燕麦多糖对小鼠急性胃黏膜损伤的保护作用

丁丽婷，潘世杰，胡婕伦，钟亚东，赵明姣，吴 婷，方 芳，黄钻元，聂少平，尧梅香，钟虹光，谢明勇,*

（1.南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，中加食品科学技术联合实验室（南昌），江西 南昌 330047；2.江中食疗科技有限公司，江西 九江 330000）

胃溃疡是一种常见的消化性疾病[1-2]，病因多样[3-4]，其形成与胃黏膜损伤密切相关[5-7]，因此保护胃黏膜对预防胃溃疡有着重要的意义。研究显示，乙醇致急性胃黏膜损伤的发病率日益增高[8]，因此乙醇成为不容忽视的胃黏膜损伤因子。目前针对胃黏膜保护手段主要有胃黏膜保护剂（如胃肠激素类、硫氢键类、铋剂类、柱状细胞稳定剂和其他类）[9]及具有健胃养胃功效的天然提取物[10]。近年来，有研究陆续发现多糖对胃黏膜损伤具有一定的保护作用，表现出明显的抗溃疡活性，如枸杞多糖和苦瓜多糖通过抗炎、抗氧化、抗凋亡对胃黏膜起了相当大的保护作用[2,11]；石斛多糖通过抑制氧化应激诱导的细胞凋亡对胃黏膜上皮细胞起一定的保护作用[12]；从猴头菇分离纯化的两种多糖通过促进胃黏膜的保护因子表皮细胞生长因子（epidermal growth factor，EGF）、碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2），抑制攻击因子白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）分泌对胃黏膜起到预防保护作用[1]；从墨西哥蕨藻（Caulerpa mexicana）分离的海藻硫酸多糖对乙醇诱导的胃损伤具有胃保护活性，其通过前列腺素介导和减少氧化应激的机制调节，而不受NO调节通路影响[13]。

燕麦多糖是以β-葡聚糖为主的水溶性膳食纤维，燕麦β-葡聚糖具有多种生理活性，如免疫调节、降血糖、降低胆固醇、调节肠道菌群等[14-16]。Jeong等发现从发酵大麦麸皮中提取的β-葡聚糖对乙醇诱导的胃黏膜损伤具有一定保护作用[17]。已有研究表明，燕麦β-葡聚糖可以在一定程度上维持肠黏膜屏障结构和功能的完整性并改善肠黏膜机械屏障和生物屏障的损伤[18-19]，然而针对胃黏膜保护作用的研究鲜见报道。本实验采用乙醇致小鼠急性胃黏膜损伤模型，探究燕麦多糖对胃黏膜损伤的保护作用，为以燕麦多糖为原料具有养胃功能特性食品的开发利用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

SPF级昆明雄性小鼠（体质量32～38 g）由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，生产许可证号：SCXK（京）2016-0011。小鼠饲料、垫料由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。

燕麦品种为澳大利亚Bannister，为裸燕麦。

西咪替丁 美国Sigma公司；淀粉总量检测试剂盒爱尔兰Megazyme公司；IL-10、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、胃蛋白酶、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、NO、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、还原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）、MDA酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒南京森贝伽生物科技有限公司；苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色液 上海碧云天生物科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

HH-4数显恒温水浴锅 常州国华电器有限公司；T6新世纪紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；1260高效液相色谱仪 美国安捷伦公司；XS105电子分析天平 梅特勒-托利多（上海）仪器公司；自动组织脱水机、组织包埋机、生物组织摊烤片机、轮转式切片机 金华市科迪仪器设备有限公司；3K15高速台式离心机 德国Sigma公司；LAQUAtwin-Ph-3微量pH计 日本HORIBA公司；KZ-II组织破碎仪 武汉塞维尔生物科技有限公司；iMark酶标仪 美国Bio-Rad公司；Aperio LV1病理切片扫描仪 德国Leica公司。

