200 g/L氯虫苯甲酰胺悬浮剂对斑马鱼的急性毒性试验

丁洁　刘建梅

摘要 氯虫苯甲酰胺是全球销售量最高的广谱杀虫剂，可与多种杀虫剂进行复配。为研究200 g/L氯虫苯甲酰胺悬浮剂对斑马鱼急性毒性而设计并开展此试验。结果表明：建立的HPLC法适用于暴露水样中氯虫苯甲酰胺的定量分析，在有效的静态试验条件下，200 g/L氯虫苯甲酰胺悬浮剂对斑马鱼的96 h-LC50：72.15 mg a.i. /L，95%置信限：64.61～ 80.55 mg a.i. /L（HPLC实测浓度）。200 g/L氯虫苯甲酰胺悬浮剂对斑马鱼的毒性等级为“低毒”。

关键词 氯虫苯甲酰胺;斑马鱼急性毒性;高效液相色谱;分析

中图分类号：X171.5 文献标识码：B 文章编号：2095–3305（2022）02–0043–03

1 试验目的

氯虫苯甲酰胺是由杜邦公司研发出的第一个具有新型邻酰胺基苯甲酰胺类化学结构的广谱杀虫剂，于2007年在菲律宾率先登记，商品名为“Prevathon”，用于防治甘蓝、茄子和水稻咀嚼式口器害虫。目前，氯虫苯甲酰胺现已在世界上100多个国家销售，几乎覆盖了所有主要市场，如美国、英国、加拿大、澳大利亚等。

2008年在中国登记，商品名为“康宽”，销售额稳居杀虫剂前列。截至2020年10月26日，我国氯虫苯甲酰胺农药的有效登记个数为34个，登记作物22种，原药登记厂家4家，分别为：美国富美实公司的95.3%原药、山东潍坊润丰化工股份有限公司的98%原药、连云港立本作物科技有限公司的95.3%原药、上海杜邦农化有限公司的95.3%原药。氯虫苯甲酰胺高效广谱且低毒，其化合物专利大多已于2021年3月到期，相信在专利到期后，将会迎来一股登记热潮。

作为农药登记的关键测试项目，按照GB/T 31270.12—2014《化学农药环境安全评价试验准则》第12部分：鱼类急性毒性试验的规定，对200 g/L氯虫苯甲酰胺悬浮剂进行了斑马鱼急性毒性试验。试验选用斑马鱼（Danio rerio）作为供试生物，采用静态法通过将供试物溶解在水中的方式对斑马鱼进行染毒。本试验的目的是按照设定浓度，通过测定96 h的200 g/L氯虫苯甲酰胺悬浮剂暴露对斑马鱼的急性毒性效应，计算200 g/L氯虫苯甲酰胺悬浮剂对斑马鱼的LC50及95%置信限。

2 材料和方法

2.1 试验用水

经活性炭过滤和反渗系统纯化后曝气处理24 h以上的自来水。

2.2 仪器

相关仪器信息见表1。

2.3 测试物种

分类群：脊索动物门：辐鳍鱼纲;种类：斑马鱼（Danio rerio）;生活期：成年;全长：1～2 cm。

2.4 测试条件

温度：23.3 ºC～ 23.8 ºC（连续监控结果）;

溶解氧：61.3%～104.5%;

pH值：7.37～8.20;

硬度：123 mg/L（以CaCO3计）;

光周期：光暗比为12 h/12 h，光照强度范围594 ～ 863 lx;

承载量：0.1703 g鱼/L;

喂食：试验期间不喂食。

2.5 试验步骤

2.5.1 试验用鱼的驯养 正式试验前，试验用斑马鱼（批号：FB-20210521-002-02），在试验条件下驯养7 d，每天饲喂2次丰年虾，试验前24 h停止饲喂。驯养期间的死亡率为0%，符合试验准则中死亡率<5%的要求。试验前抽检10条斑马鱼测量全长、体重，计算得出正式试验时测试系统的承载量为0.170 3 g鱼/L水，平均全长为1.674 cm，满足承载量<1.0 g鱼/L水，全长1～2 cm的要求。

