宋亚军 韦婧 向翠晓 吉忻 伍冠一
【摘 要】 目的:研究桉蛇止痒液的止痒效果。方法:采用动物行为学研究方法研究不同配比桉蛇止痒液对化合物48/80引起的急性瘙痒的止痒作用。结果:配比为2∶8、3∶7、4∶6的桉蛇止痒液作用于小鼠0min后对急性瘙痒小鼠的抑制率分别为52.53%、51.09%、61.95%,作用于小鼠15min后对急性瘙痒小鼠的抑制率分别为43.50%、55.24%、48.97%,作用于小鼠30 min后对急性瘙痒小鼠的抑制率分别为38.99%、42.22%、46.22%。桉蛇止痒液不影响小鼠的强迫运动能力。结论:三种配比桉蛇止痒液均对被化合物48/80诱导的急性瘙痒具有抑制作用,配比为4∶6的桉蛇止痒液具有快速止痒作用。
【关键词】 桉叶油;蛇床子素;止痒
【中图分类号】 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517(2022)16-0024-06
Inhibitory Effect of AnShe Antipruritic Liquid on Compound 48/80 Induced Scratching
SONG Yajun1 WEI Jing1 XIANG Cuixiao1 JI Xin1 WU Guanyi2*
1.College of Pharmacology, Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530299, China;2.College of Basic Medicine, Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530299, China
Abstract:Objective To study the antipruritic effect of AnShe antipruritic liquid.Methods Animal behavior was used to study the antipruritic effect of different proportions of AnShe antipruritic liquid on acute itching caused by compound 48/80.Results The proportions of AnShe antipruritic liquid was 2∶8,3∶7 and 4∶6.The inhibition rates of them on acute itching mice were 52.53%,51.09% and 61.95% pretreated for 0 min, 43.50%, 55.24% and 48.97% pretreated for 15 min,38.99%,42.22% and 46.22% pretreated for 30 min, respectively.An She antipruritic liquid did not affect the forced motor ability of mice.Conclusion different proportions proportions of AnShe antipruritic liquid have an inhibition effect on acute itching induced by 48/80. The proportions of 4∶6 AnShe antipruritic liquid has a rapid antipruritic effect.
Key words:Eucalyptus Oil;Osthole;Antipruritic
瘙癢是一种不愉悦且难以忍受的皮肤感觉,通常会引起强烈的搔抓欲望[1],是皮肤科疾病的常见症状[2],根据其持续时间不同可分为慢性和急性两种[3]。瘙痒虽不直接威胁患者的生命,却给患者的生活带来了巨大困扰。引起瘙痒的原因有内因如内分泌疾病、神经性疾病等,和外因如气候、蚊虫叮咬等[4]。对于急性瘙痒,通常采用外用的止痒药物,如抗组胺药、激素类、局麻药等[5],然而目前开放治疗急性瘙痒的中药研究相对较少。