1.3 方法

1.3.1 燕麦多糖的提取与制备

粉碎燕麦→加入10 倍体积82%乙醇溶液于水浴锅，85 ℃加热2 h→离心（4 800 r/min、10 min）除去上清液，置于通风橱挥发干过夜→加入10 倍体积蒸馏水，52 ℃、2 h→离心（4 800 r/min、10 min）得到上清液，沉淀继续加10 倍体积蒸馏水，52 ℃、2 h，离心（4 800 r/min、10 min），合并两次离心后的上清液→旋转蒸发浓缩→加入0.8 mL/100 gα-耐高温淀粉酶，95 ℃、2 h→加入0.1 mL/100 g糖化酶，60 ℃、30 min→加入0.2 mL/100 g蛋白酶，60 ℃、40 min→100 ℃灭酶15 min→冷却后离心（10 000 r/min、10 min）、旋转蒸发、加无水乙醇醇沉（醇沉时保证液体中乙醇体积分数为80%），静置过夜→离心（10 000 r/min、10 min）除去上清液、复溶、旋转蒸发，用8 000～14 000 Da透析袋于蒸馏水中4 ℃透析3 d→离心（10 000 r/min、10 min）、旋转蒸发、真空冷冻干燥。

1.3.2 燕麦多糖的基本理化性质测定

中性糖、糖醛酸、蛋白质量分数分别采用苯酚-硫酸法、硫酸-咔唑法、考马斯亮蓝法测定；淀粉质量分数采用淀粉总量检测试剂盒测定。

采用高效凝胶渗透色谱法对燕麦多糖的平均分子质量进行表征。色谱条件：保护柱：UltrahydrogelTMGuard柱（6 mmh40 mm，10 μm）；分离柱：UltrahydrogelTMLinear柱（7.8 mmh300 mm，10 μm）；柱温：35 ℃；流动相：0.02 g/100 mL NaN3水溶液；流速：0.6 mL/min；进样量：20 μL。采用G1362A示差检测器进行检测，示差检测器温度：35 ℃；紫外检测器的波长为280 nm。采用葡聚糖作为标品，利用Chem-Station色谱工作站采集分析数据。用流动相配制1.0 mg/mL的燕麦多糖及葡聚糖标准溶液（Dextran T-10、Dextran T-40、Dextran T-50、Dextran T-70、Dextran T-500、蓝色葡聚糖），过0.22 μm水系滤膜，然后进样分析。

1.3.3 乙醇致小鼠急性胃黏膜损伤模型的建立

60只雄性昆明小鼠适应性喂养一周后，按体质量随机分成6 组，分别为正常组、模型组、阳性组以及燕麦多糖低（100 mg/kgmb）、中（200 mg/kgmb）、高（400 mg/kgmb）剂量组，每组10只。实验前对各组小鼠进行称质量、标号并记录。灌胃期间记录小鼠体质量变化以及进食、饮水、精神状态等一般情况。根据体质量变化调整灌胃剂量（0.1 mL/10 gmb），正常组、模型组灌胃生理盐水，多糖组分别灌胃相应剂量受试物，连续灌胃14 d，阳性组持续灌胃生理盐水12 d后，灌胃西米替丁（100 mg/kgmb）3 d。第14天，各组小鼠灌胃后均严格禁食不禁水12 h，期间亦禁止给予受试物。第15天开始造模，各组均按相应剂量正常灌胃对应受试物，正常组和模型组灌胃对应剂量生理盐水。1 h后，除正常组外均按0.1 mL/10 g给予体积分数70%乙醇溶液，70 min后处死。

1.3.4 脏器指数测定

所有小鼠禁食不禁水12 h，称量并记录体质量后，处死，取脏器（肝脏、肾脏、脾脏、胸腺）并用生理盐水清洗，滤纸吸干后称质量，按公式（1）计算脏器指数。

1.3.5 胃液pH值的测定

小鼠处死后，剪开腹部取出胃，从贲门处沿胃大弯剪开，取出小鼠胃内容物，3 000 r/min离心10 min，取上清液，用微量pH计测定小鼠胃液pH值。

1.3.6 胃黏膜损伤表观形态观察

用生理盐水洗净胃上残留内容物后，滤纸吸干后把胃展开平铺在坐标纸上并固定，拍照记录后用Image J图像处理软件统计胃黏膜出血面积及对应胃组织腺部总面积，按公式（2）、（3）分别计算胃黏膜损伤指数以及胃黏膜损伤抑制率[20-21]。