2.5.2 试验设计 基于预试验结果，200 g/L氯蟲苯甲酰胺悬浮剂对斑马鱼96 h LC50在50.0～100 mg a.i./L。因此，本试验进行正式试验。正式试验设置1个48.2 mg a.i./L、57.9 mg a.i./L、69.4 mg a.i./L、83.3 mg a.i./L和100 mg a.i./L 5个浓度组和1个空白对照组。浓度组和对照组均不设重复，每组7尾鱼。浓度组和对照组的测试容器均为4 L玻璃鱼缸，测试溶液为3 L。试验周期为96 h。

2.5.3 供试物溶液的配制 分别量取1.25 mL和5.00 mL 200 g/L氯虫苯甲酰胺悬浮剂用试验用水溶解并分别定容至250 mL和1 000 mL，在室温下（25℃）以500 r/min搅拌30 min，配制得到理论浓度为1 000 mg a. i. /L的贮备液。具体按表2方案进行配制。

2.5.4 暴露 以配制好的供试物试验溶液为浓度组，以试验用水为空白对照组，分别向每个浓度组和空白对照组随机投放7尾鱼，开始暴露。暴露之前测量浓度组和空白对照组溶液的温度、pH值、溶解氧和光照强度。试验周期为96 h。

2.6 观察

暴露开始后3 h、6 h、24 h、48 h、72 h和96 h观察鱼的死亡情况。用玻璃棒轻触鱼尾部，没有明显的活动（如鳃动），尾鳍没有反应则视为死亡。观察和记录后及时清理掉死鱼。同时对一些异常行为做记录。

试验开始前及每24 h测定试验溶液的溶解氧、pH值、温度和光照强度等参数。此外，试验过程中，随机选择一个试验容器对水温进行连续监测。

2.7 浓度分析

在正式试验开始时（0 h）、48 h与试验结束时（96 h）由采集水样50 mL前处理后进行上机测定供试物的实测浓度。采用HPLC法对试验用水（经活性炭过滤和反渗透系统纯化后曝气处理24 h以上的自来水作为试验用水）中氯虫苯甲酰胺的分析方法进行了验证，并对水样中氯虫苯甲酰胺的浓度进行了分析。分析条件如下：

高效液相色谱仪：HPLC 1260（Agilent）;

色谱工作站：Open Lab CDS 2.3;

移液器：Thermo;

色谱柱：Agilent Infinity Lab Poro-shell 120 EC- C18，4.6 mm×150 mm×4.0 μm;

流动相：A相为超纯水，C相为甲醇（表3）。

氯虫苯甲酰胺在0.100～50.0 mg/L之间成线性关系，回归方程为Y= 81.0549X – 10.1343（R2=0.99961）。

系统精密度（系统性能一致性）为分别对10.0 mg/L的氯虫苯甲酰胺标准溶液连续测定6次的结果的相对标准偏差（RSD）。氯虫苯甲酰胺的系统精密度为0.173%。

取试验用水、标准物质溶液、供试物溶液进行色谱分析。结果表明：在空白溶液中无主成分保留位置的色谱峰;在标准溶液和供试物溶液中的氯虫苯甲酰胺主成分的色谱峰的保留时间分别是4.935 min和5.037 min，保留时间的绝对差值小于0.3 min。所以方法的特异性可以接受。

在试验用水中的添加回收试验，设置5.00 mg a.i./L和160 mg a.i./L两个添加浓度，平均回收率分别为99.1%和101%，RSD分别为2.56%和1.13%;方法的精密度（重复性）为对5.00 mg a.i./L和160 mg a.i./L的添加回收溶液响应值的相对标准偏差，分别为2.61%和0.882%。

上述结果表明，氯虫苯甲酰胺在试验用水中的分析方法能满足检测要求，可用于测定试验用水中氯虫苯甲酰胺的浓度。

3 结果与结论

3.1 结果

3.1.1 理化性质 试验期间的光周期（光/暗）为12 h/12 h;在正式试验开始时测得试验用水的硬度为123 mg/L（以CaCO3计），在96 h暴露期间连续监测试验用水的温度为23.3℃～23.8℃、pH值为7.37～8.20、溶解氧为空气饱和值的61.3%～104.5%。

