具有临床降血压功效的乳源三肽的研究进展

周会钦，肖军霞，荣庆军，谭海刚，孙 杰，黄国清,*

（1.青岛农业大学食品科学与工程学院，山东 青岛 266109；2.青岛波尼亚食品有限公司，山东 青岛 266109；3.山东省花生研究所，山东 青岛 266109）

高血压是人类常见的慢性疾病，是以体循环动脉血压增高为主要特征，可伴有心、脑、肾等脏器功能或器质性损伤的综合征。高血压也是心血管疾病、肾衰竭和中风的主要危险因素，常与其他代谢性疾病如肥胖、糖尿病和动脉粥样硬化等同时发生。近年来，随着人们生活水平的不断提高以及饮食结构和生活习惯的改变，我国的高血压发病率有所升高，且呈现低龄化趋势。因此，对高血压预防与治疗方法进行研究对于提高人们的健康水平、减轻患者的经济负担具有重要意义[1]。

药物是治疗高血压的主要方法，目前常用的高血压治疗药物及方法包括β受体阻滞剂、利尿剂、钙离子拮抗剂、血管紧张素转换酶（angiotensin-converting enzyme，ACE）抑制剂、肾素抑制剂、血管紧张素II受体阻滞剂、多巴胺I型受体激动剂及基因治疗等[2]，其中ACE抑制剂类药物能够阻止血管紧张素I转换为血管紧张素II，且对激肽酶活性有抑制作用，因此在临床中被广泛用于高血压的治疗。当前市场上销售的ACE抑制剂类药物如卡托普利、依那普利和赖诺普利都是人工合成类药物，虽然它们具有较好的降血压效果，但是会引起如咳嗽、味觉丧失和肾功能损害等多种副作用[3-4]。因此，寻找这些化学合成药物的天然替代品对于高血压的治疗具有重要意义。

Ferreira等于1970年首次从腹蛇（Bothrops jararca）的毒液中提取得到了具有ACE抑制作用的活性多肽[5]，从此，降血压肽（ACE inhibitory peptides，ACEIPs）开始引起了全球学者的广泛关注。大量研究表明，来源于动物、植物、微生物和昆虫的天然ACEIPs具有很好的ACE抑制活性，且对人体无毒副作用，因此在高血压的预防与治疗中具有广阔的应用前景[6]。目前已有大量文献对ACEIPs的来源[7-12]、结构与功能之间的关系[13]、生物利用度[14]、作用模式[15]、在功能食品开发中的应用[16]等进行了综述。现有的关于ACEIPs的研究多基于其体外ACE抑制活性或在原发性高血压大鼠（spontaneous hypertensive rats，SHR）的体内降血压活性，然而，目前尚未建立起这些体外或体内活性与在人体内实际降血压功效之间的关系[17]。因此，虽然已有大量ACEIPs被分离和鉴定出来，但是经过临床研究证实对人体具有体内降血压功效且已在降血压功能食品开发中获得实际应用的仅有极少数几种[16]，其中最受关注的是Ile-Pro-Pro（IPP）、Val-Pro-Pro（VPP）和Leu-Pro-Pro（LPP）3种三肽。

目前这3种三肽主要来源于牛奶中的酪蛋白，其中IPP位于β-酪蛋白的74～76位和κ-酪蛋白的84～86位，VPP位于β-酪蛋白的108～110位，LPP位于β-酪蛋白的151～153位[18]，因此这3种三肽又合称为乳源三肽（以下简称乳三肽）。大量临床研究及Meta分析表明，乳三肽可以有效降低高血压患者的血压[19-22]，对正常血压没有影响[23]，且可增加中老年人群的脑血流速度[24]，是非常理想的降血压活性组件，可作为合成ACE抑制剂类药物的补充或替代品。目前国外已有多种基于乳三肽的降血压功能食品上市，而国内尚未发现相关产品。因此，本文就乳三肽的功效、安全性、制备方法和新来源等进行综述，旨在为推动我国第三代降血压功能食品的开发提供参考。

