乳酸芽孢杆菌发酵液护色的山药多糖对葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠结肠炎的改善作用及机制

张慧莹，曾丽萍，任运红，杜 冰,2，黎 攀,2,*

（1.华南农业大学食品学院，广东 广州 510642；2.岭南现代农业科学与技术广东省实验室，广东 广州 510642）

山药（Dioscorea oppositifoliaL.），又名薯蓣、土薯、淮山等，是我国传统的药食同源植物，味甘性平，入肺、脾、肾经，常用于治疗脾虚食少，泄泻久痢等。现代研究表明，山药含有多糖、皂苷、糖蛋白、尿囊素等多种生物活性成分[1]，其中山药多糖是公认的主要活性成分之一，它具有调节机体免疫、抗肿瘤、抗衰老、调节血糖、保护肝脏等药理功能[2-4]。杨恺环[5]将不同浓度的山药多糖溶液作用于结肠癌细胞HT-29，发现山药多糖对结肠癌细胞HT-29呈现出浓度依赖性和时间依赖性的抗增殖作用，证实了山药多糖的体外抗结肠癌活性。本课题组前期也从山药中分离出一种水溶性多糖CYP-1，发现其能显著抑制结肠炎小鼠炎症相关基因的mRNA表达水平和促炎细胞因子的分泌，并能显著调节结肠炎小鼠的肠道菌群，从而改善结肠炎，证实了山药多糖的体内抗结肠炎活性[6]。

山药极易发生褐变，护色处理是山药加工过程的必要步骤。目前加工山药时常用的护色处理是硫磺熏蒸，硫磺熏蒸不仅能抑制酶促褐变，还能抑制非酶褐变。尽管采用硫磺熏蒸能取得优良的护色效果，但极可能引发残硫量超标的问题，这不仅会影响产品品质，甚至会引起食品安全问题[7-8]。乳酸芽孢杆菌DU-106是一种新型益生菌，具有高产左旋乳酸的能力[9]。本课题组前期研究表明，利用乳酸芽孢杆菌DU-106发酵液对山药进行浸泡处理也能达到优良的护色效果[8]。然而，不同的护色处理可能会影响山药多糖的活性[10]，采用乳酸芽孢杆菌DU-106发酵液对山药进行护色这一新工艺会是否会影响其多糖的抗结肠炎活性目前仍不清楚。葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium salt，DSS）能造成小鼠结肠上皮损伤、内毒素入血、结肠水肿和过度炎症，与临床溃疡性结肠炎病症类似，是最常见用于构建结肠炎症模型的物质[11]。本研究以DSS为诱导剂构建小鼠急性结肠炎模型，评估乳酸芽孢杆菌DU-106发酵液护色山药多糖的抗结肠炎活性并研究其机制，为山药加工处理及含山药多糖功能食品的开发研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

SPF级雄性C57BL/6J小鼠（14～16 g，动物使用许可证号：SYXK（粤）2018-0137） 广东质量监督检察院。

饲料（标号：2019-05073） 广东医学实验动物中心；乳酸芽孢杆菌DU-106（筛选自传统发酵奶酪）华南农业大学新资源食品与功能性原料评价及研究中心；山药（由华南农业大学食品学院杜冰教授鉴定，保藏于华南农业大学新资源食品与功能性原料评价及研究中心，保藏编号：2018-Du728） 广州五山市场。

葡聚糖硫酸钠 美国MP公司；粪便隐血试剂盒、苏木素-伊红（hematoxylin-eosin，HE） 上海源叶生物科技有限公司；乙醇 天津富宇精细化工有限公司；二甲苯 广州化学试剂厂；肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）酶联免疫吸附试剂盒 深圳欣博盛生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

HistoStar组织包埋机、HM340E石蜡切片机、Gemini AS自动染片机、CTM 6自动封片机 赛默飞世尔科技（中国）有限公司；Lab.A1光学生物显微镜 德国卡尔·蔡司股份公司；DHP-600电热恒温培养箱 北京市永光明医疗仪器厂；FA2004A分析天平 上海精天电子仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 山药处理及多糖提取

