灵敏10倍。RPA/RAA的缺点是检测成本较高，且单一温度低浓度模板扩增会导致产生非特定产物。

CPA技术是一种新型核酸等温扩增技术，是中国首个具有自主知识产权的核酸扩增技术[34]。其针对目的基因4或5个区域设计4或5条特异性引物，利用具有链交换特性的BstDNA聚合酶、甜菜碱，在65 ℃左右条件下高效、快速和高特异性扩增靶序列。Fraczyk等[35]设计5种交叉引物在63 ℃通过链置换扩增目标基因建立的CPA，无需初始变性步骤,不仅可检测血液和血清，且可检测到各种形式的猪肉产品中的ASFV，LOD达到7.2拷贝/μL。

ASFV检测的LAMP是当前研究热点的新型核酸扩增技术。其工作原理是针对目标DNA链上的6个区段设计4对不同的引物，利用链置换反应将基因模板、引物、链置换型DNA合成酶、基质等共同置于(60～65 ℃)恒温条件下扩增15～60 min，一个步骤完成。LAMP具有操作简单、灵敏度高、直观可视、不需检测仪器等特点，能满足基层快速诊断ASF的需求[36]。Wang等[37]以中性红作为比色指示剂建立了靶向ASFV拓扑异构酶Ⅱ基因的LAMP技术，可以对ASFV进行半定量检测，是中国农业农村部评价的第一批ASFV核酸检测试剂盒之一；Zhu等[38]将蜂巢芯片(Hive-Chip)与直接LAMP检测相结合建立了多元化、可视化的检测平台。 其设计了靶向5个ASFV基因(B646L、B962L、C717R、D1133L和G1340L基因)的LAMP引物并在Hive-Chip中预先固定。这种基于芯片的LAMP对模拟样本的LOD为30～50拷贝/μL，且靶基因之间没有交叉反应，整个检测过程不超过70 min，将是现场快速和准确检测ASFV的一个有前景的平台。但由于核酸气溶胶污染，LAMP技术假阳性较多，因此需进一步改进。

此外，ddPCR是结合液滴微流控芯片与数字PCR技术的一种新型技术。其原理是将水相溶液样品分成数万个纳升体积大小的微滴，经PCR扩增后对微滴进行逐个检测，含待检靶标的微滴有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0，根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例即可得出靶分子的起始拷贝数或浓度。这是一种不依赖于标准曲线即可实现DNA绝对定量的方法，与传统PCR相比，其灵敏度、特异性都很高，且适合基质复杂样品的检测，尤其是在病毒含量较低的潜伏期的组织。2017年，邬旭龙等[39]建立ASFV ddPCR，对163份国内和进境的组织样本及血清样本的LOD可达到0.36 拷贝,在20 μL反应体系中约为10 拷贝/反应,检测灵敏度是实时荧光定量PCR的10倍，因此可作为ASFV的实时监测时技术储备。 然而，该方法同样需昂贵的仪器设备,很难在基层推广。

2.1.2 基于实时荧光定量PCR的核酸检测方法 实时荧光定量PCR是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR过程，然后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。由于具有检测速度快(1 h)、结果客观、可定量基因组含量等优点，实时荧光定量PCR技术成为OIE、世界粮农组织(Food and Agriculture Organization,FAO)与中国推荐使用的检测ASFV的首选方法及金标准。研究人员在此基础上进行改良，建立了一系列的ASFV检测方法。王淑娟等[40]针对ASFV的p72基因和CSFV的5′-UTR序列的保守区域分别设计1对特异性引物和1条探针，建立了一种基于TaqMan MGB探针技术的FQ-PCR方法，能用于ASFV和CSFV快速鉴别检测，LOD为10 拷贝/μL，检测结果与猪瘟国标方法及OIE推荐的ASFV检测方法的符合率为100%。刘洋等[41]基于微芯片建立了ASFV免提取实时荧光定量PCR检测技术，可用于中国不同地区ASFV毒株的通用检测，LOD为10 拷贝/μL，与OIE推荐的实时荧光定量PCR检测方法符合率为100%，获得了农业农村部第一批ASFV现场快速检测试剂的推荐。为满足基层检疫的需要，Chen等[42]研发了一种用于ASFV按需检测的便携式磁流体装置。该设备采用微滴磁流体从血液、组织或拭子样本中自动纯化DNA，然后利用快速热循环进行实时荧光定量PCR。检测结果与参考实时荧光定量PCR阳性符合率达92.2%，阴性符合率为93.6%，具有很高的诊断准确性，且可在30 min内获得ASFV检测结果。由于所有的试验都在一个一次性墨盒里进行，不会对环境造成任何污染，因此适用于养猪场内现场检测。