1 乳三肽的体外ACE抑制活性

大量研究表明，ACEIPs对ACE的抑制作用与其N端和C端的氨基酸残基种类密切相关。当N端为疏水氨基酸，尤其是具有脂肪链的氨基酸（如Gly、Ille、Val和Leu时），C端为具有环状结构的氨基酸（如Pro、Tyr和Trp时），ACEIPs的ACE抑制活性最强[25]。IPP、VPP和LPP的N端和C端氨基酸残基种类均很好地满足上述构效关系，这三者的半抑制浓度（50% inhibiting concentration，IC50）分别为5.0、9.0 μmol/L和9.6 μmol/L，虽然远远高于常见的ACE抑制剂类药物卡托普利的IC50（0.02 μmol/L）[26]，但是低于大部分已报道的ACEIPs[27]，因此具有很强的体外ACE抑制活性。一项体外研究证实，乳三肽可选择性地抑制ACE1的活性，但对ACE2和胃促胰酶的活性无显著影响[28]，这为乳三肽的实际应用提供了理论依据。

2 乳三肽的消化吸收

ACEIPs只有进入血液循环才能发挥降血压功效。由于人体的胃肠道和血液中存在大量的蛋白酶和肽酶，很多ACEIPs在消化吸收过程中极易被水解而失去原先的结构和活性；另外，部分ACEIPs由于分子质量过大而无法直接被人体吸收。因此，ACEIPs能否以完整的结构被人体吸收是其能否发挥体内降血压功效的关键[16]。研究发现，由于脯氨酸独特的环状结构会影响其与蛋白酶活性部分的结合，使得绝大部分蛋白酶都难以裂解Xaa-Pro或Pro-Pro肽键，因此在C末端存在一个或多个Pro残基会使多肽耐受胃肠道蛋白酶的分解，并有利于多肽在后续的体内运输过程中保持结构完整，从而使其进入血液循环并发挥体内降血压作用[29-31]。乳三肽的C端均含有两个Pro残基，这为其抵御蛋白酶和肽酶的降解提供了结构基础。

体外实验证实，IPP和VPP对胃肠道消化酶具有很强的抗性[32]，且两者均能以完整结构通过Caco-2单层细胞[33]。以猪为实验对象，对IPP、LPP和VPP的药代动力学进行研究，发现它们均可以被完整地吸收进入血液循环，且当以静脉注射的方式给药时，IPP、LPP和VPP的消除半衰期分别为（2.5f0.1）、（1.9f0.1）min和（2.0f0.1）min；当以口服方式给药时，这3种三肽的半衰期则无显著差异，分别为（9f1）、（15f4）min和（12f6）min[34]。人体实验也充分证实了这一结论，当受试人群摄入含有IPP和LPP的饮料后，这两种三肽均能够被完整地吸收进入血液循环，且与膳食同时摄入有利于提高这两种三肽在血液中的含量[35]。

3 乳三肽的临床降血压效果

根据国际高血压协会于2020年颁布的《全球高血压实践指南》，可将人体的血压分为如下几个等级，其中，正常人的血压收缩压为90～140 mm汞柱，舒张压为60～90 mm汞柱；轻度高血压患者收缩压为140～159 mm汞柱，舒张压为90～99 mm汞柱；中度高血压患者收缩压为160～179 mm汞柱，舒张压为100～109 mm汞柱；重度高血压患者收缩压大于等于180 mm汞柱，舒张压大于等于110 mm汞柱。目前已有大量Meta分析和综述对乳三肽，尤其是IPP和VPP，在双盲安慰剂对照试验中对高血压患者的血压干预作用进行了总结[36-37]。结果表明，持续4～8周每日摄入2～10 mg含有IPP和VPP的饮品可以显著降低受试者的血管收缩压和舒张压[21,38-40]。