桉叶油是从桃金娘科植物蓝桉中提取的具有芳香味的挥发性精油[6],化学式为C10H18O,其主要化学成分是萜类化合物及其含氧衍生物,具有抗菌、抗炎、促渗、驱蚊止痒等多种功效[7]。有研究[8]发现桉树脑可抑制NF-κB的活化,进而抑制多种炎症性皮肤病的发生。此外,孙国庆等[9-11]还发现桉叶素是其主要成分,含量可高达 99.5%,具有很好的透皮促渗作用,与药物联用可以提高药物吸收率和疗效,而且谢遥[6]的动物皮肤毒理实验显示40%桉叶油无刺激性、急性毒性、过敏性,安全性高。
蛇床子素(Osthole),又名甲氧基欧芹酚,是天然香豆素类化合物[12],分子式为C15H16O3,不仅来源于蛇床子成熟果实,在陈皮、前胡、当归等药用植物中也可提取[13]。有研究表明,蛇床子素药理活性众多,表现在抗炎[14]、抗过敏[15]、杀虫[16]、抗菌止痒[17]等方面。胡雪勤[18]研究发现蛇床子素对特应性皮炎的瘙痒症状有缓解作用且可以保护皮肤屏障,是一种安全有效的药物。但由于蛇床子素是一种脂溶性化合物,水溶性差,不易经皮吸收[19],而桉叶油的透皮促渗作用恰能弥补蛇床子素的这一不足,研究者选择乙醇为溶剂,将桉叶油与蛇床子素混合组成桉蛇止痒液,并观察其作用。
1 实验材料
1.1 实验动物 120只雄性SPF级ICR小鼠,6周龄,体重(35±10)g,购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司,动物合格证号:SCXK(湘)2019-0004,饲养于广西中医药大学SPF级动物实验中心,饲养室温为22℃左右,光照时间8∶00~18∶00,自由饮水进食。
1.2 实验试剂 桉叶油购自上海源叶生物科技有限公司;蛇床子素、薄荷醇购自阿拉丁试剂(上海)科技有限公司;化合物 48 /80购自上海sigma公司。
1.3 实验仪器 摄像机购自上海索尼电子有限公司,型號:HDR-CX405;电子分析天平购自赛多利斯科学仪器(北京)有限公司,型号:SQP;小鼠转棒式疲劳仪购自上海软隆科技发展有限公司,型号:BW-ZH600;亚力克透明盒子。
2 实验方法
2.1 桉蛇止痒液的配制 根据前期研究,配比为20∶1的桉叶油和蛇床子素的止痒效果最佳,故选择该比例的桉叶油、蛇床子素混合液作为主药,再加入80%乙醇配制成2∶8、3∶7、4∶6的桉蛇止痒液,最后再加入止痒液总质量2%的薄荷醇即得。
2.2 Rotarod实验 提前3 d剃掉20只小鼠后颈部1~2 cm2的毛并进行标记,然后每天同一时间段将小鼠置于六通道转棒式疲劳仪上训练,转速为21 r/min,每天进行2次,每次5 min,每次训练结束后休息5 min继续训练,持续3 d,目的是让小鼠学会在转棒式疲劳仪上跑动。正式实验时,随机将训练后的老鼠分为空白组和实验组,分别给空白组和实验组背颈部滴加50 μL生理盐水和50 μL配比为4∶6的桉蛇止痒液,15 min后,将小鼠置于转棒式疲劳仪上测试5 min,记录小鼠的在棒时间。
2.3 急性瘙痒模型的建立 以ICR雄性小鼠作为实验对象,通过背颈部皮下注射50 μg/50 μL化合物48/80建立皮肤瘙痒模型[20]。
2.4 瘙痒行为实验 实验前1 d剃掉小鼠颈部中央1~2 cm2的毛,实验前随机将实验小鼠分为空白组与实验组并将小鼠放在完全相同的亚克力盒子中适应30 min,之后将桉蛇止痒液滴于实验组小鼠颈部中央剃毛处,空白组小鼠滴等量生理盐水,作用相应时间(0 min 、15 min 、30 min)后,在空白组和实验组小鼠颈部剃毛处皮下注射50 μL的化合物48/80(50 μg/50 μL),在整个实验过程中采用高清摄像机对小鼠的瘙痒行为进行记录,然后采用双盲法观察并统计小鼠的瘙痒行为即每5 min内的搔抓次数。
2.5 数据统计 采用GraphPad prism 8统计软件进行统计分析,所有的结果均用(平均值±标准误)表示,各组数据用配对t检验的方法检验差异性,P<0.05表明有统计学意义,并计算不同配比桉蛇止痒液对化合物48/80诱导急性瘙痒的抑制率。
3 实验结果
