茯砖茶通过调节肠道菌群和胆汁酸代谢预防肥胖及高胆固醇血症作用机制

李秀平，欧阳建，唐静怡，周 方，黄建安,3，刘仲华,3,*

（1.湖南农业大学 茶学教育部重点实验室，湖南 长沙 410128；2.国家植物功能成分利用工程技术研究中心，湖南农业大学，湖南 长沙 410128；3.植物功能成分利用省部共建协同创新中心，湖南 长沙 410128）

越来越多的食物选择和热量摄入使得近30 年间全球超重或肥胖人口增加了近21亿[1]，肥胖与一些常见慢性疾病有着重要联系，预防肥胖也成为了全球主要的公共卫生问题之一。茯砖茶是中国地区特有的一类黑茶，众多研究报道了茯砖茶在降脂减肥、降糖降压、抑制炎症、防治炎症性肠炎、保护肝脏、调节肠道菌群等方面的保健功效[2-5]。

最新研究发现，抗生素、高饱和脂肪饮食等会改变肠道微生物结构及增加肠胃炎症性反应，进而对代谢及免疫系统造成不利影响[6]。肝脏作为身体重要的代谢器官，在门静脉和胆管系统的连接下直接与肠道相连，肠-肝循环中胆汁酸（bile acid，BA）循环受体的信号改变能调节机体对食物营养物质的吸收，肠道菌群-肠-肝循环直接影响机体对脂质吸收与代谢[6-8]。有研究表明普洱茶茶褐素通过改变肠道微生物结构、调节肠-肝类法尼醇X受体（farnesoid X receptor，FXR）及BA合成作用来维持胆固醇稳态，改善肥胖[9]。因而肠道菌群-肠肝轴的功能及BA循环机制与机体营养吸收及肥胖有着重要联系。本实验研究茯砖茶水提物（Fuzhuan brick tea water extract，FTE）对高脂饮食（high-fat diet，HFD）组大鼠体质量与血清脂质谱、脂质积累、肝脏与肠道功能及结构、肠道微生物群结构及BA代谢的影响，探究FTE预防肥胖和高胆固醇血症作用。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

SPF级SD大鼠购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司（生产许可证号：SCXK（湘）2019-0004）。

茯砖茶由湖南省益阳茶厂有限公司提供。

甘油三酯（triglyceride，TG）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、谷草转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、总胆汁酸（total bile acid，TBA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）试剂盒南京建成生物工程研究所；肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、瘦素（leptin，LEP）、脂联素（adiponectin，ADPN）、肉毒碱棕榈酰转移酶1（carnitine palmityl transferase-1，CPT-1）酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒 武汉华美生物工程有限公司；胆固醇7α-羟化酶（cholesterol 7α-hydroxylase，CYP7A1）美国Bioss公司；胆固醇27-羟化酶（cholesterol-27-hydroxylase，CYP27A1） 英国ABCam公司；血脂康胶囊 北京北大维信生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

移液枪 德国Eppendorf公司；压力蒸汽灭菌锅上海中安医疗器械厂；AEU-210电子天平 长沙湘仪离心机仪器有限公司；冷冻干燥机 德国Christ公司；超纯水机长沙源科仪有限公司；UV-2550紫外分光光度计、LC10AT-VP Plus高效液相色谱系统 日本岛津公司；Allegra X-22R台式离心机 美国贝克曼公司；快速混匀器 常州智博瑞仪器制造有限公司；微孔板恒温振荡器杭州米欧仪器有限公司；全自动快速研磨仪 上海净信实业发展有限公司；酶标仪 美国Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 茯砖茶成分测定

水浸出物质量分数按GB/T 8305ü2013《茶 水浸出物测定》测定；多酚质量分数按GB/T 8313ü2018《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》；可溶性糖质量分数按蒽酮-硫酸比色法测定[10]；游离氨基酸质量分数按GB/T 8314ü2013《茶 游离氨基酸总量的测定》测定；黄酮类化合物质量分数按三氯化铝比色法测定[11]。

