基于主成分分析的硝普钠处理对采后荔枝活性氧代谢的影响

谢 晶，覃子倚，潘家丽，李 静，董新红

（桂林理工大学化学与生物工程学院，广西 桂林 541004）

荔枝（Litchi chinensisSonn.）是中国南方亚热带地区的特产水果之一[1]，广泛种植于广东和福建南部。荔枝成熟于高温季节，果实含水量高，采后荔枝生理代谢活动十分旺盛，极易发生褐变，影响其商业价值[2-3]。因此，大力发展荔枝贮运保鲜技术，控制采后荔枝的衰老褐变，保持其良好的生理品质具有重要意义。

荔枝的保鲜手段目前常见的有冷藏保温、药物处理[4]、气调处理[5]等，均能在一定程度上维持荔枝的贮藏品质。其中，冷藏保温可以有效抑制荔枝色泽的暗淡，延缓硬度的下降，但没有对低温的适应环节，也会造成荔枝发生冷害，使其生理品质急速下降[6]。气调保鲜虽具有健康、环保的优点[7]，但其贮运期间很难保持气调保鲜所需的恒定温度[5]，且成本十分的高昂。药物保鲜虽然可以大规模应用于生产，但有些药物保鲜剂含有低毒，会对荔枝产生影响，所以，寻找一种无毒、环保的保鲜剂对荔枝的保鲜有重要意义。

一氧化氮（nitric oxide，NO）是植物中广泛存在的信号分子，不仅参与调节了生物体内众多的生理生化反应[8]，而且可以减轻活性氧对机体的损伤[9]。目前研究发现，NO可能是一种可延缓果蔬衰老的植物生长调节剂，已应用于多种果蔬保鲜研究[10]。Han Shuai等[11]研究发现使用10 μmol/L NO气体熏蒸处理后，桃果实中蔗糖的含量增加，而葡萄糖和果糖的含量下降。杨睿等[12]研究表明NO处理能够延缓果蔬VC的流失以及可溶性固形物含量和硬度的下降，降低水分的流失，抑制叶绿素的降解。但是NO直接处理果蔬极有可能造成果蔬缺氧，从而激发无氧呼吸，使果蔬的营养物质产生乙醇等产物，最终导致果蔬腐烂变质，而硝普钠充当NO的供体不仅可以避免这个危害，而且更利于推广[13]。目前硝普钠已应用于枇杷[14]、番茄[15]、茄子[16]等保鲜，且有研究表明硝普钠处理能有效延缓果实褐变，有效降低果实细胞膜透性，保持果实原有硬度和减缓果实中丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量增加[17]。

本实验以当季采摘‘妃子笑’荔枝果实为原材料，在4 ℃条件下，以不同浓度的硝普钠处理荔枝，定期测定荔枝果实的褐变指数、质量损失率、细胞膜透性、过氧化氢（H2O2）含量、超氧阴离子自由基（O2－·）产生速率、MDA含量、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力等生理指标变化，以期为硝普钠用于采后保鲜提供依据和参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

‘妃子笑’荔枝 桂林市五里店果蔬批发市场；硝普钠 天津市大茂化学试剂厂；所有实验用的化学试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

HWS-24电热恒温水浴锅 上海一恒科技有限公司；3K3冷冻离心机 德国Sartorious公司；722PC可见光分光光度计 上海佑科仪器仪表有限公司；TU-50紫外分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；50P电子天平 北京赛多利斯科学仪器有限公司；PHS-3E电导率仪 上海仪电科学仪器股份有限公司；LRH-25-Z恒温培养箱 韶关市泰宏医疗器械有限公司；NR6CP色差仪 深圳市三恩时科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品处理方法