1.3.7 胃组织病理切片观察

选取每只小鼠胃黏膜损伤最严重部位，切下约10 mmh2 mm的组织，固定于体积分数4%福尔马林溶液中，常规梯度脱水、包埋、切片、烤片，HE染色后置于病理切片扫描仪下200 倍放大观察。

1.3.8 胃组织匀浆制备

将胃组织与磷酸盐缓冲液（pH 7.4）按1∶9（m/V）混合，加入4 mm研磨珠，用组织破碎仪进行破碎，制得体积分数10%胃组织匀浆。将匀浆液3 500 r/min、4 ℃离心10 min，取上清液，置于－80 ℃保存以进行后续实验。

1.3.9 胃组织生化指标的测定

参照试剂盒说明书，测定胃组织匀浆上清液中的IL-10、LPS、VEGF、GSH、MDA水平及SOD、胃蛋白酶活力。

1.3.10 血清NO浓度的测定

小鼠血液室温自然凝固后以3 000 r/min离心20 min，取上清液，参照试剂盒说明书测定血清中NO浓度。

1.4 数据统计与分析

所有数据均重复测定3 次，使用SPSS 26.0软件进行数据分析，结果以平均值±标准差表示。数据显著性分析采用单因素方差分析和Duncan’s检验，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 燕麦多糖的基本理化性质

从表1可以看出，燕麦多糖的中性糖质量分数为85.70%，糖醛酸质量分数为9.14%，蛋白质量分数为0.77%，其中淀粉质量分数低于1%，表明在水提醇沉的基础上采用酶解处理的方法从燕麦中提取到的主要成分为水溶性非淀粉多糖。图1为燕麦多糖的高效液相凝胶渗透色谱图。根据葡聚糖标准曲线方程（lgmw＝－0.604 3t＋13.29，R2＝0.995 3），计算得到燕麦多糖平均分子质量为160 127.528 Da，与文献[22]报道的结果相符，说明所得为低分子质量的燕麦多糖。

表1 燕麦多糖的基本理化性质Table 1 Chemical composition of oat polysaccharides

图1 燕麦多糖的凝胶渗透色谱图Fig. 1 Gel permeation chromatogram of oat polysaccharides

2.2 燕麦多糖对小鼠行为活动、体质量及脏器指数的影响

灌胃期间，各组小鼠状态正常、毛发光泽、活动敏捷，无脱毛和死亡现象，并且进食饮水无明显变化；除正常组以外的各组小鼠经体积分数70%乙醇溶液造模后相继出现了步态不稳、俯卧、震颤、肢体僵硬等现象，活动明显减少。小鼠体质量可以直接反映其生长情况，如图2所示，各燕麦多糖低、高、中剂量组小鼠体质量与正常组有相同的变化趋势，由于禁食，各组第15天体质量下降，表明燕麦多糖对小鼠体质量没有影响。如表2所示，各实验组之间脾脏指数、肾脏指数、肝脏指数、胸腺指数均无显著差异（P＞0.05），说明乙醇致急性胃黏膜损伤模型小鼠的其他脏器无明显损伤，燕麦多糖对小鼠无明显毒副作用。

图2 各组小鼠体质量变化Fig. 2 Body mass change of mice in each group

表2 各组小鼠脏器指数Table 2 Visceral organ indexes of mice in each group

2.3 燕麦多糖对小鼠胃黏膜损伤表观形态的影响

如图3所示，正常组小鼠胃黏膜完整，胃壁光滑，呈淡红色，表面可见黏膜皱襞，未见明显糜烂溃疡和出血等现象。对小鼠灌胃体积分数70%乙醇溶液后，模型组损伤最严重，损伤面积最大，可见粗大的出血条带和大量的出血点，说明乙醇致小鼠急性胃黏膜损伤模型造模成功；提前灌胃西咪替丁和3种剂量的燕麦多糖均可在一定程度上缓解胃黏膜损伤，损伤面积、出血条带和出血点数量不同程度地减少，其中阳性组和燕麦多糖高剂量组效果最好，胃黏膜基本完整，只有个别出血点，未见溃疡、糜烂等情况。燕麦多糖组损伤情况与剂量呈一定关系，燕麦多糖组剂量越高，损伤面积越小，对胃黏膜损伤的保护作用越好。