1.3.2 茯砖茶水提物冻干粉的制备

将茯砖茶与超纯水按1∶10（m/V）混合，微沸浸提30 min，抽吸过滤，将滤液冷冻干燥，获得FTE冻干粉，密封包装，－20 ℃保存备用。

1.3.3 动物实验及分组

所有大鼠在温度20～25 ℃、相对湿度（50f5）%环境下（12 h光/12 h暗循环）适应性喂养1周。在干预实验期间，将所有大鼠分为6 组，每组8只，所有组自由饮水和进食，对照组（ND组）饲喂低脂饲料（脂肪质量分数10%），其余组饲喂高脂饲料（脂肪质量分数60%）。ND组与HFD组灌胃2 mL无菌水，阳性对照组（XZK组）灌胃2 mL血脂康（150 mg/kgmb），茯砖茶干预组（FTE组）均灌胃2 mL FTE。每次根据所称每只大鼠体质量调节配制灌胃液所需样品粉剂质量，将样品粉剂溶于2 mL无菌水充分溶解待灌。茯砖茶干预组所有剂量通过换算并参考已有研究[5,12]确定为低剂量（FTL）组75 mg/kgmb、中剂量（FTM）组150 mg/kgmb和高剂量（FTH）组300 mg/kgmb，时长8周。

每天换水与饲料，每周称量体质量2 次，记录饮食量；并在无菌环境下收集粪便，迅速转至－80 ℃保存；灌胃实验结束后禁食不禁水12 h，麻醉，腹腔主动脉取血，脱颈后解剖，将肝脏、肾周脂肪、附睾脂肪称质量，分离出肝脏、结肠，用组织固定液固定，附睾脂肪用脂肪固定液固定，剩余结肠与肝脏放入液氮中，转入－80 ℃保存。

1.3.4 指标测定

1.3.4.1 大鼠基础指标测定

最后一次灌胃前测定大鼠体质量与体长；灌胃期间每周三与周五称体质量和期间饲料食用量，通过2 d内饲料消耗量和体质量增长量来计算食物利用率（式（1））。解剖时，取大鼠肾周脂肪和附睾脂肪分别称质量。Lee’s指数、内脏脂肪系数、肝-体指数分别按公式（2）～（4）计算。

1.3.4.2 生化指标测定

将EP管中血浆静置2 h后，在3 500 r/min、4 ℃条件下离心10 min取上清液待测；剪切冻存的肝脏，与生理盐水按质量比1∶9制成质量分数10%的肝脏匀浆，2 500 r/min离心10 min，取上清液待测。严格按照试剂盒说明书检测血清TG、TC、HDL-C、LDL-C、AST、ALT、TBA、CAT、SOD、MDA、TNF-α、IL-6、LEP、ADPN、CPT-1水平以及肝脏TG、TC水平（结果以蛋白质量计）。血浆致动脉粥样硬化指数（atherogenic index of plasma，AIP）按式（5）计算。

式中：cTG、cHDL-C分别表示血清中TG、HDL-C的浓度/（mmol/L）。

1.3.4.3 肝脏、结肠与附睾组织病理学观察

取每只大鼠相同肝脏、结肠、附睾组织部位，苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色，显微镜拍照观察，每组随机选取6 个附睾组织，于200 倍视野下拍照并计算单位面积内脂肪细胞数目。另对肝脏进行油红染色，每组随机选取6 个油红染色肝脏组织，于200 倍视野下拍照，计算脂滴面积，取平均值；对结肠进行过碘酸席夫（periodic acid Schiff，PAS）染色，显微镜拍照观察。