挑选大小一致、无创伤、无病虫斑的山药块茎，用清水洗净、切成2 mm左右厚的薄片，参考本课题组前期开发的护色方法[8]，将山药分别浸泡于清水和体积分数10%的乳酸芽孢杆菌DU-106发酵液中护色处理1 h，再置于70 ℃烘箱中烘干，得干山药片。采用水提醇沉法[8]提取干山药片中的粗多糖，粗多糖中清水护色的山药多糖质量分数为79.63%，乳酸芽孢杆菌DU-106发酵液护色的山药多糖质量分数为79.50%。

1.3.2 构建DSS诱导的小鼠急性结肠炎模型

动物实验严格按照华南农业大学实验动物中心管理制度执行。40只雄性C57BL/6J小鼠在实验环境（（20f4）℃、12 h的光照/黑暗循环交替）中适应性喂养一周后，随机抽取10只为对照组，剩余30只为模型组。所有实验小鼠给予充足的饲料，对照组小鼠自由饮用蒸馏水，模型组小鼠自由饮用质量分数3% DSS溶液，蒸馏水及溶液每2 d更换一次，连续7 d。每天对小鼠称质量，并在第7天（造模后）参考张金玲等[12]的方法对小鼠进行疾病活动指数（disease activity index，DAI）测定，DAI由小鼠体质量变化程度、小鼠粪便性状及粪便隐血评分3 项组成，其中粪便隐血评分由粪便隐血试剂盒测定，具体方法参照试剂盒说明书。

1.3.3 干预结肠炎小鼠及样本采集

造模成功的小鼠随机分为3 组：自然恢复组（DSS）、清水护色多糖组（CYH）、发酵液护色多糖组（CYF），每组10只，分别灌胃0.2 mL的蒸馏水、0.2 mL 300 mg/kgmb清水护色的山药多糖溶液、0.2 mL 300 mg/kgmb乳酸芽孢杆菌DU-106发酵液护色的山药多糖溶液，剂量设置参考课题组前期研究[6]；对照组（CD）灌胃蒸馏水0.2 mL，连续7 d，期间自由饮用蒸馏水和食用饲料。每天灌胃前称量小鼠体质量，观察小鼠大便特征等，在第7天对小鼠进行眼球取血、离心，吸取上层的血清，－80 ℃保存、备用；小鼠腹部消毒后，取出完整结肠组织，用预冷（4 ℃）的生理盐水冲洗2～3 遍，滤纸吸干水分后对结肠组织进行称质量和长度测量。取距离肛门2 cm处的结肠组织6～10 mm放入体积分数10%中性福尔马林溶液中，用于结肠组织病理学分析；冲洗出的结肠内容物置于－80 ℃保存，用于结肠内容物菌群分析。

1.3.4 小鼠血清促炎因子TNF-α水平的测定

用酶联免疫吸附试验试剂盒测定小鼠血清中的促炎因子TNF-α水平。

1.3.5 小鼠结肠组织病理学分析

参考景亚萍[13]的方法制作病理切片，采用HE染色法对切片进行染色，采用树胶封存，在显微镜下观察结肠组织病理学变化并参考Dieleman等[14]的方法进行组织学损伤病理评分。

1.3.6 小鼠结肠内容物菌群分析

采用十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）法提取4 组小鼠结肠内容物的基因组DNA，利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度和浓度，检测合格后进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增。选择扩增16S rRNA基因的V4区域，并对PCR产物进行混样和纯化，构建文库后委托北京诺禾致源生物信息科技有限公司利用Ion S5TMXL测序平台进行高通量测序。使用Cutadapt软件过滤并按barcode拆分样本后，采用多种方法对样品数据进行挖掘和分析，分析小鼠肠道菌群结构及多样性。

1.4 数据统计与分析

利用Excel 2020和GraphPad Prism 8软件作图，采用SPSS 17.0软件对数据进行单因素方差分析，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 不同处理后小鼠体质量和DAI变化