图3 各组小鼠胃黏膜损伤表观形态Fig. 3 Observation of gastric mucosal injury in mice in each group

由表3可知，与正常组相比，模型组胃黏膜损伤指数显著增高（P＜0.05），阳性组及燕麦多糖低、中、高剂量组与模型组相比，均能显著降低胃黏膜损伤指数，损伤抑制率分别为61.04%、49.42%、66.80%、76.04%（P＜0.05），燕麦多糖对小鼠胃黏膜损伤指数和损伤抑制率均呈剂量依赖性趋势。

表3 各组小鼠胃黏膜损伤指数及损伤抑制率Table 3 Gastric ulcer indexes and injury inhibition rates of mice in each group

2.4 燕麦多糖对小鼠胃组织病理学的影响

如图4所示，正常组小鼠胃组织结构清晰完整，胃腺呈管状整齐有序，未见胃黏膜上皮细胞脱落及充血现象，与此形成对比的是，模型组小鼠胃组织腺体结构紊乱，局部区域大量出血，上皮细胞大量脱落，可见大量的炎性细胞浸润。与模型组相比，预先给予小鼠燕麦多糖和西咪替丁可明显改善胃黏膜的损伤状态，胃黏膜上皮细胞脱落、胃黏膜充血及腺体结构紊乱情况有所缓解，炎性细胞浸润减少。

图4 各组小鼠胃组织病理学图（×200）Fig. 4 Histopathological observation of gastric tissue in each group (× 200)

2.5 燕麦多糖对小鼠胃液pH值的影响

解剖小鼠胃发现，正常未经乙醇灌胃的小鼠胃里充满未消化的垫料和少量饲料，胃液较少，未能进行胃液pH值测定，而经体积分数70%乙醇溶液灌胃的小鼠胃液分泌量明显增多，如图5所示，灌胃燕麦多糖高剂量组和阳性组小鼠胃液pH值显著高于模型组小鼠（P＜0.05），而燕麦多糖低、中剂量组对比模型组pH值有所回升，但变化不显著。

图5 各组小鼠胃液pH值Fig. 5 pH of gastric juice in mice in each group

2.6 燕麦多糖对小鼠胃组织生化指标的影响

如图6所示，模型组的胃蛋白酶活力显著高于正常组，这表明给小鼠灌胃乙醇会导致该酶活力升高。提前灌胃西咪替丁能够缓解由70%乙醇溶液引起的胃蛋白酶活力上升，并恢复到小鼠正常水平。对比模型组，灌胃低、中、高剂量燕麦多糖均能导致胃蛋白酶活力显著降低（P＜0.05），并使小鼠胃蛋白酶活力水平恢复至正常小鼠水平（P＞0.05）。

图6 各组小鼠胃组织胃蛋白酶活力Fig. 6 Pepsin activity in gastric tissue in each group

如图7所示，与正常组相比，经70%乙醇溶液处理的小鼠胃组织LPS质量浓度显著增加（P＜0.05）。对比模型组，燕麦多糖低、中、高剂量组胃组织LPS质量浓度均显著下降（P＜0.05），且回复到正常水平，与正常组相比无显著差异（P＞0.05）。

图7 各组小鼠胃组织LPS质量浓度Fig. 7 LPS content in gastric tissue in each group

如图8所示，与正常组相比，70%乙醇溶液引起的胃黏膜损伤使得小鼠胃组织中IL-10质量浓度显著下降（P＜0.05）；高剂量燕麦多糖可以缓解乙醇导致的小鼠胃黏膜组织中IL-10质量浓度的下降，与正常组无显著差异。

