乳酸和过氧乙酸对大肠杆菌O157:H7生物膜的抑制作用及其机制

吴丽娜，刘昀阁，张一敏,2，毛衍伟，梁荣蓉，杨啸吟，罗 欣,2,3，董鹏程,*，朱立贤,*

（1.山东农业大学食品科学与工程学院，山东 泰安 271018；2.国家牛肉加工技术研发专业中心，山东 泰安 271018；3.江苏省肉类生产与加工质量安全控制协同创新中心，江苏 南京 210095）

大肠杆菌O157:H7作为一种食源性致病菌可引起人类感染性腹泻、出血性结肠炎和溶血性尿毒综合征等疾病，严重时可导致死亡[1]。大肠杆菌O157:H7对食品的污染是导致与上述疾病爆发的主要原因，肉、乳制品以及其他食品等都可以作为大肠杆菌O157:H7的载体[2-3]。大肠杆菌O157:H7之所以在食品工业中难以清除，主要归因于其具有生物膜形成能力，可在加工器械表面附着[4]。生物膜是指微生物为了适应环境，通过分泌大量的多糖、蛋白质和核酸等胞外聚合物（extracellular polymeric substance，EPS），将菌体自身包裹在立体结构中而形成的菌体聚集膜样物。生物膜是菌体在自然界中一种常见的生存状态，直接影响着食品安全和人体健康等各个方面[5]。据报道，细菌生物膜可以在各种材料的表面形成，例如陶瓷、玻璃、木材、不锈钢和塑料[2,6]。如果没有经过适当的清洁处理，微生物可以在食物接触表面上定植并持续存活。生物膜被认为是食品加工中交叉污染的主要风险因素之一，且相比于浮游菌，生物膜的形成使大肠杆菌O157:H7对外界不良环境具有更强的耐受性[4]。这一特性使对大肠杆菌O157:H7生物膜的有效控制成为了食品加工安全防控的一大难题。

有机酸作为一种天然的有机化合物对食源性病原体具有显著的抑制作用。其中，乳酸（lactic acid, LA）被美国食品药品监督管理局（Food Drug Administration，FDA）指定为一种被公认安全（generally recognized as safe，GRAS）的消毒剂，已在肉牛屠宰加工中应用[7]。而过氧乙酸（peroxyacetic acid，PAA）作为一种环境友好型的消毒剂，可以被分解为过氧化氢和乙酸，也常被用于微生物的控制[8]。现有研究表明，有机酸主要通过破坏细菌的蛋白质、酶和其他代谢产物，以及破坏细胞通透性来发挥抑菌作用[9-10]。然而，目前关于LA和PAA对大肠杆菌O157:H7生物膜的抑制作用研究较少，且LA和PAA对于大肠杆菌O157:H7生物膜的抑制机理尚不完全明确。本课题组前期研究发现肉牛屠宰工厂来源的大肠杆菌O157:H7具有生物膜形成能力[11]，本研究在此基础上选取一株成膜能力较强的大肠杆菌O157:H7野生菌株为研究对象，探究LA和PAA对其生物膜的抑制作用。并从代谢活性、EPS含量、微观结构和基因相对表达等方面探究LA和PAA对大肠杆菌O157:H7生物膜的抑制机理，从而为食品实际生产加工过程中大肠杆菌O157:H7的有效控制提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 菌株、材料与试剂

实验所使用的菌株为分离自我国肉牛屠宰企业中的大肠杆菌O157:H7野生菌株，携带毒力基因stx2、eaeA、hlyA[12]，现保藏于山东农业大学食品科学与工程学院畜产品加工实验室。

苯酚、氯化钠、无水葡萄糖、无水乙醇 国药集团化学试剂有限公司；胰蛋白胨大豆琼脂、胰蛋白胨大豆肉汤（tryptic soy broth，TSB）培养基 北京陆桥技术股份有限公司；PAA 北京西亚公司；细胞培养板美国康宁公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量试剂盒 北京康为世纪生物科技有限公司；细胞计数试剂盒（cell counting kit-8，CCK-8）试剂盒、磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）（pH 7.2、0.01 mol/L） 北京索莱宝科技有限公司；LA上海阿拉丁生化科技股份有限公司；LIVE/DEAD染料美国赛默飞世尔科技有限公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）、TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit、SYBR®Premix ExTaqTM（Tli RNaseH Plus） 大连宝生物工程有限公司。