3.1 桉蛇止痒液对化合物48/80 诱导急性瘙痒的直接作用 给予桉蛇止痒液后立刻给予化合物48/80,发现不同配比的桉蛇止痒液能够抑制化合物48/80引起的瘙痒。与对照组(257.00±45.74)比较,2∶8的桉蛇止痒液作用后瘙痒次数降低到(122.00±19.17)次(*P<0.05, N=8)(如图1 A、B所示)。此外,3∶7的桉蛇止痒液(225.10±29.46 VS 110.10±17.07, **P<0.05, N=8)(如图1 C、D所示)以及 4∶6的桉蛇止痒液(245.10±16.90 VS 93.25±23.49, **P<0.05, N=8)(如图1 E、F所示)都能抑制化合物48/80引起瘙痒。三种配比的桉蛇止痒液都能抑制抓挠次数峰值的出现或者延后抓挠次数峰值出现的时间(图1 B、D、F)。三种配比的桉蛇止痒液给予小鼠后对于急性瘙痒的小鼠在短时间内均能发挥很强、很快的止痒效果。配比为2∶8、3∶7、4∶6的桉蛇止痒液作用对急性瘙痒小鼠的抑制率分别为52.53%、51.09%、61.95%(如图1 G所示)。
3.2 给予桉蛇止痒液15 min对化合物48/80 诱导急性瘙痒的作用
3.2.1 桉蛇止痒液作用于小鼠15 min不能直接引起瘙痒行为 配比为2∶8的桉蛇止痒液作用于小鼠15 min的搔抓次数为(18.50±5.51)次,与对照组没有差异(11.38±3.57)(P>0.05,N=8)(如图2 A所示)。配比为3∶7(8.63±2.86 VS 6.88±3.40,P>0.05,N=8)(如图2 C所示)。4∶6(11.25±2.96 VS 6.75±3.06,P>0.05,N=8)的桉蛇止痒液作用于小鼠15 min的搔抓次数与对照组也没有显著性差异。说明止痒液作用15 min对小鼠没有明显的刺激性。
3.2.2 三种配比的桉蛇止痒液作用于小鼠15 min后对化合物48/80 诱导的急性瘙痒有显著的抑制作用 给予小鼠桉蛇止痒液15 min后给予化合物48/80,发现不同配比的桉蛇止痒液均能显著地抑制化合物48/80 诱导的急性瘙痒。与对照组(185.50±19.96)相比,2∶8的桉蛇止痒液作用于小鼠后瘙痒次数下降到(104.80±17.44)次(**P<0.05,N=8)(如图3 A、B所示)。此外,3∶7的桉蛇止痒液(215.90±24.78 VS 96.63±11.47,**P<0.05,N=8)(如图3 C、D所示)以及4∶6的桉蛇止痒液(228.30±34.85 VS 116.50±30.54,**P<0.05,N=8)(如图3 E、F)都可显著抑制化合物48/80诱导的急性瘙痒。三种配比的桉蛇止痒液均可抑制瘙痒次数峰值的出现或延后峰值出现的时间(如图B、D、F所示)。上述结果表明,三种配比的桉蛇止痒液作用于小鼠15 min后对于急性瘙痒的小鼠在30 min内均能发挥很快、较强的止痒效果,配比为2∶8、3∶7、4∶6的桉蛇止痒液对急性瘙痒小鼠的瘙痒抑制率分别为43.50%、55.24%、48.97%(如图3 G所示)。
3.3 给予桉蛇止痒液30 min对化合物48/80诱导急性瘙痒的作用
3.3.1 桉蛇止痒液作用于小鼠30 min不会引起明显的瘙痒行为 配比为2∶8的桉蛇止痒液作用于小鼠30 min内搔抓(20.50±7.17)次,与其对照组没有差异(16.50±3.76)(P>0.05,N=8)(如图4 A、B所示);配比为3∶7(20.13±3.89 VS 16.00±3.93,P>0.05,N=8)(如图4 C、D)的桉蛇止痒液作用于小鼠30 min搔抓次数与对照组也无显著性差异,说明配比为2∶8、3∶7的止痒液均对小鼠没有致痒性。配比为4∶6的桉蛇止痒液作用于小鼠30 min内搔抓(52.75±9.60)次,与其对照组有显著性差异(15.00±5.00, **P<0.05,N=8)(如图4 E所示),说明4∶6的止痒液对小鼠可能有一定的刺激性,但总体的搔抓次数还是处于较低水平(如图4 F所示)。