样品处理方法参考文献[13]并稍作修改。选用八至九成熟度，大小均匀，表皮无破损，无病害的‘妃子笑’荔枝，清洗干净后，分别用浓度为10、50、100 μmol/L的硝普钠浸泡2 h，以清水处理为对照组（CK），晾干后用厚度为0.11 mm的PE保鲜袋装好，4 ℃条件下贮藏，每3 d取样一次（即0、3、6、9、12 d），取样当天测定褐变指数、质量损失率、细胞膜通透性，剩余荔枝果皮经液氮速冻研磨打碎后于－80 ℃冷冻贮藏备用。每次实验进行3 次重复，每次重复使用20 颗荔枝。

1.3.2 褐变指数

参考文献[18]采用分级法根据荔枝果皮的褐变面积将荔枝分为5 级，每次选30 个果实进行测定，每3 d测定1 次，按式（1）计算褐变指数。

1.3.3 质量损失率测定

参照文献[19]测定荔枝的质量损失率。贮藏开始时的荔枝质量记为m1/g，贮藏一段时间（3、6、9、12 d）后的荔枝质量记为m2/g，按式（2）计算质量损失率。

1.3.4 细胞膜透性测定

参照文献[20]并加以改进，对照组和处理组分别取5 个荔枝的果皮，分别均匀地在每个果皮上切取3 片直径6 mm、厚度一致的荔枝果皮圆片，再放入50 mL的离心管中用去离子水清洗3 次，并向果皮圆片中加入20 mL的蒸馏水，于25 ℃在摇床上振荡1 h后，用电导仪测定浸出液体的电导率A0，然后将测定过A0的圆片及溶液进行煮沸30 min，降至室温后测定其电导率A1，重复3 次。按式（3）计算相对电导率，以表征细胞膜透性。

1.3.5 过氧化氢含量测定

参考文献[21]测定H2O2含量。称取2 g荔枝果皮，加入5 mL、pH 6.5的磷酸缓冲液，于12 000 r/min、4 ℃离心20 min，用－20 ℃预冷丙酮将离心得到的沉淀物洗涤3 次，直到除去色素。再向洗涤后的沉淀中加入3 mL 2 mol/L的硫酸，待完全溶解后吸取1 mL样品提取液进行比色。H2O2含量单位为μmol/g。

1.3.6 超氧阴离子自由基的产生速率测定

称取2 g果皮，参考文献[22]中的羟胺氧化反应方法测定O2－·产生速率。

1.3.7 丙二醛含量测定

称取果皮2 g，参考文献[22]用硫代巴比妥酸显色法测定MDA含量，单位为μmol/g。

1.3.8 超氧化物歧化酶活力测定

称取2 g荔枝果皮，参考文献[23]采用氮蓝四唑光还原法测定SOD活力，以每克果蔬样品每分钟对氮蓝四唑光化反应抑制率为50%为1 个酶活力单位（U），单位为U/g。

1.4 数据处理与分析

所有实验均重复3 次，结果以平均值±标准差表示，采用Excel软件进行数据整理，并采用SPSS 23.0软件对数据进行相关性分析、主成分分析。采用Origin 8.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 不同浓度硝普钠处理对荔枝果实褐变指数的影响

不同浓度的硝普钠处理对荔枝褐变指数的影响如图1所示，荔枝的褐变程度均随贮藏时间的延长而提高，在贮藏末期（12 d）时，10、50、100 μmol/L硝普钠处理组的褐变指数分别比CK组低20.89%、13.38%、16.20%，且不同浓度硝普钠处理组的褐变指数明显低于CK组，说明硝普钠处理能有效抑制荔枝的采后褐变，其中浓度为10 μmol/L硝普钠处理对荔枝褐变的抑制效果最佳。

图1 硝普钠处理对荔枝褐变指数的影响Fig. 1 Effect of sodium nitroprusside treatment on browning index of litchi