2.1.3 基于CRISPR/Cas12a的核酸检测方法 CRISPR/Cas系统是古生菌和细菌中一种重要的适应性免疫系统，可对特定基因序列进行编辑。通过该技术对病毒基因进行缺失或改造可用于动物模型的制备、全基因组筛选、抗病毒及抗微生物和核酸检测等[43]。新发现的CRISPR-Cas12a蛋白分子质量比Cas9小，更易进入组织或细胞，且脱靶效应小，可更精确地选择切割靶标，因此基于CRISPR/Cas12a系统建立ASFV检测方法是近年来的研究热点[44]。Bai等[45]以VP72为靶标DNA，利用CRISPR/Cas12a系统检测到ASFV DNA与Cas12a/crRNA复合物降解的ssDNA报告基因的荧光信号，从而建立高度敏感的ASFV核酸检测方法,该方法不需要进行核酸扩增，在2 h内能完成检测，LOD为1 pmoL/L。Wang等[46]基于CRISPR/Cas12a技术和侧向流检测开发了一种适用于食品样品中的ASFV检测方法(CRISPR/Cas12a-LFD),该方法LOD为20拷贝/反应，与其他的猪病毒DNA没有交叉反应,对149份临床样本中ASFV的检测结果与实时荧光定量PCR的符合率为100%。Wu等[47]结合PCR方法与CRISPR/Cas12a系统建立了一种横向流动生物传感器(lateral flow biosensor,LFB)，可检测全血中的ASFV，直接通过肉眼观察结果，检测灵敏度可达2×10-15moL/L。由于CRISPR/Cas12a技术无需昂贵的仪器，为ASFV的检测提供了一种更加便携、简单、灵敏和特异性新型替代方法，因此其可能是ASF疫情的预防和控制措施中具有前景的研究方向。

2.2 血清学检测方法

ASFV感染后在猪体内引起强烈的体液免疫反应并持续很长时间。虽然产生的抗体不能完全中和再次感染的病毒，却能成为指示病毒感染的监测指标。尤其是当猪感染低毒力病毒株时，抗体检测可能是鉴别受感染动物的唯一方法。OIE推荐的检测ASFV抗体的方法包括ELISA、IFA、间接免疫过氧化物酶试验(indirect immunoperoxidase test，IPT)及免疫层析试纸条技术等。

2.2.1 基于ELISA的抗体检测方法 ELISA检测方法具备操作简便、检测快速、成本较低等优点而被广泛用于ASF检测，既可用于检测抗原，也可用于检测血清中的抗体。抗体检测ELISA是国际贸易指定检测低毒力和中等毒力ASFV感染猪的诊断方法。研究人员利用原核/真核系统表达重组蛋白建立了间接ELISA、竞争ELISA和阻断ELISA等多种ELISA方法。目前国外已上市商品化试剂盒，包括法国IDvet公司分别研发了针对p32、p62、p72蛋白的ASFV多抗体检测的间接ELISA试剂盒及针对p32蛋白的竞争ELISA检测试剂盒，西班牙Ingenasa公司利用VP72蛋白的单克隆抗体建立的阻断ELISA抗体检测试剂盒，瑞典Svanovir公司以p30蛋白为靶点建立的间接ELISA抗体检测试剂盒等。

此外，科研人员对ELISA方法进行技术改良，大大提高了ELISA方法的灵敏度和特异性。Yang等[48]利用化学发光法的自动化、灵敏度高、适合防疫过程中动态监测等优势对ASF ELISA技术进行改良。Chen等[49]使用2种抗ASFV p72的单克隆抗体M-5和M-6基于放大的发光数值建立了一种检测血清中ASFV的快速、免洗、一步式的ELISA(AlphaLISA)。AlphaLISA检测的线性范围为0.78～100 ng/mL，具有很高的敏感性。其对60份猪血清样本检测的灵敏度分别为93%和100%,特异性达到100%和91.7%。Giménez-lirola等[50]利用原核表达的重组蛋白p30制备了可用于检测血清和口腔液样品中的ASFV抗体。Nieto-pelegrín等[51]用半纯化的ASFV VP72蛋白和人胚胎肾细胞(HEK293T)表达的重组蛋白ASFV VP30作为检测抗原建立间接ELISA方法，首次在接种猪的粪便样品中检测到ASFV抗体。 以上这2种ELISA方法扩大了现场条件下ASF监测样品的范围。

2021年7月，中国动物疫病预防控制中心发布了ASFV抗体检测试剂盒名单，全国共计26个厂家33种ELISA抗体检测试剂盒通过实验室测评和专家评审，可用于临床猪血清ASFV抗体检测[52]。