3.3.2 桉蛇止痒液作用于小鼠30 min后对化合物48/80诱导的急性瘙痒有抑制作用 给予桉蛇止痒液30 min后给予化合物48/80,与对照组(166.20±21.85)相比,2∶8的桉蛇止痒液作用于小鼠后瘙痒次数下降至(101.40±13.54)次(P>0.05,N=5)(如图5 A、B所示),虽无显著的差异,但是在一定程度上仍可抑制瘙痒。此外,3∶7的桉蛇止痒液(210.80±22.31 VS 121.80±16.22,*P<0.05,N=8)(如图5 C、D)以及 4∶6的桉蛇止痒液(219.40±24.37 VS 118.00±19.52, **P<0.05, N=8)(如图5 E、F所示)都能抑制化合物48/80引起瘙痒。三种配比的桉蛇止痒液都能抑制或者延后化合物48/80的瘙痒时间峰值(如图5 B、D、F所示)。由结果可知,三种配比的桉蛇止痒液作用于小鼠30 min后对于急性瘙痒的小鼠在30 min内均能发挥相对较弱,但见效快、持续时间久的止痒效果。配比为2∶8、3∶7、4∶6的桉蛇止痒液作用对急性瘙痒小鼠的抑制率分别为38.99%、42.22%、46.22%(如图5 G所示)。
3.3 桉蛇止癢液对小鼠的强迫运动能力无影响 rotarod实验表明,实验组和空白组小鼠基本都能稳定地随着疲劳转棒仪的转动而跑动,通过对实验数据统计分析,空白组的在棒时间为(300.00±0.01)s,实验组的在棒时间为(276.70±23.28)s,两组之间没有显著性差异(P>0.05)(如图6所示),由此可得结论:桉蛇止痒液对小鼠的强迫运动能力无影响。
4 讨论
桉叶油来源相当广泛,目前广泛用于医药、化妆品、食品加工、化学工业等领域,然而其作为药用治疗皮肤病的研究很少。蛇床子素常存在于伞形科和芸香科植物中,在部分的菊科和豆科中也有分布。近年来对其的研究也较多,尤其是其在医药和农药领域。蛇床子素的研究主要针对抗炎、抗菌、抗肿瘤等药理作用,但在止痒方面的研究相对较少。
研究者将二者联用,自拟桉蛇止痒液,研究其止痒效果,结果显示其对化合物48/80诱导的急性瘙痒有很好的抑制作用。从作用时间上看,三种配比的桉蛇止痒液对化合物48/80诱导急性瘙痒的小鼠能在给药后 5 min内发挥较强药效(瘙痒抑制率均大于50%)且均能至少持续15 min。给予15 min以及30 min后的小鼠所表现出的整体止痒效果较弱,由此推测桉蛇止痒液的整体效果与其作用时间呈负相关,这一系列变化趋势可能与80%乙醇有关,随时间的延长,止痒液挥发越多,作用效果就越弱。从桉蛇止痒液的不同配比来看,4∶6的桉蛇止痒液作用效果最好(作用0 min、15 min、30 min的平均瘙痒抑制率为52.38%),3∶7的桉蛇止痒液作用效果次之(作用0 min、15 min、30 min的平均瘙痒抑制率为49.52%),2∶8的桉蛇止痒液作用效果最差(作用0 min、15 min、30 min的平均瘙痒抑制率为45.01%),这一变化可能与止痒液中桉叶油与蛇床子素的含量有关,桉叶油与蛇床子素含量越高,止痒液的止痒效果越好。
有研究发现,桉叶油主要成分1,8-桉叶素、蛇床子素能够作用于TRP通道以及其他抑制瘙痒物质的释放,这些作用可能参与桉蛇止痒液止痒机制。比如,陈凡等[21]研究表明桉叶油中的活性成分1,8-桉叶素能明显抑制组胺的产生、降低IL-31的量、降低体内PAF的含量从而抑制5-HT和组胺的释放,进而发挥止痒作用;Takaishi[22]认为1,8-桉叶素是TRPM8通道的激动剂,激活TRPM8通道可产生凉感觉,凉感觉可抑制痒觉;伍冠一等[23]发现蛇床子素能抑制肥大细胞释放致痒物质组胺;Yang等[24]的研究结果表明蛇床子素的止痒效果与抑制组胺依赖通路H1受体、H4受体下游的离子通道TRPV1有关。同时,Yang等[25]也发现蛇床子素能够微弱激活TRPV1通道并使之脱敏,抑制组胺依赖瘙痒。综上,桉蛇止痒液的止痒机制可能与抑制致痒物质组胺以及IL-31的释放,降低体内PAF含量和抑制TRPV1和激活TRPM8通道有关。这一研究成果将为桉蛇止痒液止痒机制的进一步研究和相关新药的开发提供参考。
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(收稿日期:2021-12-29 編辑:陶希睿)
基金项目:国家自然科学基金项目(81860740,82060768);广西自然科学基金项目(2020GXNSFAA297244);广西大学生创新创业计划训练项目(202010600035)。
作者简介:宋亚军(1998-),男,苗族,本科生在读,研究方向为中药止痒机制研究。E-mail:1713055327@qq.com
通信作者:伍冠一(1980-),男,汉族,博士,副教授,研究方向为中药止痒机制研究。E-mail:w5gy1@126.com