2.2 不同浓度硝普钠处理对荔枝果实质量损失率的影响

荔枝自身水分多，其采后呼吸作用旺盛，其果皮质量损失率上升主要由果皮失水引起[24]。荔枝对照组和处理组的质量损失率均随着贮藏时间的延长而提高（图2），这可能是荔枝采后果皮细胞膜逐渐破裂失去水分导致的[25]。在贮藏前期，荔枝CK组和3种不同浓度硝普钠处理组的荔枝质量损失率无明显差异，贮藏中后期（6 d后），硝普钠处理组荔枝质量损失率明显低于CK组，在贮藏12 d时，10、50、100 μmol/L硝普钠处理组的质量损失率分别比对照组降低14.69%、17.19%、26.37%，且均明显低于对照组，其中100 μmol/L硝普钠处理组荔枝质量损失率最低。有研究表明NO是一种生物活性分子，对果蔬采后品质的保持有一定作用，且NO处理过的脐橙质量损失率的上升被显著的抑制，有效地减缓了水分的扩散[26]。并且，失水状况的改善有利于延缓荔枝褐变的进程[27]。所以贮藏中后期，硝普钠处理组质量损失率明显低于对照组，表明硝普钠可以一定程度抑制荔枝水分的散失，延长荔枝采后的贮藏期限。

图2 硝普钠处理对荔枝质量损失率的影响Fig. 2 Effect of sodium nitroprusside treatment on mass loss rate of litchi

2.3 不同浓度硝普钠处理对荔枝果实细胞膜透性的影响

果实在贮藏过程中，随着膜脂过氧化的进行，细胞膜的完整性会逐渐被破坏，细胞膜透性会逐渐增大[28]，细胞膜透性可通过相对电导率表示。由图3可知，在贮藏前期（0～9 d），所有处理组的相对电导率均快速上升，而在贮藏后期，对照组的相对电导率一直上升，硝普钠处理组的电导率呈现稳定或下降趋势。在贮藏第12天，10、50、100 μmol/L硝普钠处理组的相对电导率分别比CK组降低16.25%、11.25%和7.5%，且各处理组和CK组在贮藏末期均呈明显差异，而10 μmol/L硝普钠处理组在整个贮藏期均与CK组差异明显，表明硝普钠处理能有效减轻荔枝细胞膜的损伤，降低荔枝细胞膜透性，从而降低果皮组织的相对电导率。

图3 硝普钠处理对荔枝细胞膜透性的影响Fig. 3 Effect of sodium nitroprusside treatment on membrane permeability of litchi

2.4 不同浓度硝普钠处理对荔枝活性氧产生及膜脂过氧化作用的影响

在果实采后衰老过程中，活性氧清除系统功能下降，造成果实中H2O2含量增加、产生速率提高，而过多的自由基易导致荔枝细胞膜脂发生过氧化，破坏细胞膜，MDA是膜脂过氧化的产物[29]，可以反映果蔬细胞膜的完整性。

H2O2是评价采后果蔬活性氧代谢的重要指标，H2O2含量越高，表明活性氧代谢越旺盛。荔枝CK组和硝普钠处理组的H2O2含量，均先急速上升（0～3 d）后下降，再（6 d后）缓慢上升（图4）。在贮藏末期（12 d），10、50、100 μmol/L硝普钠处理组的H2O2含量分别比CK组的H2O2含量降低了11.69%、17.84%、8.67%，且均明显低于CK组。说明硝普钠处理能有效抑制H2O2活性氧的代谢，从而更好地保持荔枝的品质，延长其贮藏期，以50 μmol/L的硝普钠处理对H2O2的抑制效果最好。

图4 硝普钠处理对荔枝H2O2含量的影响Fig. 4 Effect of sodium nitroprusside treatment on the content of H2O2 in litchi

不同处理对荔枝MDA含量的影响如图6所示。CK组和硝普钠处理组的MDA含量均呈先上升后下降的趋势，在6 d时达到峰值，此时对照组和10、50、100 μmol/L硝普钠处理组的MDA含量分别为12.78、9.28、6.04、9.98 μmol/g，在6 d后缓慢下降，这可能是由于贮藏后期荔枝代谢减弱，自由基产生速度减慢，膜脂氧化程度有所降低。不同浓度硝普钠处理的荔枝MDA含量明显低于CK组MDA的含量，且浓度为50 μmol/L的硝普钠处理组荔枝MDA含量明显低于其他处理组。表明硝普钠处理能明显抑制MDA的产生，降低膜脂过氧化程度，从而保持荔枝的贮藏品质。周慧等[30]研究也表明，NO处理可以有效降低鲜切桃膜脂过氧化程度。MDA含量变化趋势与图5和图6所示的H2O2含量和产生速率的变化趋势相似，说明活性氧积累与膜脂过氧化之间具有一定相关性。