Hata等在一项安慰剂对照研究中发现，让30多名40～86 岁的高龄高血压患者连续8周每天摄入95 mL含有IPP和VPP的可尔必思酸奶（日本东京可尔必思食品工业有限公司）后，患者的收缩压下降了（14.1f3.1）mm汞柱（P＜0.01），舒张压下降了（6.9f2.2）mm汞柱（P＜0.01），而安慰剂对照组的血压没有显著变化[41]。Aihara等让40 名正常高值血压受试者和40 名轻度高血压患者连续4周每天摄入6 片含IPP和VPP的瑞士乳杆菌CM4（Lactobacillus helveticusCM4）发酵酸奶片，发现两个实验组受试对象的收缩压和舒张压与安慰剂组相比均显著下降，其中正常高值血压组与安慰剂组相比舒张压显著下降了5.0 mm汞柱，而轻度高血压患者组的收缩压下降了11.2 mm汞柱[42]。Turpeinen等进行了一项为期10周的双盲安慰剂对照干预实验，62 名轻度高血压受试者每天摄入含有4.2 mg IPP和VPP的涂抹酱后，收缩压显著下降了5.0 mm汞柱[43]；随后Turpeinen等又对104 名年龄在35～60 岁之间的欧洲高血压高胆固醇患者进行干预试验，同样摄入含有4.2 mg IPP和VPP的涂抹酱，发现试验组的收缩压与安慰剂组相比显著下降了3.6 mm汞柱（P＝0.007）[39]。Nakamura等就乳三肽对日本高血压患者的降血压效果进行了研究，70 名年龄50～69 岁的高血压患者每天摄入含有3.4 mg VPP和IPP的药片，持续8周后实验组的收缩压下降了（11.0f11.0）mm汞柱，而安慰剂组下降了（4.5f9.6）mm汞柱[44]。Kajimoto等设计了一项针对轻度高血压患者的双盲安慰剂对照试验，64 名年龄在39～61 岁的受试者连续每天摄入含有IPP和VPP的酸奶饮料（每瓶150 g，每天2 瓶），8周后发现实验组受试者的收缩压和舒张压与安慰剂组相比分别高度显著下降了（13.9f11.4）mm汞柱（P＜0.001）和（9.1f7.5）mm汞柱（P＜0.001）[36]。Chanson-Rolle等以日本人群为受试对象，发现每天摄入一定量的IPP和VPP有效降低了受试者的血管收缩压（－5.63 mm汞柱，P＜0.000 1），且这两种三肽对高血压患者的降压效果要显著好于对非高血压患者[45]。Hirota等让25 位患有轻度高血压的男性受试者每天摄入含有VPP和IPP的酪蛋白水解物，1周后测量左上臂的反应性充血情况，发现含有VPP和IPP的酪蛋白水解物可以显著改善轻度高血压患者的血管内皮功能障碍[38]。

由上述研究可知，乳三肽，尤其是IPP和VPP具有明确的体内降血压功效。这些临床研究结果为基于乳三肽开发具有明确功效的第三代降血压功能食品奠定了坚实的基础。表1对部分关于乳三肽临床降血压功效的研究进行了总结。

表1 乳三肽的临床降血压效果总结Table 1 A summary of the clinical antihypertensive effect of lactotripeptidess

4 乳三肽的其他功能

除了降血压作用外，乳三肽还被发现具有其他多种生理功能。

4.1 改善血管内皮功能障碍

VPP和IPP可以抑制血管平滑肌细胞的增殖、降低由血管紧张素酶II诱导的细胞促炎介质（cyclooxygenase-2，COX-2）和超氧化物的含量，且VPP比IPP的效果更为显著[46]；Song Tianyuan等也发现了这两种三肽活性的差异，且认为这种差异主要是两者N端氨基酸残基种类的不同所致[47]。Hirota等发现，在离体条件下，去除主动脉的内皮细胞后，VPP和IPP干预均未引起血管舒张，表明这两种三肽是通过影响内皮细胞来引起血管舒张[48]。Jäkälä等以SHR为实验对象，也发现VPP和IPP可以改善血管内皮功能障碍，有利于肠系膜动脉内皮依赖性舒张[49-50]。体内研究也证实了上述发现，Hirota等让轻度高血压患者连续1周摄入含有VPP和IPP的酪蛋白水解物后，发现受试者的血管内皮功能障碍得到了显著改善[38]。

4.2 促进血管扩张因子释放

一氧化氮（nitrogen oxide，NO）是一种有效的内源性血管舒张物质，在保护心血管健康中发挥着重要作用[51-52]。研究发现，IPP和VPP也可以诱导NO的产生，从而改善I期高血压患者的血管内皮功能[38,47,53]。