1.3.4.4 肝脏蛋白免疫荧光染色

将肝脏石蜡切片脱蜡至水，进行抗原修复，画圈血清封闭，加一抗4 ℃孵育过夜，洗涤后加二抗避光室温孵育50 min，进行4’,6-二脒基-2-苯基吲哚复染细胞核，猝灭组织自发荧光，荧光显微镜下观察并采集图像。对每组随机选取10 个400 倍视野拍照，计算平均积分光密度（mean of integrated optical density，MOD）与阳性表达面积平均积分光密度（stained area average optical density，AOD）。

1.3.4.5 肠道微生物16S rDNA基因靶向测序分析

16S rDNA基因靶向测序由天根生化科技（北京）有限公司完成。采用十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）法对样本的基因组DNA进行提取，之后采用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度，取适量的粪便样品于离心管中，使用无菌水稀释样品至1 ng/μL。稀释后的基因组DNA为模板；根据测序区域的选择，使用带Barcode的特异引物。使用高效和高保真的酶进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR），确保扩增效率和准确性；16S rDNA V3～V4扩增引物为正向引物341F（5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’）和反向引物805R（5’-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3’）；根据PCR产物浓度进行等浓度混样，充分混匀后使用质量分数2%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。构建好的文库经过Qubit定量和文库检测，合格后使用Illumina平台进行测序，序列分析通过QIIME软件包进行。

1.4 数据统计与分析

切片以及免疫荧光图像应用CaseViewer软件分析；肝脏切片脂滴面积、附睾脂肪细胞数目、MOD与AOD应用Image-Pro Plus6.0软件计算；通过SPSS 25软件对实验数据进行统计分析，结果以平均值±标准差表示，各组比较应用方差分析（analysis of variance，ANOVA）中的最小显著差异（least significant difference，LSD）检验进行差异显著性分析，P＜0.05为有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 茯砖茶主要成分

表1为本实验所测定的茯砖茶主要成分质量分数，与沈程文等的结果[13]基本一致，符合茯砖茶品质化学特征。

表1 茯砖茶主要成分Table 1 Major constituents of Fuzhuan brick tea

2.2 茯砖茶对大鼠生长体质量和食物利用率的影响

由表2可知，在灌胃FTE的第2周，FTE组体质量相对于HFD组增长速度变缓，所有组体质量在第3周均与HFD组表现出显著差异。在FTE干预第6周时，FTE组和ND组体质量均与HFD组出现高度显著差异（P＜0.001）。第8周结束时，各组大鼠Lee’s指数与HFD组具有显著差异（图1B），且XZK、FTL、FTM和FTH组体质量增加量与HFD组比较分别下降了18.45%、26.95%、30.27%和32.96%（P＜0.05）（图1A），表明FTE在抑制体质量增长方面具有一定剂量依赖性。通过动物体质量与食物利用率能够判断受试动物的生存状态，与HFD组相比，XZK与FTE干预降低了大鼠食物利用率，但各组均在健康大鼠食物利用率的参考值（15%～55%）[14]范围内（图1C）。与HFD组相比，血脂康干预会降低大鼠每日进食量，但FTE干预后大鼠每日进食量不受明显影响（图1D）。以上结果显示，FTE能够在不干扰大鼠正常饮食的情况下抑制大鼠体质量增长。

表2 茯砖茶干预期间大鼠体质量变化Table 2 Changes in body mass during intervention with Fuzhuan brick tea in rats

图1 FTE对大鼠体质量及食物利用率的影响Fig. 1 Effect of FTE on body mass and food utilization in rats

2.3 茯砖茶对大鼠脂肪组织积累的影响

脂肪过度沉积会使机体处于低度炎症状态，分泌促炎性脂肪因子，并且内脏脂肪过多的堆积会对肺动脉、肝肾等器官造成机械压力损伤，直接影响器官的正常功能[15]。与HFD组相比，FTE的干预明显减少了肝脏脂滴面积、附睾脂肪质量以及肾周脂肪质量（图2A～C），增加了附睾脂肪组织单位面积内脂肪细胞数量（图2D、图3），表明FTE干预减少了肝脏脂肪、附睾脂肪以及肾周脂肪的堆积。由图2E、F可知，与HFD组相比，FTE显著降低了肝-体指数与内脏脂肪系数（P＜0.05）。在预防高脂饮食大鼠脂肪积累方面，不同剂量FTE效果均优于阳性对照XZK组，并且具有剂量依赖性。