2.2.2 基于荧光和酶标记的抗体检测方法 对于ASFV抗体检测，一般推荐使用ELISA大范围筛查抗体阳性样品，并采用IFA或IPT等血清学试验确认[53-54]。这是因为临床采集的血清处理或保存不当，如溶血样品可能会造成高达20%的假阳性结果。与ELISA检测一样，IFA和IPT均是通过特异性抗原抗体反应实现对ASF抗体的检测。IFA利用荧光标记的二抗，阳性血清能使ASFV感染的细胞出现特异性荧光。IPT利用阳性血清能与ASFV感染的细胞结合形成抗原抗体复合物，以辣根过氧化物酶标记的抗体作为二抗，与抗原抗体复合物结合，在细胞表明形成不溶性可见产物。因此，这2种具有高度敏感性和特异性的快速检测技术适用于从血清、血浆或组织渗出液中检测ASFV抗体。基于荧光酶学显色系统的发展，一种灵敏度比ELISA高的荧光标记抗体检测新方法得以开发。Liu等[55]于2021年成功研制了快速简便的荧光素酶免疫沉淀试验(MB-LIPS)方法，可来检测ASFV抗体。MB-LIPS是以ASFV p30蛋白作为识别元件，荧光素酶标记的重组融合蛋白修饰磁珠A/G作为信号成分，从而建立了ASFV感染早期的抗体检测方法。

2.2.3 基于免疫层析技术的抗体检测试纸条 免疫层析技术是基于抗原抗体特异性免疫反应的新型膜检测技术，这种方法操作简便、快速、特异性强，无需借助于大型仪器读取结果，因此更适于现场检测(pen-side test)。传统免疫层析技术以胶体金为标记物，通过条带显色对目标物定性检测或半定量分析。2014年，张鑫宇等[56]利用重组ASFV p54蛋白为抗原建立了葡萄球菌蛋白A (staphylococcal protein A,SPA)捕获胶体金标记的p54抗原抗体复合物为检测系统的胶体金免疫层析试纸条，检测结果表明该方法的敏感性为200 ng，对ASFV抗体阳性血清具有高度特异性。2016年，Sastre等[57]利用ASFV VP72蛋白的单克隆抗体包被试纸条，建立了能区分检测ASFV与CSFV抗体的免疫层析试纸条。该试纸条LOD为3 ng，但这种方法灵敏度较差，且难以准确定量。2020年，孙燕燕等[58]利用原核蛋白表达系统表达了ASFV的p30蛋白，将其用金纳米颗粒标记后包被在硝酸纤维素膜上，检测ASFV感染猪的血清，与进口ELISA试剂盒相比，敏感性和特异性分别为92.52%和92%，从而改进了上述技术。此外，在此基础上发展而来的荧光微球标记的试纸条，既保留了传统胶体金试纸条的现场快速检测的优点，又发挥了荧光显色的高度敏感性，因此成为当前即时诊断技术的热门研究方向之一[59]。

3 展 望

自2018年底ASF席卷中国以来，中国科研人员探索研发了各类针对ASF的诊断技术，许多精确而快速的诊断盒研发成功并投入使用，在ASF的诊断与早期控制过程中发挥了重要作用。层出不穷的ASF诊断技术其核心主要围绕着病原学诊断与血清学诊断展开，每种诊断技术都有其优缺点。如ddPCR和RAP/RAA具有高灵敏度和特异性，但受昂贵的试验设备限制，ELISA、胶体金试纸条灵敏度和特异性较差，却能节约检测成本。此外，目前发现唾液采集样本检测ASF具有较好的临床诊断优势，省时省力，还可减少对猪的应激，因此，适用于大规模监测唾液中病毒和抗体的技术值得期待。

然而，由于ASFV具有潜伏感染的特性，该阶段病毒处于复制沉默或静止，基因组拷贝数极低，仅编码潜伏相关转录本(latency associated transcript,LAT)或microRNA，不诱导免疫反应，致使目前检测ASFV DNA及其诱导的抗体的各种方法均无法甄别潜伏感染的动物[60]，因此快速筛查出处于潜伏期或感染早期传染源的新型检测技术将是未来ASF防控体系的重要需求。随着生物学技术的日益发展，用于特定捕获富集流行病和人畜共患病毒的生物素化 RNA 诱饵技术(VirBaits)正成为下一代检测技术的代表。这种技术已在严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)、ASFV、埃博拉病毒、马尔堡病毒、尼帕病毒、裂谷热病毒的诊断过程中体现出无可比拟的优势，证实了其为快速、低成本、高灵敏度与高特异性的诊断方法，有望成为ASF诊断技术主要研究方向[61]，为从根本上解决ASFV潜伏或早期感染提供新的诊断技术手段。