Nonaka等将IPP和VPP与N-硝基-L-精氨酸甲酯盐酸盐混合后添加到正常大鼠的饮用水中，发现与未添加这两种三肽的对照组相比，实验组大鼠血浆中亚硝酸盐和硝酸盐（NOx）的水平显著增加，这对于缓解实验大鼠的动脉功能障碍、血管僵硬和靶器官损伤具有积极影响[53]。还有报道证实IPP、VPP可以通过诱导产生NO以修复血管内皮细胞损伤[48,54]以及诱导离体主动脉细胞产生NO，进而引起主动脉血管舒张[48]。有学者通过DNA芯片技术分析了IPP和VPP对SHR体内降压效果的机理，发现这两种多肽可以显著增加内皮型一氧化氮合酶基因的表达[55]。

4.3 类胰岛素功能

高血压和糖尿病这两种代谢综合征具有共同的病理，都能引起损伤血管，且长时间患糖尿病易诱发心脑血管疾病，因此，IPP和VPP的摄入与胰岛素水平的关系也引起了部分学者的关注[56-58]。最近研究发现，IPP和VPP可以通过增强胰岛素信号的传导和抑制炎症对胰岛素的干扰从而调节胰岛素水平，进而对高血压的控制产生有利的影响[59-60]。Chakrabarti等以小鼠前脂肪细胞（3T3-F442A）为研究对象，发现IPP和VPP可以诱导脂肪发生分化、上调转录因子表达和脂联素的释放，还能够抑制细胞因子介导的炎症[61]，且增加了3T3-F442A细胞对胰岛素的敏感性[62]。

4.4 降低交感神经活动

高血压对交感神经也会产生一定的影响。Miyazaki等以SHR为研究对象，发现摄入IPP和VPP后实验大鼠的皮肤动脉交感神经活动和平均动脉压均显著降低[63]；Usinger等在人体中也观察到了类似的现象，受试者连续8周每天摄入由瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus）发酵的含IPP和VPP的酸奶后，其交感神经活动显著减弱[64]。

5 乳三肽的安全性

由于IPP、VPP和LPP主要存在于水解物中，因此目前对这3种三肽的安全性研究主要以相应的水解物为对象。Tensguard™是由荷兰DSM公司开发的一种富含IPP的乳蛋白水解物，具有显著的降血压功效。Ponstein-Simarro Doorten等对该水解物进行了细菌反向突变试验、哺乳动物细胞基因突变试验、哺乳动物染色体突变试验以及大鼠90 d重复剂量口服毒性研究，发现该水解产物不具有致畸或致突变作用，口服毒性试验则表明在选择的最高测试剂量下（40 mg IPP/（kgmbgd））仍然是安全的[65]。Maeno等以仓鼠为对象进行染色体畸变实验，发现摄入IPP和VPP不会诱导细胞毒性或染色体异常[66]。Dent等则就IPP和VPP对大鼠进行了为期90 d的重复灌胃毒性研究，并以兔子为对象研究了这两种三肽对产前胚胎和胎儿发育的影响，发现在测试的最高剂量（33.6 mg IPP/（kgmbgd））下两种实验动物均未出现不良反应[67]。Mizuno等给24只大鼠连续91 d灌胃剂量分别为0、40、200、1 000 mg含有0.6% IPP和VPP的酪蛋白水解物，均未出现行为和临床体征上的异常，解剖后发现器官和组织病理学也未发生显著变化[68]。

IPP和VPP的有效降血压剂量可能由于人群、地域、年龄、饮食习惯以及高/轻度血压症状的不同而有差异，普遍认为IPP和VPP的有效低剂量小于10 mg/d[69]，一般认为在3.07 mg/d左右，但是当乳三肽的剂量高达52.5 mg/d时人体也不会出现任何不良反应[70]。

乳三肽对人体的安全性已被大量临床研究所证实。Hata等发现，30多名高血压患者在连续8周每天摄入95 mL含有IPP和VPP可尔必思酸奶后，脉搏率、体质量和血清生化指标均无明显变化[41]。Aihara等也观察到了同样的结果，受试者在连续4周摄入含有IPP和VPP的发酵酸奶片后，脉搏率、体质量和血清生化指标均无明显变化，也未出现其他不良反应[42]。Nakamura等发现，受试者摄入含有3.4 mg VPP和IPP的药片后均未出现咳嗽、疲劳、头痛和痛风等合成ACE抑制剂类药物常出现的不良反应[44]；Kajimoto等也发现受试者在每天摄入300 g含有IPP和VPP的酸奶饮料8周后，均未出现干咳、消化异常等不良反应，血清标记物和尿酸水平等指标也未出现明显变化[36]。Turpeinen等发现，来自欧洲的受试者摄入含IPP、VPP和植物固醇的涂抹酱后，其收缩压和血清总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇水平均显著降低，但是未出现其他不良反应[39]。