图6 硝普钠处理对荔枝MDA含量的影响Fig. 6 Effect of sodium nitroprusside treatment on MDA content of litchi

2.5 不同浓度硝普钠处理对荔枝果皮超氧化物歧化酶活力的影响

SOD是生物体内重要的抗氧化酶，被认为是清除活性氧的第一道防线[31]，是衡量果蔬生理品质的一个重要指标。由图7可知，荔枝SOD活力在贮藏0～3 d时急剧升高，CK组和硝普钠处理组在3 d时达到峰值（100 μmol/L在6 d时达到峰值），且硝普钠处理组的SOD活力始终高于对照组，说明硝普钠处理对SOD活力具有一定的提升作用。贮藏6 d以后，硝普钠处理组的SOD活力均明显高于对照组，而100 μmol/L和50 μmol/L硝普钠处理组的SOD活力一直明显高于处理组，说明较高浓度的硝普钠处理对荔枝SOD活力具有更好的促进作用。

图7 硝普钠处理对荔枝SOD活力的影响Fig. 7 Effect of sodium nitroprusside treatment on SOD activity of litchi

2.6 荔枝贮藏过程中各生理指标相关性分析结果

对荔枝保鲜的各生理指标进行相关性分析，结果如表1所示。荔枝贮藏时间和褐变指数、质量损失率、细胞膜透性、H2O2含量、丙二醛含量呈极显著正相关（相关系数r分别为0.899、0.968、0.842、0.806、0.691，P＜0.01），与产生速率呈显著负相关（r＝－0.340，P＜0.05），说明在贮藏期间，褐变指数、质量损失率、细胞膜透性、H2O2含量、丙二醛含量和产生速率均能反映贮藏期荔枝的品质，且SOD与MDA呈极显著负相关（r＝－0.140，P＜0.01），表明SOD活力越高，自由基清除速率越快，膜脂过氧化程度越低，荔枝各生理指标间相关性明显。

表1 各生理指标间的相关性分析Table 1 Correlation analysis between various physiological indicators

2.7 荔枝贮藏过程中各生理指标主成分分析结果

对荔枝生理指标进行主成分分析，将荔枝贮藏期间的7 项指标转化为2 个主成分（表2）。结果表明，前2 个主成分的贡献率分别为63.855%、21.275%，累计贡献率为85.130%，且前2 个主成分特征值均大于1，所以前2 个主成分可以代表各成分大部分的信息[32]。因此，选取前2 个主成分作为荔枝采后贮藏品质的重要主成分。

表2 主成分特征值及方差贡献率Table 2 Eigenvalues of principal components and their contribution to total variance

由表3和图8可知，褐变指数、质量损失率、细胞膜透性、H2O2含量和MDA含量在第1主成分正坐标轴处具有较高载荷，说明第1主成分主要反映了这5 个指标的信息；产生速率在第2主成分正坐标轴处有较高载荷，SOD活力在负坐标轴处有较高载荷，说明第2主成分主要代表产生速率和SOD活力这2 个指标，且第二主成分与产生速率呈正相关，与SOD活力呈负相关。根据载荷绝对值的大小可知，在第1主成分中贡献率大小为褐变指数＞细胞膜透性＞质量损失率＞MDA含量＞H2O2含量；而第2主成分中贡献率比较结果为SOD活力＞产生速率。

表3 主成分载荷矩阵Table 3 Principal component loading matrix

图8 荔枝贮藏过程中各生理指标主成分分析因子载荷图Fig. 8 Principal component analysis factor load diagram of physiological indexes during storage of litchi