1.2 仪器与设备

1300 SERIES A2生物安全柜 美国赛默飞世尔科技有限公司；DHP系列智能型生化培养箱 上海一恒科学仪器有限公司；PTC-200实时荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪（配CFX 96检测系统）美国Bio-Rad公司；SpectraMax M5微孔板检测系统美国Molecular Devices公司；GeneQuant 100微量核酸蛋白测定仪 英国Biochrom公司；5804R离心机德国Eppendorf公司；SU8020场发射扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM） 日本HITACHI公司；LSM880激光共聚焦显微镜（confocal laser scanning microscope，CLSM） 德国Carl Zeiss公司。

1.3 方法

1.3.1 菌种活化

菌种冻存（－80 ℃）于25%（体积分数）甘油中，实验前取20 μL接种于20 mL新鲜的TSB培养液中进行活化，37 ℃培养18 h进行活化，经2 次活化后的菌液备用。

1.3.2 大肠杆菌O157:H7生物膜中活菌数的测定

在96 孔板中分别加入180 μL TSB培养基并接种20 μL活化后的菌液，菌体终浓度为1h106CFU/mL，于37 ℃培养1、2、3、4、5、6、7 d后，弃去孔内培养液，用0.85%（质量分数，下同）NaCl溶液冲洗3 次，以除去孔内未黏附的浮游菌。用无菌刮刀将附着在96 孔板的生物膜刮下，重悬于200 μL 0.85% NaCl溶液中，用移液枪反复吸打混匀，取100 μL重悬后的菌液梯度稀释，采用胰蛋白胨大豆琼脂平板法测定生物膜中活菌数[13]，以评估大肠杆菌O157:H7生物膜形成能力。

1.3.3 LA和PAA对大肠杆菌O157:H7最小抑菌剂量的测定

配制含体积分数8% LA或0.32% PAA的TSB培养基，后在96 孔板中进行连续2 倍稀释，使LA的终体积分数分别为4%、2%、1%、0.5%、0.25%、0.125%、0.062 5%、0.031 25%，PAA的终体积分数分别为0.16%、0.08%、0.04%、0.02%、0.01%、0.005%、0.002 5%、0.001 25%。在96 孔板中分别加入180 μL含不同剂量的LA或PAA的TSB培养基，接种20 μL活化后的菌液，菌体终浓度为1h106CFU/mL。其中，不同剂量的LA或PAA培养基制备方法如下：同时以只含有200 μL TSB培养基作为空白对照。96 孔板在37 ℃下孵育24 h后，用酶标仪测定OD600nm。与空白对照组OD600nm无显著差异的最小剂量确定为LA或PAA对大肠杆菌O157:H7的最小抑菌剂量（minimum inhibitory concentrations，MIC）[2]。

1.3.4 LA和PAA对大肠杆菌O157:H7生物膜抑制作用的分析

在96 孔板中分别加入20 μL活化后的菌液，然后加入180 μL含不同剂量LA或PAA的TSB培养基，菌体终浓度为1h106CFU/mL，LA或PAA终剂量分别为0（对照组）、1/4 MIC、1/2 MIC、MIC、2 MIC，于37 ℃下培养4 d，弃去孔内培养液，用0.85% NaCl溶液冲洗3 次，以除去孔内未黏附的浮游菌。用无菌刮刀将附着在96 孔板的生物膜刮下，重新悬浮于200 μL 0.85% NaCl溶液中，然后参考1.3.2节方法进行梯度稀释，采用胰蛋白胨大豆琼脂平板法进行菌落计数测定生物膜中活菌数，评估LA和PAA对大肠杆菌O157:H7生物膜的抑制作用[13]。