图8 各组小鼠胃组织IL-10质量浓度Fig. 8 Content of IL-10 in gastric tissue in each group

如图9所示，与正常组相比，经乙醇处理后的小鼠胃组织中VEGF水平显著下降（P＜0.05）；对比模型组，燕麦多糖低、中、高剂量组胃组织中VEGF质量浓度显著上升（P＜0.05），并且与正常组无显著差异（P＞0.05）。

图9 各组小鼠胃组织VEGF质量浓度Fig. 9 Content of VEGF in gastric tissue in each group

如图10所示，经乙醇灌胃后，模型组小鼠血清NO浓度显著低于正常组（P＜0.05），而预先灌胃3 个剂量的燕麦多糖可以显著缓解由乙醇导致的血清中NO浓度的降低（P＜0.05）。

图10 各组小鼠血清NO浓度Fig. 10 Content of NO in serum in each group

如图11所示，与正常组相比，乙醇引起的胃黏膜损伤使得小鼠胃组织中SOD活力和GSH质量浓度显著降低，而MDA浓度显著增加（P＜0.05）。灌胃低、中、高3 个剂量的燕麦多糖均能显著缓解乙醇导致的小鼠胃组织中SOD活力的降低（P＜0.05），其中燕麦低剂量组效果最好。燕麦多糖3 个剂量组MDA浓度与正常组、模型组差异均不显著（P＞0.05）；而与模型组相比，燕麦多糖高剂量组GSH质量浓度显著升高（P＜0.05），燕麦多糖低、中剂量组GSH质量浓度升高但变化不显著。

图11 各组小鼠胃组织氧化应激水平Fig. 11 Levels of oxidative stress in gastric tissue in each group

3 讨 论

攻击因子和防御因子失衡学说是目前被广泛接受的胃黏膜损伤机制[23]。该假说认为，在新陈代谢正常的情况下，胃黏膜有能力抵抗胃酸和胃蛋白酶等攻击因子的侵蚀，只有当特殊原因导致攻击因子过强或保护因子减弱、局部胃黏膜的抵抗力显著降低时，才会发生胃黏膜损伤。

乙醇是一种有机溶剂，对胃黏膜有很强的腐蚀性，会破坏胃黏膜表面黏液层和黏液细胞，并引起急性炎症，导致出现充血、水肿、出血、糜烂及溃疡等现象[8,24]。本实验肉眼观察到乙醇导致胃黏膜出现粗大的出血条带和大量的出血点；同时，胃组织病理学观察结果表明乙醇可使胃黏膜上皮层发生改变，导致上皮细胞大量脱落，可见大量的炎性细胞浸润，表明实验造模成功。与模型组相比，提前灌胃燕麦多糖的小鼠胃黏膜损伤指数显著下降，其中燕麦多糖高剂量组保护效果最好，这说明提前连续灌胃燕麦多糖能够改善乙醇致小鼠急性胃黏膜损伤。燕麦多糖的主要成分为β-葡聚糖，与和水混合后具有一定的黏稠特性，能形成高黏度的溶胶或凝胶，延缓胃排空和营养物质的吸收[25]，因此猜测燕麦多糖能一定程度抑制乙醇与胃黏膜的紧密接触，从而起到一定的保护作用。正常情况下，胃酸和胃蛋白酶不会消化胃黏膜本身。但当乙醇导致胃黏膜攻击因子和防御因子失衡时，乙醇能上调壁细胞膜上H＋-K＋-ATP酶的表达从而刺激胃酸的分泌，导致胃液pH值降低，激活胃蛋白酶，并提供酸性繁殖条件，加重对组织黏膜侵蚀，进一步诱发胃溃疡[26-28]。本研究结果显示，提前灌胃燕麦多糖可减少乙醇刺激导致的胃酸分泌及抑制胃蛋白酶活性上升，有研究表明燕麦β-葡聚糖通过与胃蛋白酶中的色氨酸残基发生静电或相互作用改变胃蛋白酶的构象，有效抑制了胃蛋白酶的活性，并且抑制效率与燕麦β-葡聚糖浓度呈一定的效量关系[29]。