图2 FTE对大鼠脂肪组织的影响Fig. 2 Effect of FTE on adipose tissue in rats

图3 大鼠附睾组织病理学观察结果（×200）Fig. 3 Effect of FTE on the pathology of epididymal adipose tissue in rats (× 200)

2.4 茯砖茶对大鼠血清、肝脏生化指标的影响

由图4A～F可知，与ND组相比，HFD组大鼠的血清TG、TC、LDL-C浓度及肝脏TG、TC含量显著升高（P＜0.05），血清HDL-C浓度显著降低（P＜0.05），FTE干预能显著抑制因高脂饮食导致的这些指标水平变化，其中FTH组各指标基本恢复到ND组水平。由图4G、H可知，与ND组相比，HFD组大鼠血清AST、ALT活力显著升高（P＜0.05）；XZK与FTE干预均能抑制肝功能酶活力的升高，而且相较于XKZ干预，FTE干预对肝脏AST及ALT活力有更好的抑制效果（P＜0.05）。

有研究指出，身体质量指数超过25 kg/m2后，每增加5 kg/m2，心血管疾病死亡率增加41%[16]。肥胖会提高心血管疾病等慢性疾病患病率，也有研究表明AIP与肥胖导致的非酒精性脂肪肝密切相关[17]。由图4I可知，HFD组AIP接近高风险值（AIP＞0.21），而其他组都小于低风险值（AIP＝0.11）。

图4 FTE对大鼠血清、肝脏生化指标的影响Fig. 4 Effect of FTE on serum lipid profile and liver function in rats

2.5 茯砖茶对大鼠氧化应激水平及炎症因子的影响

如图5A～I所示，与ND组相比，HFD组表现出了较强的氧化应激（通过血清MDA、CAT、SOD、ADPN、CPT-1水平反映）和炎症反应（通过血清IL-6、TNF-α、TBA水平反映），FTE干预不同程度降低了血清MDA、IL-6、LEP、TNF-α、ADPN水平，提高了CAT活力、SOD活力（除FTL组外）和TBA浓度。CPT-1位于线粒体内膜外侧，催化长链脂肪酸进入线粒体基质，其水平是决定脂肪酸β氧化程度的主要因素，其在血清中的质量浓度反映了机体各组织细胞线粒体氧化供能的能力，与HFD组相比，不同剂量FTE均提高了CPT-1的质量浓度。并且，FTM及FTH组均能使以上标记物水平达到或接近ND组水平，特别是与XZK组比较，FTE干预组具有更好的减轻氧化应激和炎症的作用（P＜0.05）。然而，在FTE不同剂量组之间这些指标水平没有全部出现显著差异及剂量依赖性关系。

图5 FTE对大鼠血清氧化应激相关指标及炎症因子水平的影响Fig. 5 Effect of FTE on serum oxidative stress markers and inflammatory factors in rats

2.6 茯砖茶对大鼠肝脏和肠道病理学的影响

由图6A、B可知，ND组肝细胞围绕中央静脉呈放射性排列，几乎无脂滴分布。而HFD组的肝细胞周围形成了大量的脂滴空泡，大量的脂滴挤压细胞核，影响了细胞的结构。不同剂量FTE干预的大鼠肝细胞脂滴分布数量减少，细胞核形态正常。XZK、FTL与FTM组有少量细胞增大，出现少量脂滴空泡，FTH组的细胞结构几乎与ND组无异。