由上述动物实验和人体研究可知，在合理的剂量范围内，乳三肽具有良好的安全性。

6 基于乳三肽的降血压功能食品

目前国外市场上已有多种基于乳三肽的降血压功能食品上市，产品形式多为片剂、胶囊或发酵酸奶。TensguardTM是由荷兰DSM公司最新开发生产的一种乳蛋白水解物，该产品富含IPP，可用于维持心血管健康及保持血压在正常范围[65]。日本可尔必思食品工业公司生产的Calpis®酸奶由瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus）和啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）发酵牛奶制得，富含IPP、VPP和LPP，据称其“适用于轻度高血压者”，该产品在日本已经畅销20多年，是众多患有高血压人士每天必不可少的降压保健食品，并且可以和降压药物同时服用；该公司在Calpis®酸奶的基础上又开发了具有降血压功效的酪蛋白水解物AmealPeptide®，该产品以片剂的形式销售，每片含LPP和VPP共1.7 mg，建议服用量为每天2 片。芬兰瓦利奥（Valio）公司也推出了具有降血压功能的、由瑞士乳杆菌发酵的酸奶制品Evolus®，该产品于2000年上市，深受欧洲消费者欢迎，被称为“第一个有助于降低血压的欧洲功能性食品”[71]。

7 乳三肽的制备方法

乳三肽最早从瑞士乳杆菌和酿酒酵母共同发酵的酸奶中分离鉴定[72]。随着人们对乳三肽功能了解的深入，乳三肽的制备方法也日益丰富。目前已报道的乳三肽生产方式主要分为3种：胃肠液消化法、瑞士乳杆菌发酵法和酶解法。

7.1 胃肠液消化法

酪蛋白在体内的消化过程可分为两个阶段，首先经消化酶（胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶）进行“I期消化”，随后在肠上皮细胞通过刷状缘肽酶进行“II期消化”。肠上皮细胞刷状缘含有丰富的肽酶，可以将“I期消化”产生的多肽进一步水解成寡肽（二肽、三肽）甚至氨基酸。胃肠道消化系统能否直接水解酪蛋白释放乳三肽已经引起了学者们的广泛关注。体外研究表明，β-酪蛋白通过胃肠道消化后可释放出含有IPP和VPP序列的前体，但并不能直接释放出这两种三肽[32]；但在另外一些研究中则得到了相反的结论。Tagliazucchi等利用COST Action Infogest体外消化模型对骆驼奶中的κ-酪蛋白进行水解，成功在水解液中检测到了IPP的存在，且其质量浓度达到了（2.56f0.15）mg/L[73]；Rutella等利用该模型成功从脱脂牛奶中得到了VPP和IPP，且两者的质量浓度分别为（354.3f29.8）μg/L和（973.8f155.7）μg/L[74]；在牛、骆驼、绵羊和山羊奶的体外消化实验中得到了相似的结论[73,75-76]。一项临床试验证实了上述发现，受试者在摄入了不含游离IPP的乳清分离蛋白后，血浆中的IPP浓度显著增加，表明人体内的胃肠道消化系统可水解乳清分离蛋白并释放出IPP[77]。

7.2 瑞士乳杆菌发酵法

目前富含IPP、VPP和LPP的功能食品（包括酸奶、奶酪以及风味乳饮料）主要以酪蛋白为原料通过瑞士乳杆菌发酵制得[78]。瑞士乳杆菌具有很高的胞外胞内蛋白酶活性，因此被广泛用于发酵牛奶以生产富含IPP、VPP和/或LPP的水解产物。