乙醇对胃黏膜的损伤不仅是来源于乙醇本身，其胃内代谢产物乙醛可代谢产生自由基，而后者在乙醇致胃黏膜损伤中具有重要的作用。乙醇的摄入会导致胃黏膜上皮细胞中氧自由基的产生量增加和抗氧化能力的降低，从而诱发氧化应激，引起组织损伤[30]。正常情况下，自由基生成量达不到损伤组织的程度，当自由基产生过多，氧化系统和抗氧化系统失衡，会进一步导致组织损伤。SOD是机体内重要的抗氧化酶，能够保护生物体免受自由基的损伤，其活力能够反映机体清除氧自由基的能力。MDA是氧自由基导致的脂质过氧化的产物，其浓度可以从脂质过氧化的角度反映胃组织氧化应激水平，乙醇通过促进自由基的氧化导致MDA浓度增加。GSH作为抗氧化剂和自由基清除剂，能保护胃黏膜免受自由基引起的组织损伤。IL-10是一种免疫抑制因子，可抑制多种细胞合成的细胞因子，具有抗炎作用[31]。研究表明，一些天然多糖化合物能够通过减轻乙醇引起的氧化应激损伤和炎症反应，增强胃黏膜防御因子能力，起到保护作用[23]。本研究发现，小鼠经乙醇灌胃后，胃组织中SOD活力、GSH质量浓度、IL-10质量浓度显著下降，MDA浓度显著上升。预先给予燕麦多糖能明显提高SOD活性，且作用效果和剂量呈一定关系。而3 个剂量的燕麦多糖对乙醇致小鼠急性胃黏膜损伤胃组织中MDA水平的增加有一定程度上的缓解，但影响不显著，这可能是由于乙醇致小鼠胃黏膜损伤是急性动物模型，在较短的时间内发挥的作用不大。高剂量的燕麦多糖可以回调乙醇致胃黏膜损伤小鼠胃组织中IL-10、GSH至正常水平。这些结果表明燕麦多糖对胃黏膜损伤的保护作用机制可能与其抗氧化作用及抗炎作用相关。

LPS是革兰氏阴性菌外膜的组成成分，能够促进有毒物质的积累。燕麦多糖能够在一定程度上减少胃组织中LPS质量浓度从而发挥一定的胃黏膜保护作用。目前尚不清楚燕麦多糖抑制胃组织LPS产生的机理，然而作为潜在的益生元，燕麦多糖的抗炎、抗肝硬化等功效[32-33]常被认为与其肠道菌群调节作用相关。此外，在胃黏膜受到损伤时，胃黏膜保护因子VEGF通过增加血管通透性从而稀释胃内有害物质保护胃黏膜，刺激内皮细胞产生保护因子NO，同时还可以刺激腺体和血管生成促进溃疡愈合[34]，减少胃酸分泌，降低氧化应激水平，进而减轻其对胃黏膜损伤的危害[35]。研究表明给机体提供外源性NO，可以明显减轻或者防止胃黏膜的损伤[36]。NO作为内源性血管舒张因子，能明显扩张黏膜血管，改变黏膜血流量。抑制内源性NO合成会增强胃黏膜对攻击因子的敏感性，解除抑制以后，胃黏膜对攻击因子的敏感性大大降低，说明NO能通过降低胃黏膜对攻击因子的敏感性来抵抗胃黏膜损伤的发生[37]。NO还可以通过促进胃黏液和碳酸氢盐的分泌，减少胃酸分泌，抑制中性粒细胞聚集和改善胃黏膜微循环，从而保护黏液屏障和胃黏膜的完整性[38-40]。因此，燕麦多糖还可以通过增加胃组织VEGF含量以及血清NO浓度从而缓解乙醇造成的伤害并促进愈合。

综上所述，燕麦多糖可以改善乙醇导致的小鼠胃液pH值、血清NO浓度、胃组织SOD活性及VEGF、GSH质量浓度的下降以及胃组织胃蛋白酶活力和LPS质量浓度的上升，从而发挥其胃保护功能，并呈一定的量效关系，其功效可能与其物理性质、益生元作用及抗氧化性相关。