良好的肠道微生物环境与消化作用的前提是保持肠道组织结构和功能的完整性。由图6C、D可知，FTE的干预能明显保护高脂饮食的大鼠结肠组织内部结构。ND组结肠黏膜完整，结构无异常，绒毛正常排列，肌层薄厚适中，杯状细胞及分泌的黏蛋白结构均正常分布。而HFD组出现了明显的炎性细胞浸润，绒毛出现缺失，肌层变薄，整个肠道结构受到破坏。XZK组有少量炎性细胞浸润，绒毛较为整齐，肌层稍薄，杯状细胞及黏蛋白分泌较为丰富，结构尚完整。FTE干预组的肠道结构都未遭到破坏，无炎性细胞浸润，绒毛分布整齐且较长，杯状细胞及黏蛋白分泌非常丰富，对肠道结构具有保护作用。因此，认为茯砖茶对高脂饮食大鼠的肝脏与肠道的结构完整性及功能具有一定的保护作用，为正常的机体代谢与预防肥胖的发生提供了基础保障。

图6 FTE对大鼠肝脏及结肠组织病理的影响Fig. 6 Effect of FTE on the pathology of liver and colon tissues in rats

2.7 茯砖茶对肝脏蛋白表达的影响

为了确定FTE对肝脏BA合成和胆固醇代谢的影响，对BA合成过程中关键限速酶CYP7A1和CYP27A1进行了免疫荧光分析，并对每组10 张随机截取的图片进行MOD与AOD分析（图7）。结果表明，相对于HFD组，中、高剂量FTE都提高了CYP7A1的MOD与AOD，其中FTH高度显著提升了CYP27A1的MOD和AOD（P＜0.001），而XZK组显著提升了CYP7A1的MOD，所以FTH和FTM干预上调了BA合成中限速酶的表达。在ND、FTM和FTH组肝脏切片上均匀出现了CYP7A1荧光分布，其他组的CYP7A1荧光则主要分布在切片边缘位置。ND及FTE干预组的CYP27A1有序分布在细胞核膜周围，FTE使得上述限速酶恢复至正常状态。在40 倍放大条件下观察，HFD组的蛋白荧光较少分布在切片周围，FT干预组则较为均匀分布在切片上。限速酶的分布差异可能是由于肝脏脂质积累开始于肝脏内部，影响了内部细胞BA合成与胆固醇代谢。

图7 大鼠肝脏CYP7A1与CYP27A1免疫荧光染色代表性图像及分析Fig. 7 Representative images and analysis of liver CYP7A1 and CYP27A1 immunofluorescence staining in rats

2.8 茯砖茶对肠道微生物群调控脂质代谢的作用

肠道微生物群与宿主肥胖和代谢有着密切的联系，哺乳动物中的共生微生物群通过相互动态平衡及与疾病的相互作用对宿主免疫系统发育和功能起到重要作用[6,8]。已有探究肠道微生物与脂质代谢之间关系的相关研究[5,9,18-20]，在此基础之上，本实验对大鼠粪便进行了微生物16S rDNA基因靶向测序，在门、属的水平上分析FTE对大鼠肠道微生物结构和功能的影响。

图8 各组大鼠粪便微生物群测序深度（A）及α多样性（B）比较Fig. 8 Comparison of sequencing depth (A) and α diversity (B) of rat fecal microbiota in six groups

16S rDNA基因靶向测序分析结果表明，各组间测序深度无显著差异，基本覆盖了样品中物种信息（图8A）。与HFD组相比，FTE干预对肠道微生物群的Chao1指数、Simpson指数以及Shannon指数有一定的提升作用，但无统计学差异（图8B）（P＞0.05），表明FTE干预对微生物群物种数目及物种多样性虽有一定影响，但主要还是在改变菌群结构方面。

图9 FTE对高脂饮食大鼠肠道微生物群的调节作用Fig. 9 Regulatory effects of FTE on gut microbiota of HFD-fed rats

图10 FTE调控大鼠肠道微生物群组成对肠-肝BA代谢循环的影响Fig. 10 FTE affected the intestinal and hepatic BA metabolism cycle by modulating the composition of gut microbiota in rats