7.2.1 瑞士乳杆菌的蛋白水解系统

瑞士乳杆菌在发酵过程中要需要在自身蛋白酶水解系统的作用下水解酪蛋白，以产生供自身生长繁殖所需的营养物质，IPP、VPP及LPP即在此过程中被释放出来[79-81]。在众多乳酸菌菌株中，瑞士乳杆菌具有最高的细胞包膜蛋白酶活性[81]。Edens等发现瑞士乳杆菌的细胞包膜蛋白酶属于丝氨酸蛋白酶，这类蛋白酶具有专一性和高效性，这也是瑞士乳杆菌具有极强蛋白质水解活性的重要原因[29]。酪蛋白经瑞士乳杆菌发酵水解生成生物活性肽主要由3 个系统起作用，即细胞包膜蛋白酶水解系统、细胞膜上的寡肽转运系统和胞内酶水解系统[80,82-83]。第一个系统将酪蛋白水解成由3～30 个氨基酸残基组成的寡肽，第二个系统将这些寡肽通过细胞膜上的肽转运系统转运到细胞内，第三个系统则在细胞内将寡肽通过胞内蛋白酶水解为含2～5 个氨基酸片段的小肽（包括IPP、VPP和LPP）甚至是氨基酸[83]。

7.2.2 瑞士乳杆菌的细胞包膜蛋白酶

不同瑞士乳杆菌菌株的细胞包膜蛋白酶活性存在差异。Wakai等发现瑞士乳杆菌CM4和瑞士乳杆菌DPC4571的细胞包膜蛋白酶活性不同，进而导致了两者在发酵酸奶时产生IPP和VPP的含量也不同[84]；进一步研究发现，从瑞士乳杆菌菌株CP790中分离纯化得到的细胞包膜蛋白酶水解α-和β-酪蛋白时无法得到IPP和VPP[85]，但是瑞士乳杆菌CP790和瑞士乳杆菌CM4的细胞外蛋白酶水解酪蛋白时产生了一个包含IPP和VPP序列的、由28 个氨基酸残基组成的多肽[85]。这表明欲从酪蛋白中水解得到IPP和VPP，除了细胞包膜蛋白酶外，还需要其他蛋白酶的参与。

7.2.3 瑞士乳杆菌的细胞内蛋白酶

在瑞士乳杆菌CM4菌株中检测到了可水解C-末端脯氨酸的肽酶，该酶是加工生成IPP和VPP的关键[86]。Griffiths[79]、Wakai[87]等发现欲从酪蛋白中获得IPP和VPP，还需要对肽的N-末端进行切割，且当N端氨基酸残基为脯氨酸时氨肽酶的水解会终止。X-脯氨酰二肽氨基肽酶（pepX）能够从多肽的N-末端切割两个氨基酸并释放具有Xaa-Pro序列的二肽[88-89]，但是当Xaa-Pro-Pro序列存在时，氨肽酶停止水解[79]。因此，水解酪蛋白产生VPP和LPP需要多种蛋白酶和肽酶的协同作用。已经在不同的瑞士乳杆菌菌株中发现了多种肽酶，包括氨肽酶（pepC1、pepC2、pepN、pepN2、pepA）、pepX、内肽酶（pepE、pepE2、pepF、pepO、pepO2、pepO3）、三肽酶（pepT、pepT2）、二肽酶（pepD1、pepD2、pepD3、pepV、pepDA）[82-83,87]等，这些酶在乳三肽的定向水解中发挥了重要作用，这也是瑞士乳杆菌被广泛用于乳三肽制备的重要原因之一。

瑞士乳杆菌的蛋白水解系统及水解过程如图1所示。

图1 瑞士乳杆菌蛋白水解系统的示意图[78,82]Fig. 1 Schematic diagram of protein hydrolysis system of Lactobacillus helveticus[78,82]

7.3 酶解法

由于瑞士乳杆菌蛋白水解能力强、蛋白酶种类丰富，尤其是富含多种脯氨酸特异性的肽酶，因此在乳三肽的制备中具有独特的优势。但是微生物发酵法存在明显缺点，首先，发酵使用的乳酸菌是活生物体，其分泌酶的类型和数量难以控制，生产过程的重现性较差；其次，发酵过程时间较长，易发生微生物污染；此外，发酵产品不宜直接掺入固体食品中[29]。