1.3.5 大肠杆菌O157:H7生物膜中细胞代谢活性的测定

96 孔板中每孔加入180 μL含不同剂量LA或PAA的TSB培养基，接种20 μL活化的菌液（菌体终浓度为1h106CFU/mL），培养基中LA或PAA的终剂量分别为0（对照组）、1/4 MIC、1/2 MIC、MIC、2 MIC，于37 ℃下培养4 d，取出96 孔板，将孔中的浮游菌吸出，用无菌PBS冲洗3 次，每孔加入100 μL PBS和10 μL CCK-8试剂，37 ℃避光培养4 h，在450 nm波长处测其吸光度A，按下式计算抑制率[14]。

1.3.6 大肠杆菌O157:H7生物膜胞外聚合物质量浓度的测定

24 孔板中每孔加入1 800 μL含不同剂量LA或PAA的TSB培养基并接种200 μL活化后的菌液（菌体终浓度为1h106CFU/mL），培养基中LA或PAA终剂量为MIC，以等体积不含LA和PAA的TSB培养基为对照组，37 ℃下培养至4 d，取出24 孔板，将孔中的浮游菌吸出，用无菌PBS冲洗3 次，重新悬浮于1 mL无菌PBS中，用移液枪反复吸打混匀后取1 mL生物膜样品加入0.4 mL 1 mol/L NaOH，150 r/min、4 ℃振荡3 h，加入0.6 mL 0.85% NaCl溶液，6 000hg、4 ℃离心20 min，上清液经0.45 μm滤膜过滤待测。用苯酚-硫酸法测定胞外多糖质量浓度[14-15]，参考BCA蛋白定量试剂盒说明书测定蛋白质量浓度[15]。

1.3.7 大肠杆菌O157:H7生物膜相关基因表达的测定

24 孔板中每孔加入1 800 μL含不同剂量LA或PAA的TSB培养基并接种200 μL活化后的菌液（菌体终浓度为1h106CFU/mL），培养基中LA或PAA终剂量为MIC，以等体积不含LA和PAA的TSB培养基为对照组，37 ℃下在细胞培养板中培养至4 d，使用RNA提取试剂盒，按照试剂盒说明书进行生物膜和浮游菌的RNA的提取。然后分别用离心管收集每个细胞培养皿中的浮游细菌。细胞培养皿用无菌PBS洗涤3 次。使用RNAiso Plus试剂盒从生物膜和浮游细菌中分离总RNA，然后将每个RNA样品用重组DNase I处理。使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）试剂盒对DNase处理的RNA进行逆转录。稀释cDNA后，将2 µL cDNA用作实时荧光定量PCR的模板，参照实时荧光定量PCR试剂盒SYBR®Premix ExTaq™（Tli RNaseH Plus）说明书进行测定，实时荧光定量PCR的基因和引物序列见表1，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司设计并合成。

表1 实时荧光定量PCR基因及引物序列Table 1 Primer sequences used for real-time PCR

1.3.8 大肠杆菌O157:H7生物膜微观结构观察

SEM观察：将菌液接种于48 孔板中，在TSB培养基和BE中分别加入不同含量的LA和PAA，使得LA和PAA终剂量为0、1/4 MIC、1/2 MIC、MIC，37 ℃下将无菌聚苯乙烯圆片放进孔中培养至4 d，PBS洗涤后将圆片用2.5%（体积分数）戊二醛溶液固定，在4 ℃固定12 h后晾干，使用1%（体积分数）的锇酸溶液固定90 min，然后依次用体积分数为30%、50%、80%、90%、100%的乙醇梯度脱水，每次10 min，最后使用100%叔丁醇洗涤。将处理后的圆片喷金用于SEM观察，放大倍数为5 000[6]。