3.1.2 死亡率和异常行为 正式试验期间，空白对照组死亡率为0%，且斑马鱼无任何异常行为。57.9 mg a.i./L及以上浓度组出现游动时侧翻和正面或侧面平躺的中毒症状（表4）。

3.1.3 浓度分析 根据实测浓度分析结果，理论浓度为48.2、57.9、69.4、83.3和100 mg a.i. /L 的浓度组在0 h的实测浓度为47.8、58.3、71.2、83.4和104 mg a.i. /L，为理论浓度的99.2%、101%、103%、100%和104%;48 h的实测浓度为47.5、56.3、70.1、81.9、103 mg a.i. /L，为理论浓度的98.5%、97.2%、101%、98.3%和103%;96 h的实测浓度为45.6、55.0、70.5、81.0 mg a.i. /L，为理论浓度的94.6%、95.0%、102%和97.2%，证实供试物浓度始终不低于理论浓度的80%，96 h实测浓度变化率小于20%（表5）。

3.1.4 试验有效性 试验结果符合所有的有效性准则：驯养期间斑马鱼的死亡率为0%，符合试验准则中死亡率<5%的要求;试验结束时，空白对照组鱼的死亡数为0条，符合死亡数不能超过一条的要求;正式试验期间，浓度组和空白对照组溶解氧为空气饱和值的61.3%到104.5%，符合不得低于空气饱和值的60%的要求;正式试验时测试系统承载量为0.170 3 g鱼/L水，满足承载量<0.8 g鱼/L水的要求。参比物质重铬酸钾对斑马鱼24 h的LC50值为265.57 mg/L，在GB/T 31270.12—2014规定的有效准则范围200～400 mg/L内[4-5]。

3.2 结论

在有效的静态试验条件下，200 g/L氯虫苯甲酰胺悬浮剂对斑马鱼的96 h-LC50：72.15 mg a.i. /L（实测浓度），95%置信限：64.61-80.55 mg a.i. /L（实测浓度）。

按照GB/T 31270.12—2014《化学农药环境安全评价试验准则》 第12部分：鱼类急性毒性试验，农药对鱼类的毒性等级的划分，在本实验室条件下，200 g/L氯虫苯甲酰胺悬浮剂对斑马鱼的毒性等级为“低毒”。

参考文献

[1] 杨益军. 2014年中国及全球杀虫剂主流品种市场评析[J].农药市场信息， 2014（16）：17-20，26.

[2] 贾伟，蒋红云，张兰，等. 4种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂不同剂型对斑马鱼急性毒性效应[J]. 生态毒理学报，2016，11（6）： 242-251.

[3] 宋玥颐.氯虫苯甲酰胺和氟苯虫酰胺在斑马鱼体内的富集和毒性效应研究[D].扬州：扬州大学，2020.

[4] GB/T 27861—2011， 化学品 鱼类急性毒性试验[S]. 北京： 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会，2011.

[5] OECD. Environmental Health and Safety Publications， Series on Testing and Assessment[C]//No. 23. Guidance document on aquatic toxicity testing of difficult substances and mixtures. Paris：

責任编辑：黄艳飞

Acute Toxicity Test of 200 g/L Chloride Worm Benzamide Suspension Agent Against Zebrafish

DING Jie et al（Jiangsu CICA KunTesting Technology Co.， Ltd.， Jiangsu， Nanjing 210000）

Abstract Chlorbenzoamide is the highest selling wide-spectrum insecticide worldwide and can be reissued with multiple pesticides.This test was designed and conducted for studying the acute toxicity of a 200 g/liter chloride worm benzamide suspension in zebrafish.The results show that the established HPLC method is suitable for the quantitative analysis of chlorozobenzamide in exposed water samples， with 96 h-LC50：72.15 mg a.i. / L in zebrafish at 200 g / liter： 64.61 to 80.55 m g a. i. / L （measured HPLC concentration）.The 200 g / liter benzoamide suspension had a "low toxic" toxicity grade to zebrafish.

Key words Chloride worm benzoamide; Zebrafish acute toxicity; HPLC; Analysis

作者简介 丁洁（1989—），女，江苏南京人，中级工程师，硕士，主要研究方向：化学品和农药的生态毒理学测试。

收稿日期 2021-12-20