基于门水平和属水平物种丰度进行主成分分析（principal component analysis，PCA）（图9A、图10A）和偏最小二乘法判别分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）（图9B、图10B），结果表明，各组在图中呈分散分布，在FTE干预组中，FTL与FTM组距离最接近，且与ND组距离相比FTH组更近，说明不同饮食结构能明显改变大鼠肠道微生物群结构，且FTH干预对高脂饮食大鼠微生物群结构改变效果最明显。由图9C可知，高脂饮食会提高Firmicutes、Verrucomicrobia的相对丰度，与文献[21-22]的结果相同，并且还会降低Bacteroidetes相对丰度；但XZK和FT干预会不同程度提高Bacteroidetes相对丰度以及降低Firmicutes相对丰度，进而导致了Firmicutes与Bacteroidetes相对丰度比值（F/B）的降低（图9D）。对不同组间门水平进行定量分析后，选择相对丰度较高分类操作单元（operational taxonomic unit，OTU）进一步进行定量比较，发现与HFD组相比，FTH组OTU413275、OTU428632和OTU3265227、OTU33984相对降低，New.ReferenceOTU22、OTU4366843、OTU174337、New.ReferenceOTU47相对丰度增加，FTM组OTU447776和NROTU22相对丰度增加，FTL组OTU4431545和OTU447776相对丰度增加（图9E）。

为了探究大鼠肠道微生物改变对BA代谢的影响，利用Metastats软件对微生物群落进行分析（图10C～E）。FTE干预逆转并明显增加了部分菌属的相对丰度，其中Akkermansia、Bacteroides相对丰度显著增加。胆汁盐水解酶（bile salt hydrolase，BSH）相关微生物的活性与肠道结合胆汁酸（conjugated bile acid，CBA）含量呈负相关，肠道CBA含量的增加会抑制BA回流，从而增加肝脏BA的合成[9]，说明茯砖茶可以通过影响BSH相关微生物的丰度从而干预BA代谢。与HFD组相比，XZK及FTE组BSH相关微生物Lactobacillus绝对丰度出现显著差异（P＜0.05），同时Lactococcus、Streptococcus、Enterococcus绝对丰度出现不同程度下降，另外，其他属Ruminococcus、Blautia、Coprococcus等的相对丰度也有不同程度降低。

对相对丰度较高的OTU和BSH相关微生物与环境因子进行相关性分析（图10E），大鼠肝质量和血清LDL-C、TG、TC、IL-6、LEP、TNF-α水平主要与Firmicutes相对丰度有显著的正相关性，与Bacteroidetes、Verrucomicrobia和部分Firmicutes丰度具有显著负相关性；而血清CPT-I、TBA、CAT和HDL-C水平与上述微生物的相对丰度表现出相反的相关性。结合血清指标可以得出，FTH明显增加了OTU4366843、NROTU22和OTU174337的相对丰度，而明显降低了OTU4397402、OTU3265227、OTU428632和OTU413275的相对丰度，其他被高脂饮食改变的OTU一定程度被FTE逆转（P＞0.05）。因此，认为FTE可能直接或间接通过调控菌群OTU来调节大鼠肠-肝BA代谢，并对大鼠机体抗氧化、脂代谢和BA循环产生影响。

为了研究组间具有显著性差异的功能，通过16S rDNA测序获得的物种构成与KEGG PATHWAY数据库比对，对所有样品微生物群纲水平进行功能注释，推测样本中功能基因的构成（图11）。将FT干预组与HFD组进行了STAMP差异分析，经Welch’st-test检验发现，与HFD组比较，FT干预导致部分功能丰度发生了改变。对FTH组63 个（21 个增加、42 个降低）、FTM组13 个（8 个增加，5 个降低）以及FTL组3 个（3 个降低）功能发生显著改变的功能模块作图。FTE处理主要引起了部分代谢途径的变化，如氨基酸、牛磺酸、鞘脂和脂质代谢等，还改变了一些次生代谢产物的生物合成以及一些机体系统运转与复杂疾病的途径如离子通道、生物转运与合成、糖尿病等。因此，FTE的干预影响了高脂饮食大鼠的肠道菌群功能。