结肠炎可能导致小鼠饮食下降、皮毛松耸、活动减少，进而影响小鼠的体质量和DAI，在不处死小鼠的情况下，小鼠体质量和DAI的变化可以作为客观指标反映造模期间小鼠的结肠炎病变程度[15]。如图1A、B所示，以DSS为诱导剂喂养的模型组小鼠体质量增长明显受到了抑制，DAI极显著增加（P＜0.01），说明小鼠急性结肠炎模型构建成功，可以进行后续实验。对建模成功的结肠炎小鼠给予山药多糖干预，结果如图1C、D所示，DSS组小鼠体质量极显著低于CD组（P＜0.01），DAI极显著高于CD组（P＜0.01），说明DSS诱导的结肠炎能明显使小鼠消瘦，影响小鼠健康状态；经山药多糖干预后，CYH、CYF组与DSS组小鼠体质量无显著差异（P＞0.05），CYH组小鼠的DAI显著低于DSS组（P＜0.05），CYF组小鼠的DAI极显著低于DSS组（P＜0.01），且CYH和CYF两组小鼠DAI没有显著差异，说明发酵液护色的山药多糖与清水护色的山药多糖效果一致，乳酸芽孢杆菌发酵液护色的山药多糖也有利于提升小鼠一般状况，在一定程度上缓解结肠炎，但仍不能恢复至小鼠正常体质量。这可能是因为小鼠在结肠炎缓解过程中需要消耗大量的能量用于免疫细胞的增殖，恢复体质量仍需一段时间。

图1 不同处理后小鼠体质量和DAI的变化Fig. 1 Changes in body mass and DAI of mice

2.2 山药多糖对小鼠促炎因子分泌的影响

促炎因子的过度产生是结肠炎患者的典型特征，其中TNF-α是结肠炎病理进程中的关键细胞因子，会通过表达黏附分子、成纤维增殖因子、凝血因子以及启动细胞毒性、凋亡和急性期反应等途径加剧炎症。由图2可知，DSS组小鼠血清中的促炎因子TNF-α水平极显著高于CD组（P＜0.01），经山药多糖干预后，CYH组和CYF组小鼠血清中的促炎因子TNF-α水平均极显著低于DSS组（P＜0.01），且两组之间无显著差异（P＞0.05）。说明乳酸芽孢杆菌发酵液护色后的山药多糖也能调节促炎因子TNF-α的分泌，从而改善DSS诱导的结肠炎，且效果与清水护色的山药多糖相当。

图2 山药多糖对小鼠促炎因子TNF-α分泌的影响Fig. 2 Effect of Chinese yam polysaccharides on the secretion of inflammatory factor TNF-α in mice

2.3 山药多糖对结肠炎小鼠结肠的影响

2.3.1 山药多糖对结肠炎小鼠结肠长度和质量的影响

结肠炎可能会使得小鼠的结肠萎缩[16]，结肠质量和长度降低是结肠炎小鼠结肠萎缩的典型特征[17]。从图3可知，DSS组小鼠的结肠质量、长度均极显著低于CD组小鼠（P＜0.01），说明DSS组结肠炎小鼠结肠显著萎缩。然而，CYH、CYF组小鼠结肠质量、长度均显著高于DSS组小鼠（P＜0.05），且CYH和CYF两组小鼠结肠质量、长度没有显著差异，这说明乳酸芽孢杆菌发酵液护色后的山药多糖也能改善DSS诱导的结肠萎缩，从而改善DSS诱导的小鼠结肠炎，且效果与清水护色的山药多糖相当。

图3 山药多糖对结肠炎小鼠结肠质量（A）和长度（B）的影响Fig. 3 Effect of Chinese yam polysaccharides on colon mass (A) and length (B) in mice