CLSM观察：将活化的菌悬液接种于细胞培养板中，在TSB培养基中分别加入不同含量的LA和PAA，使得LA和PAA终剂量分别为0、1/4 MIC、1/2 MIC、MIC，37 ℃培养4 d后，将浮游菌去除后用PBS冲洗掉多余的浮游菌，风干后使用LIVE/DEAD染料对生物膜进行染色，试剂盒中含有的探针SYTO-9与碘化丙啶能分别使活、死细胞在CLSM下呈现绿色、红色荧光，使用染色液时按照1 mL PBS溶液中分别加入试剂盒中两种染液各3 μL的比例配制，染液现配现用并避光保存。在风干的细胞培养板中每孔加入的500 μL荧光染料，避光染色30 min，吸除染液后使用PBS溶液洗去多余探针，风干在细胞培养板表面滴加无菌水，加盖玻片，于－20 ℃避光保存。生物膜样品使用CLSM（配63×油浸物镜与488 nm氩激光器成像），在480～500 nm发射波长范围收集SYTO-9荧光和490～635 nm发射波长范围收集碘化丙啶荧光。3D投影使用ZEN Blue Lite 2_3软件的z-stacks简易3D功能重建[16]。

1.4 数据处理与分析

实验数据设置3 个平行，实验结果以平均值±标准差表示。采用SAS 9.0软件的混合模型对LA和PAA生物膜抑制作用以及生物膜代谢活性进行统计分析，采用SPSS软件对生物膜活菌数、生物膜多糖蛋白含量以及基因相对表达量进行单因素分析，通过t检验进行显著性分析，P＜0.05表示差异显著。采用Bio-Rad CFX Manager软件对荧光定量基因表达部分数据进行相对定量处理及分析，采用2−ΔΔCt法评估目标基因的相对表达量变化。采用Sigma Plot 12.5软件作图。

2 结果与分析

2.1 不同培养时间大肠杆菌O157:H7生物膜中的活菌数

使用平板计数法对大肠杆菌O157:H7在聚苯乙烯表面的生物膜形成能力进行了分析，由图1可知，随着时间的延长，生物膜呈现出一种逐渐增高而后稳定的趋势，大肠杆菌O157:H7在培养4 d后生物膜中活菌数变化不显著（P＞0.05），说明此时大肠杆菌O157:H7达到成熟状态。因此后续实验LA和PAA处理大肠杆菌O157:H7生物膜的时间为4 d。

图1 大肠杆菌O157:H7生物膜中活菌数Fig. 1 Viable cell count in E. coli O157:H7 biofilm as a function of culture time

2.2 LA和PAA对大肠杆菌O157:H7生物膜的抑制作用

比较不同剂量LA和PAA处理组与空白对照组的OD600nm可知，LA和PAA对大肠杆菌O157:H7生长的MIC分别为0.25%和0.002 5%。根据MIC设置亚MIC，分析LA和PAA对大肠杆菌O157:H7生物膜的抑制作用。由表2可知，随着剂量的增加，LA和PAA对大肠杆菌O157:H7生物膜的抑制效果显著增强。在2 MIC时，LA和PAA处理下均未检出生物膜中大肠杆菌O157:H7。在MIC时，相对于对照组，LA和PAA均显著抑制了大肠杆菌O157:H7生物膜形成（P＜0.05）。

表2 LA和PAA对大肠杆菌O157:H7生物膜形成的抑制作用Table 2 Inhibitory effects of LA and PAA on E. coli O157:H7 biofilm formation

2.3 LA和PAA对大肠杆菌O157:H7生物膜代谢活性的影响

本研究使用CCK-8试剂盒对大肠杆菌O157:H7生物膜代谢活性进行测定，CCK-8溶液在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯的作用下被细胞中的脱氢酶还原成具有高度水溶性的黄色甲瓒产物，其颜色的深度与细胞的活力成正比。由图2可知，随着LA和PAA剂量的增加，大肠杆菌O157:H7生物膜代谢活性的抑制率也随之增强。2 MIC的LA及PAA对大肠杆菌O157:H7生物膜代谢活性的抑制率超过90%，且LA及PAA对代谢活性的抑制率之间无显著差异（P＞0.05）。LA和PAA剂量为MIC时，大肠杆菌O157:H7生物膜的代谢活性分别降低了84.25%和43.49%，其中LA抑制作用显著优于PAA（P＜0.05）。