相比于发酵法，蛋白酶水解法生产工艺简单、产品质量易于控制、成本相对较低，因此是一种更加经济可行的乳三肽生产方法。酶解法制备乳三肽的关键在于寻找可以切割含有X-Pro-Pro序列的蛋白酶。Mizuno等使用9种市售的蛋白酶水解酪蛋白，发现来自米曲霉（Aspergillus oryzae）的蛋白酶Sumizyme FP的水解产物中存在大量Xaa-Pro-Pro和Xaa-Pro序列[90]；对Sumizyme FP进行进一步分离纯化，得到了一种内肽酶（neutral protease I，NP I）和一种氨肽酶（leucine aminopeptidase，LAP），其中前者具有羧肽酶活性，后者具有氨肽酶活性，两者单独作用不足以使酪蛋白水解释放出IPP，但是两者协同作用可以成功水解酪蛋白产生IPP，这表明NP I和LAP是水解酪蛋白产生IPP的关键酶[91]。米曲霉蛋白酶水解产生含IPP和VPP的酪蛋白水解产物经临床试验证实具有良好的降血压效果[92-93]。

8 关于乳三肽的专利

由于乳三肽具有明确的体内降血压功效，目前已有大量关于它们新型生产方法的专利，其中最常见的是微生物发酵法。专利US2006/0246178[94]中报道了一种利用瑞士乳杆菌CNRZ 244（Lactobacillus helveticusCNRZ 244）发酵生产包含VPP和/或IPP乳制品的方法，原料可以使用含有酪蛋白的任意奶源，包括牛乳、羊乳、骆驼乳、马乳、脱脂乳粉及重构乳；为了提高产品的适口性和风味，还可以在发酵过程中添加其他微生物例如酿酒酵母等。专利US6534304[95]筛选得到了一种具有高水解活性的瑞士乳杆菌CM4（Lactobacillus helveticusCM4）菌株，用其在37 ℃下对脱脂乳进行发酵，24 h后酸奶中的IPP和VPP质量浓度分别达到了23.5 μg/mL和38.5 μg/mL。专利US2011/0165135[96]使用3种新型的瑞士乳杆菌（CNCM I-3997、CNCM I-3998和CNCM I-3999）发酵牛奶，所得产品中IPP、VPP和LPP的质量浓度可以达到可尔必思产品（Ameal S™）的3 倍。专利US6890529[97]发现一种新的菌株瑞士乳杆菌LBK-16H（Lactobacillus helveticusLBK-16H）具有很高的蛋白质水解活性，将其在含9%牛奶的培养基中培养后，成功检测到了VPP和IPP，两者的质量浓度分别为6 mg/L和13 mg/L。

由于乳三肽富含Pro的特性，目前仅有少量专利利用酶解法来获得乳三肽，且其中很多并未明确所使用的蛋白酶种类。专利WO2006/084560A1[98]公布了一种生产含IPP和VPP及VB的多肽水解物的方法：首先利用蛋白酶水解全脂牛奶、脱脂牛奶、酸性乳清、干酪乳清、酪蛋白、凝乳酶酪蛋白、动物蛋白明胶、骨头、大豆、大米、玉米或小麦面筋等含有乳三肽序列的底物，然后对水解产物进行分离和浓缩，即可作为一种添加剂用于降血压功能食品的制备。欧洲专利EP1231279[99]公开了一种酶解酪蛋白酸盐制备含IPP和VPP水解物的方法，先用蛋白酶水解底物得到含有IPP和VPP序列的中间产物，然后再进一步酶解即得到IPP和VPP。专利US7879804[29]针对多酶复合水解耗时较长、工艺繁琐、容易污染等问题，提出了单一水解步骤制备IPP和VPP的方法，利用脯氨酸特异性内切蛋白酶（proline specific endoprotease，PSE）并结合氨基肽酶对酪蛋白酸盐在pH 4～6和40 ℃以上水解4 h后，IPP、LPP和VPP的含量分别达到了4.8、10.0 mg/g和5.0 mg/g。专利US8088597[100]则公开了一种利用PSE和氨肽酶结合水解糖巨肽生产低苦味、高IPP含量水解物的方法。