由因子载荷图（图8）可知，荔枝褐变指数、质量损失率、细胞膜透性、H2O2含量、MDA含量在第一主成分（63.855%）的正轴，且距离Y轴较远，即褐变指数、质量损失率、细胞膜透性、H2O2含量、MDA含量对第一主成分贡献大；而产生速率和SOD活力离X轴较远，表明产生速率和SOD对第2主成分的贡献较大。结合载荷矩阵（表3）与因子载荷图（图8）可知，荔枝品质的关键指标是褐变指数、质量损失率、细胞膜透性和SOD活力。

2.8 荔枝品质综合评价

由表4可知，可用PC1、PC2代替原来的7 个指标，得出各主成分特征向量PCA1＝0.207Z1＋0.219Z2＋0.217Z3＋0.204Z4－0.044Z5＋0.196Z6－0.093Z7；PCA2＝0.122Z1－0.098Z2－0.067Z3－0.088Z4－0.531Z5＋0.077Z6＋0.585Z7；Zi代表标准化后的数据。

表4 主成分得分系数矩阵Table 4 Principal component score matrix

以选取的第1、第2主成分的方差贡献率α1（63.855%）、α2（21.275%）作为权数构建综合评价模型F＝α1Y1＋α2Y2，即F＝0.638 55hY1＋0.212 75hY2。F值代表荔枝贮藏品质的综合得分。

荔枝综合得分见图9，荔枝对照组硝普钠与处理组的综合得分先上升后下降。在贮藏末期（12 d），10、50、100 μmol/L硝普钠处理组的综合得分分别比对照组高0.91、0.54、2.34，且不同浓度硝普钠处理组的综合得分均明显高于对照组，因此硝普钠处理对荔枝品质具有明显维持的作用，且在贮藏后期（6 d后）100 μmol/L硝普钠处理组的综合得分始终高于其他硝普钠处理组和对照组，表明100 μmol/L硝普钠处理在贮藏后期更能有效保持荔枝品质，保鲜效果更佳。

图9 荔枝各处理组的综合得分Fig. 9 Comprehensive score of litchi fruit in each treatment group

3 结 论

研究结果表明，不同浓度硝普钠处理可以延缓荔枝的褐变，维持荔枝表皮的水分，阻止其快速流失，保护荔枝细胞膜结构、抑制H2O2和产生速率以及MDA的产生和积累，提高SOD活力，从而一定程度上维持荔枝采后的生理品质。其中，浓度为10 μmol/L的硝普钠处理在抑制果皮褐变及降低细胞膜透性方面效果最为显著；50 μmol/L的硝普钠处理在抑制H2O2、和MDA的产生和积累方面效果明显；100 μmol/L的硝普钠处理则能在贮藏6 d后，有效减缓荔枝失水和提高SOD的活性。

主成分分析的目的是简化评价指标[31]，本实验将7 个荔枝生理指标简化为2 个主成分，其总贡献率为85.13%，能代表荔枝的绝大部分信息，在第1主成分中贡献率大小依次为褐变指数＞细胞膜透性＞质量损失率＞MDA含量＞H2O2含量；而第2主成分中贡献率大小依次为SOD活力＞产生速率。所以，荔枝品质的关键指标是褐变指数、细胞膜透性、质量损失率和SOD活力，不同浓度的硝普钠处理对荔枝活性氧代谢及采后褐变调控方面均有积极的效果。且根据构建的荔枝品质评价模型可知，100 μmol/L的硝普钠处理组在贮藏后期（6 d后）的综合得分更高，即其贮藏品质最佳，能有效延长荔枝的贮藏期。

综上，在4 ℃的贮藏条件下，硝普钠处理能有效地抑制采后荔枝的活性氧代谢和褐变衰老，维持果实良好的生理品质，延长其货架期，100 μmol/L的硝普钠处理对荔枝保鲜效果最好，能更好地保持果实的采后品质。