图11 FTE对PICRUST预测的大鼠肠道微生物群落功能的影响Fig. 11 Effect of FTE on microbial community functions in gut of rats predicted by PICRUST

综上，FTE调节肠道微生物群在预防高脂饮食导致的肥胖中起重要作用，并且与宿主肠道代谢功能有着紧密联系，可能影响肠-肝BA循环。BA、短链脂肪酸以及肠道代谢物与微生物相互影响，部分菌群与宿主代谢和肥胖表型之间有着直接或间接的因果关系。FTE中物质成分或经微生物代谢可能在宿主消化系统中改变微生物群生活环境，影响微生物群生物功能，从而调控菌群OTUs丰度来影响宿主代谢功能，进而到达预防肥胖的作用。

3 讨 论

肥胖被广泛认为是能量摄入和消耗代谢之间不平衡导致的。肥胖机制较为复杂，作为一种疾病，常常伴随认知和运动能力衰退[23]、肾脏功能异常引起的高血压[24]、心脏增大与代谢减弱[25]以及哮喘[26]等其他疾病的发生。肥胖的年轻化所带来的健康问题给个人及医疗体系造成了沉重负担。游牧民族饭后饮茶的习惯帮助解决其高热量油腻饮食带来的健康问题，随着生活水平的提高，肥胖发生率呈上升状态。因此，肥胖的预防变得越来越关键，主要措施包括饮食和运动。

部分实验结果表明茯砖茶或所含成分对肥胖及血脂异常具有治疗效果[27-29]。本实验表明大鼠在高脂饮食过程中预防肥胖及脂质异常的作用，FTE显著抑制了其体质量的快速增长（表2、图1），改善了脂质谱（图4），对ADPN及炎症因子水平具有降低作用（图5）。肥胖的发生会导致LEP水平增加，而LEP水平增加会导致中枢瘦素敏感性降低和瘦素受体抵抗作用增加[30]，FTE显著缓解了机体高LEP水平（图5）。FTE干预能降低肝功能指标水平，保护肝脏细胞结构，并提升血清中CPT-1水平，促进肝脏及其他部位对脂肪酸的利用，为肝脏综合代谢功能提高保障，显示出茯砖茶在预防肥胖方面具有积极作用（图5）。持续高脂肪饮食通过破坏肠黏膜、增加机体内脏脂肪组织含量，尤其是肠系膜脂肪增生，持续分泌促炎细胞因子，导致炎症细胞浸润破坏肠道屏障，从而影响肠道功能[31]。茯砖茶被报道对炎症性肠病具有保护和治疗作用[4,32]，本研究得出相似结果，FTE预防了高脂饮食导致的肠道炎症的发生，并通过促进杯状细胞黏蛋白的释放来保护肠道屏障与功能（图6）。

FTE干预改变了肠道微生物群结构和功能，显著提升了Akkermansia、Bacteroides和Lachnospiraceae等菌属的丰度，显著降低Firmicutes的丰度，并降低了F/B比值（图8～10）。有研究发现超重、肥胖与肠道Akkermansia、Bacteroides相对丰度存在负相关关系[33-34]，一项临床试验表明补充Akkermansia、Muciniphila能改善胰岛素血症和血浆TC水平，并有改善体质量、肝功能和炎症作用[35]。选择性进食有益于肠道功能和微生物群落的食品能改善肝脏脂质沉积和全身性炎症，如绿茶提取物和异麦芽寡糖组合降低了F/B比值，恢复肝脏脂质代谢[22]。所以，茯砖茶是预防肥胖具有前景的辅助功能性食品。