微生物发酵法和酶解法相结合也已被用于乳三肽的生产。专利US2011/0045130[30]先利用瑞士乳杆菌菌株100H（Lactobacillus helveticus100H）发酵脱脂乳，然后在发酵过程中添加Corolase LAP Ch.: 4123和PSE，所得水解产物中IPP、LPP和VPP的含量分别高达52.3、76.5 mg/g和79.6 mg/g。专利WO2009/065862[101]发现利用瑞士乳杆菌发酵脱脂牛奶仅能释放出IPP和VPP，但是加入PSE和氨肽酶后，IPP、VPP、LPP均被释放出来，且三者的含量分别为0.29、1.13 mg/g和0.26 mg/g。专利US2011/0142989[102]公开了一种利用来自曲霉的蛋白酶Umamizyme水解酪蛋白制备VPP、IPP和LPP的方法，发现结合瑞士乳杆菌CNRZ 244发酵可显著提高水解产物中这3种三肽的含量。专利US2010/0151080[103]先使用木瓜蛋白酶F和菠萝蛋白酶F水解脱脂乳，然后再使用瑞士乳杆菌CM4进行发酵，得到了IPP和VPP含量较高的酸奶制品。

表2对现有的关于乳三肽的专利进行了总结。

表2 目前关于乳三肽的专利Table 2 Summary of recent patents regarding lactotripeptides

9 IPP、VPP的天然新来源

牛奶中的酪蛋白是IPP、VPP和LPP的传统来源，目前已经上市销售的降血压功能食品中的乳三肽均源自牛奶或酪蛋白，且多已申请国际专利保护。因此，开拓乳三肽的新来源对于新型降血压功能食品的开发具有重要意义。随着信息技术的快速发展，许多蛋白质的一级结构已经明确，这为寻找上述乳三肽的新来源提供了极大的便利。

9.1 奶类新来源

除了牛奶外，很多其他来源的奶中也含有酪蛋白，因此也是乳三肽的潜在来源。Tagliazucchi等对骆驼、山羊和绵羊奶进行体外消化，发现山羊和绵羊奶的水解物中含有VPP，骆驼、山羊和绵羊奶的水解物中含有IPP[76]，进一步研究表明体外消化可从山羊奶的β-和κ-酪蛋白中释放出IPP和VPP[75]。另外，在水牛奶[108-109]和牦牛奶[110-111]及其制品的模拟胃消化液中也发现了含有IPP和/或VPP序列的一系列前体物质[108]。生物信息学分析表明，IPP还存在于马奶和驴奶的κ-酪蛋白中[78]及骆驼奶的β-酪蛋白（片段173～175）和κ-酪蛋白（片段99～101）中[73]，VPP存在于骆驼奶的κ-酪蛋白中[73]。一项研究证实了上述发现，利用瑞士乳杆菌130B4（Lactobacillus helveticus130B4）发酵骆驼奶后，从水解产物中分离纯化得到了含有IPP的九肽序列Ala-Ile-Pro-Pro-Lys-Lys-Asn-Gln-Asp[112-113]。

9.2 谷物新来源

使用Uniprot数据库中的肽段检索工具进行检索，发现小麦、大米、黑麦、大麦、燕麦、玉米、小米等谷物的主要存储蛋白中都含有IPP和VPP序列[78]。Hu Ying等的研究证实了上述结果，他们在小麦和黑麦的发酵酸面团中成功分离鉴定出了IPP和VPP[114]。因此，谷物蛋白也是乳三肽的新型来源。

表3对文献报道的乳三肽的新来源进行了总结。

表3 乳三肽新来源的总结Table 3 Summary of the new sources of lactotripeptides

10 结 语

IPP、VPP和LPP对高血压患者具有明确的预防和治疗效果，而且安全性高，因此，是一类极具前景的生物活性物质，在第三代降血压功能食品的研究与开发中具有广阔的应用前景，国外已有多种产品上市。然而，目前乳三肽主要来源于酪蛋白，其生产工艺及产品开发已经较为成熟，但相关公司已对该来源的技术和产品进行了专利保护；乳三肽仅存在于特定的蛋白质中，而现有的生物信息学技术并未涵盖所有蛋白质资源的序列，这限制了乳三肽新来源的开发；另外，乳三肽富含脯氨酸，而目前市面上商品化的蛋白酶很难直接水解蛋白质原料以获得乳三肽。基于上述原因，虽然已有部分学者开始关注乳三肽，但是目前国内尚未发现相关产品上市。因此，寻找上述乳三肽的新来源以及开发新的生产工艺对于我国新型第三代降血压功能食品的开发至关重要。