图2 LA和PAA对大肠杆菌O157:H7生物膜代谢活性的抑制率Fig. 2 Percentage inhibition of LA and PAA on the metabolic activity of E. coli O157:H7 biofilm

2.4 LA和PAA对大肠杆菌O157:H7生物膜胞外聚合物的影响

图3 LA和PAA对大肠杆菌O157:H7生物膜EPS质量浓度的影响Fig. 3 Effects of LA and PAA on the contents of extracellular polymeric substances in E. coli O157:H7 biofilm

培养至第4天，大肠杆菌O157:H7生物膜EPS中胞外多糖和蛋白质量浓度的测定结果如图3所示。对照组大肠杆菌O157:H7生物膜中多糖质量浓度为9.86 μg/mL，蛋白质量浓度为87.78 μg/mL，各组生物膜中胞外蛋白质量浓度明显高于胞外多糖的质量浓度。MIC的LA和PAA处理使大肠杆菌O157:H7的胞外多糖和胞外蛋白形成均显著降低（P＜0.05）。在生物膜形成过程中，细菌会产生EPS，以减小抗生素、消毒剂等不利环境的影响，且胞外多糖和胞外蛋白是EPS的主要组成成分[5]。本研究结果表明，与对照组相比，MIC LA使大肠杆菌O157:H7生物膜的胞外蛋白质量浓度减少了88.34%，抑制效果显著优于PAA（P＜0.05）。

2.5 LA和PAA对大肠杆菌O157:H7生物膜微观结构的影响

对照组和不同剂量LA和PAA处理下大肠杆菌O157:H7生物膜的SEM和CLSM图像结果如图4所示。由SEM结果可知，未添加有机酸的对照组中细菌数量较多、菌体排列紧密且菌体结构完整。而用MIC、1/2 MIC、1/4 MIC的LA和PAA处理后，大肠杆菌O157:H7生物膜中细菌排列分散、数量明显减少。且LA和PAA的剂量越高对生物膜中细菌数量的抑制作用越明显，即MIC的LA和PAA抑制效果最好，并且可以观察到在该剂量下两种有机酸对大肠杆菌O157:H7的细菌形态存在破坏作用。该结果与生物膜中活菌数的测定结果相一致，在MIC下，LA和PAA均能有效的抑制大肠杆菌O157:H7生物膜的形成。相似的，有学者研究了大肠杆菌O157:H7在LA处理下的生物膜形成，孵育5 d后，对照组形成了成熟的生物膜结构且细菌细胞大量积累，而处理组中生物膜数量少，且较为分散[6]。

由CLSM图像可以看出，在对照组中细菌数量较多并形成了聚集的立体结构，且主要呈现绿色荧光，即生物膜中活菌居多。与SEM结果类似，加入抑制剂处理后，大肠杆菌O157:H7生物膜中的细菌生长较为分散，且呈现不同程度的红色荧光，死菌数量变多。观察经1/4 MIC、1/2 MIC、MIC的LA和PAA处理后的CLSM图像，发现随着LA和PAA剂量的增加，大肠杆菌O157:H7生物膜中的活菌数逐渐减少，其中MIC的LA和PAA抑制效果最佳。有学者用CLSM观察大肠杆菌O157:H7生物膜的3D结构，同样发现在对照组中大肠杆菌O157:H7呈现一个聚集的空间结构。而用苹果酸处理后，大多数细菌以单个细胞的形式存在[17]。综合SEM和CLSM对大肠杆菌O157:H7生物膜微观结构的观察结果，可知MIC的LA和PAA可有效抑制大肠杆菌O157:H7生物膜形成。

图4 大肠杆菌O157:H7生物膜对照组及抑制组的SEM和CLSM图Fig. 4 Scanning electron microscope and confocal laser scanning microscope images of E. coli O157:H7 biofilm in the control and inhibition groups