BA代谢循环是机体调节胆固醇的关键机制（图12）。人体主要产生胆酸（cholic acid，CA）和鹅去氧胆酸（chenodeoxy-cholic acid，CDCA），而啮齿动物体内的CDCA会转化为鼠胆酸。通过胆管分泌进入肠道的CBA经过微生物作用生成非结合BA（unbound bile acid，UBA），未分解的CBA在回肠远端被顶端钠依赖性胆汁酸转运体（apicalsodium dependent bile acid transporte，ASBT）重新吸收，通过门静脉由牛磺胆酸钠协同转运多肽（sodium taurocholate cotransport peptide，NCTP）回收至肝脏[8]。一般性乳酸杆菌和梭状芽孢杆菌相对丰度的降低，与BSH活性及牛磺酸-β-鼠胆酸在肠道的积累下降有关[36]。BA的微生物代谢与微生物结构具有相互作用[8]，微生物代谢可形成疏水性BA池，促进BA的清除。FTE下调了BSH相关微生物的绝对丰度，对BSH分解CBA形成UBA具有一定抑制作用。而普洱茶中的茶褐素对BSH相关微生物具有抑制作用，并且在回肠远端积累CBA抑制了肠道FXR-成纤维细胞生长因子15（fibroblast growth factor 15，fgf15）信号传导，从而减少了肝脏成纤维细胞生长因子受体4（fibroblast growth factor receptor 4，fgfr4）的表达，下调对BA合成过程的抑制作用，同时促进了BA的排泄[9]。表明FTE可能同样能够通过改变微生物结构增加粪便总BA的排泄，增强BA循环中的合成过程来维持BA平衡。普洱茶对肝脏BA合成基因、氧化甾醇7α-羟化酶（oxysterol 7α-hydroxylase，CYP7B1）、CYP27A1和CYP7A1均具有上调作用，对甾醇12α-羟化酶（sterol 12alpha-hydroxylase，CYP8B1）无显著影响[9]，而肠道微生物群也能调节几种酶的表达，包括CYP7A1、CYP7B1和CYP27A1[37]。本实验中，FTE干预提高了CYP7A1和CYP27A1的表达量，逆转了高脂饮食造成的限速酶分布差异，BA合成代谢加强，可能使CA与CDCA合成增加，血清TBA浓度提高（图5、7）。而CDCA对BA合成经典途径中的CYP7A1和CYP8B1有轻微抑制作用，导致CDCA合成的进一步增加，促进肝脏FXR通路[9]。增加BA合成与清除的正向循环，加强了机体BA循环对胆固醇的清除，缓解了胆固醇的堆积。而肝脏FXR的表达可增强肝脏脂质代谢及其他代谢通路[38-39]，防止肝脏脂肪变性和甘油三酯水平升高[18]。

图12 FTE预防肥胖及高胆固醇血症作用相关机制Fig. 12 Related mechanism of FTE in preventing obesity and hypercholesterolemia

4 结 论

FTE抑制了大鼠高脂饮食状态下的体质量快速增长，降低了全身性脂质积累、内脏脂肪系数以及AIP，对机体抗氧化反应与炎症作用具有积极作用。组织病理结果表明FTE能明显保护肝脏细胞结构和功能以及肠道结构。FTE干预调节了高脂饮食导致的微生物群落结构与功能的改变，对BSH相关微生物具有一定的抑制作用。另外，FTE改变了高脂饮食引起的肝脏BA生成过程中主要限速酶CYP7A1和CYP27A1的分布变化，且促进了其表达。相对于XZK降脂药物，同剂量下的FTE在预防高脂膳食大鼠体质量增长、脂质积累与消耗以及BA代谢方面更具优势。这些结果初步表明了FTE在预防肥胖和高胆固醇血症方面具有积极作用。但是，茯砖茶中的多种成分具有相似功能活性，样品中茶色素与多酚类、黄酮类化合物通过以上机制预防作用过程中是拮抗还是协同作用尚不得知。肝脏FXR是代谢机制的中心，茯砖茶如何深入调控肠道肝脏FXR及其通路代谢还有待进一步研究。