2.6 LA和PAA对大肠杆菌O157:H7生物膜相关基因表达的影响

LA和PAA在MIC下对大肠杆菌O157:H7生物膜基因相对表达量的影响结果如图5所示。LA和PAA均可显著抑制大肠杆菌O157:H7生物膜中的群体感应基因luxS和sdiA、黏附基因csgA和flhC、胞外多糖合成基因csrA、adrB和adrA、应激因子rpoS以及PhoP/PhoQ和EnvZ/OmpR双组分调控系统中phoQ、phoP、envZ、ompR的表达（P＜0.05）。但LA和PAA对大肠杆菌O157:H7生物膜基因相对表达量的影响也存在差异。LA显著抑制了全局调控基因csgD的表达，而PAA对csgD的表达没有显著作用。PAA显著抑制了应激因子iraM的表达，而LA则未见抑制作用。

图5 LA和PAA对大肠杆菌O157:H7生物膜基因表达的影响Fig. 5 Effects of LA and PAA on gene expression in E. coli O157:H7 biofilm

3 讨 论

有机酸通常被认为是一种安全、稳定的化合物。未解离的有机酸具有亲脂性，可以通过自由扩散穿过细菌细胞膜到达细胞内部，有机酸在细胞内解离，降低胞内pH值，改变细胞的内环境，从而影响细菌的正常生命活动，从而起到抑菌作用[18-19]。考虑到大多数有机酸的弱酸性质，pH值环境是有机酸抑菌效果的主要影响因素，因为pH值会影响弱酸的电离平衡，从而决定未离解酸的浓度[20]。PAA由过氧化氢与乙酸反应形成，是一种过氧化物类消毒剂，具有使用范围广、效率高、毒性小等特点，在食品工业中应用广泛[21-22]。PAA具有强氧化性，可以氧化细菌生命活动所需的关键酶、氨基酸和核酸等，并使DNA双链被打开并发生裂解，从而达到抑菌的效果。LA和PAA对大肠杆菌O157:H7生物膜的有显著的抑制作用，但不同浓度LA和PAA对其抑制效果不一致。有研究评估了乙酸、柠檬酸和LA处理对大肠杆菌O157:H7生物膜的抑制效果，其中2%（体积分数）LA的生物膜抑制率为39.13%，与柠檬酸相比，LA和乙酸对大肠杆菌生物膜形成的抑制作用更强[23]。在生物膜形成过程中，微生物会产生EPS，EPS限制了消毒剂向生物膜中的扩散，消毒剂和生物膜成分之间可能存在相互作用[24]。因此，生物膜中微生物缓慢生长的状态增加了其对消毒剂的抗性。本研究发现LA和PAA可以通过抑制大肠杆菌O157:H7 EPS的形成抑制生物膜产生，且LA对胞外蛋白的抑制效果优于PAA。相似的，Amrutha等[23]评估了乙酸、柠檬酸和LA处理对大肠杆菌O157:H7生物膜形成能力的影响，结果表明LA处理使大肠杆菌O157:H7生物膜中EPS含量减少了13.42%，而柠檬酸和乙酸处理分别仅减少了6.25%和10.89%，LA抑制EPS产生的效果要优于柠檬酸和乙酸。与本研究中SEM和CLSM结果一致，MIC的LA及PAA处理后，大肠杆菌O157:H7生物膜中细菌数量明显减少，且大多呈现黄色甚至是红色荧光，生物膜结构遭到破坏。综上所述，LA和PAA抑制了大肠杆菌O157:H7生物膜中的多糖和蛋白的产生，使得EPS对细菌的保护作用减弱，LA及PAA更容易进入到生物膜内部，从而导致生物膜中菌体数量减少。

生物膜的形成受到很多因素的影响，形成过程是菌体多种特性共同作用的结果，其形成的相互作用机制一直都是研究的重点，尤其是基因水平的影响。本实验从可能影响大肠杆菌O157:H7生物膜的特性入手，通过对群体感应基因（luxS、sdiA）、黏附基因（csgA、flhC）、全局调控基因（csgD）、应激响应因子（rpoS、iraM）、多糖合成相关基因（csrA、adrB、adrA）、PhoP/PhoQ和EnvZ/OmpR双组分调控系统相关基因（phoQ、phoP、envZ、ompR）的分析，研究LA和PAA对这些调控基因在大肠杆菌O157:H7生物膜形成中的抑制规律，为进一步阐明其抑制机制提供参考。本研究发现，LA和PAA处理后黏附相关基因受到显著抑制，进而抑制生物膜形成。在Hidalgo等[25]的研究中，蔓越莓提取物的加入能够有效减小Escherichia coliCFT073的泳动能力，并且根据荧光定量PCR结果显示鞭毛蛋白合成基因表达量下降，判定蔓越莓提取物可以通过抑制鞭毛的合成从而达到降低细菌泳动能力的作用进而抑制生物膜形成。Cong Yanguang等[26]的研究中也曾提到鞭毛合成相关基因的缺失能够降低Citrobacter freundii细菌群体泳动能力，阻碍细菌在物体表面的移动。因此，抑菌剂对细菌附着过程成中黏附相关基因的抑制是其抑制生物膜形成的关键。此外，本研究发现，LA和PAA均显著的抑制了群体感应基因（luxS、sdiA）的表达。有报道表明群体感应效应与细菌生物膜的形成、毒力侵袭特性和应激响应等生理特性密切相关[27]。因此，LA和PAA在MIC下抑制大肠杆菌O157:H7的群体感应相关基因的表达同样是其有效抑制生物膜形成的关键原因。除上述机制外，LA和PAA均显著抑制了多糖合成相关基因csrA、adrB和adrA的表达，这一结果解释了图3中MIC下LA和PAA对大肠杆菌O157:H7胞外多糖的显著抑制作用。胞外多糖和蛋白是生物膜EPS的重要组成部分[24]，因此LA和PAA可通过抑制大肠杆菌O157:H7胞外多糖和蛋白的产生来抑制其生物膜形成。此外，有研究发现在禽致病性大肠杆菌中，phoP在禽致病性大肠杆菌生物膜形成中起着重要的调节作用，phoP的缺失减少了生物膜的形成[28]。本研究结果表明，LA和PAA均显著抑制了PhoP/PhoQ双组分调控的表达，但LA及PAA对phoP、phoQ基因表达无显著差异。RpoS应激蛋白通过转录因子CsgD控制生物膜的形成和对环境胁迫的响应，研究表明缺乏rpoS的大肠杆菌细胞无法形成正常的生物膜[29]。本研究发现，LA及PAA均可以抑制rpoS的相对表达量。不同抑菌剂对细菌的抑制机制存在差异[30-31]，在本研究中，部分基因（csgD、iraM）在LA或PAA的作用下表达量没有显著降低，这表明LA和PAA处理对大肠杆菌O157:H7生物膜的抑制机制存在一定差异，有待进一步研究。

4 结 论

LA及PAA在MIC下均可以通过抑制大肠杆菌O157:H7生物膜代谢活性和胞外蛋白和多糖的合成有效抑制大肠杆菌O157:H7生物膜的形成。且通过分析成膜关键基因表达量进一步发现，LA和PAA在MIC下均有效抑制了大肠杆菌O157:H7的黏附相关基因、群体感应相关基因、多糖合成相关基因以及双组分调控系统。但同时发现LA和PAA对大肠杆菌O157:H7生物膜的抑制机制尚存在一定差异。因此，应进一步探究LA和PAA对基因作用的靶点，从而寻找特异性干预或检测靶点以减少大肠杆菌O157:H7生物膜产生的风险。在大肠杆菌O157:H7生物膜生长过程中，菌株所处的环境以及生长状态也会影响大肠杆菌O157:H7生物膜的形成机制。生物膜的形成和黏附在不同环境中可能是通过不同的机制完成的。这些菌株可能利用不同的策略，并根据可利用的培养条件不同使抑制剂针对生物膜形成的不同路径起作用，而这些内容还有待于进一步研究。