2.3.2 山药多糖对结肠炎小鼠结肠组织的影响

结肠组织充血、水肿、溃疡和坏死等病变是结肠炎的典型特征。由图4可知，CD组小鼠结肠黏膜光滑完整，上皮细胞整齐，能看到清晰的隐窝结构；DSS组小鼠结肠隐窝基本被破坏，炎症细胞广泛浸润，病变位置深达肌层；CYH组和CYF组小鼠结肠中均能观察到完整的黏膜下层结构，病变范围也明显减少。通过进一步切片分析，发现CYH组和CYF组间的病理评分无显著差异（P＞0.05），但均显著低于DSS组（P＜0.05），这说明乳酸芽孢杆菌发酵液护色后的山药多糖干预也可明显缓解急性结肠炎小鼠的炎症程度，减轻结肠炎小鼠的组织学损伤。该结果与上述的DAI、结肠长度和质量的结果保持一致。

图4 小鼠结肠切片的HE染色图和病理评分Fig. 4 Hematoxylin-eosin staining and histopathological scores of colon tissue in mice

2.4 山药多糖对小鼠肠道菌群的影响

2.4.1α多样性分析

由图5A可知，小鼠肠道菌群的稀释曲线随测序数目增加趋于平坦，说明测序数据量合理，测序结果可以反映样本中绝大多数的微生物信息[18]，箱型图（图5B）也验证了该结论。由图5C可知，在垂直方向上，4 组曲线均前端平滑程度较好，末端有部分曲折，说明物种分布较为均匀；在水平方向上，CYH组的曲线在横轴上的跨度最大，其次为CD组、CYF组，DSS组最小，说明DSS处理降低了小鼠肠道菌群丰富度，两种山药多糖处理均能提高结肠炎小鼠的肠道菌群丰富度。肠道菌群丰富度降低是结肠炎患者的常见特征[19]。有研究表明，DSS处理会使肠道菌群的多样性降低，改善DSS诱导的肠道菌群多样性下降是缓解结肠炎的方法之一[20]，这提示乳酸芽孢杆菌发酵液护色后的山药多糖干预也有助于提高结肠炎小鼠肠道菌群多样性，从而改善小鼠结肠炎。

Venn图可用于统计多个样本中共有及独有的操作分类单元（operational taxonomic unit，OTU），能够相对直观地反映样本中物种的组成相似性及重叠情况。由图5D可知，4 组样品共有的OTU个数为469 个，分别占各组OTU数目的60.20%～77.27%，重叠度较高，说明4 组小鼠肠道菌群种类具有较高的相似性。DSS组与CD组共有521 个OTU，CYH组与CD组共有590 个OTU，CYF组与CD组共有546 个OTU，说明CYH组和CYF组小鼠的肠道菌群组成相比于DSS组与CD组更为相似，这提示乳酸芽孢杆菌发酵液护色的山药多糖可能也可以调节DSS诱导的肠道菌群失调，使结肠炎小鼠肠道菌群组成接近正常小鼠。

图5 小鼠肠道菌群多样性分析Fig. 5 Diversity analysis of intestinal flora in mice

2.4.2 物种组成分析

肠道菌群失调被认为可能是结肠炎的发病机制之一[21-22]，使肠道菌群正常化是治疗结肠炎的可能途径[23-24]。由图6A可知，在门水平上，4 组小鼠肠道微生物的OTU主要由10 个门构成：拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）、疣微菌门（Verrucomicrobia）、放线菌门（Actinobacteria）、脱铁杆菌门（Deferribacteres）、软壁菌门（Tenericutes）、蓝细菌门（Cyanobacteria）、黑水仙菌门（Melainabacteria）及一个未定义菌门。其中拟杆菌门（Bacteroidetes）和厚壁菌门（Firmicutes）占绝对优势。厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidetes）丰度比值（F/B值）升高是肠道菌群失调的一个典型特征。由图6B可知，DSS组小鼠的F/B值极显著高于CD组（P＜0.01），说明经DSS诱导后，小鼠肠道菌群显著失调；经多糖干预后，CYH组和CYF组小鼠的F/B值均显著下降（P＜0.05、P＜0.01），说明经乳酸芽孢杆菌发酵液护色后的山药多糖也有利于恢复DSS诱导的急性结肠炎小鼠的肠道菌群失调。

由图6C可知，在属水平上，4 组小鼠肠道微生物OTU主要由30 个属构成，比较CD组和DSS组在属水平上物种丰度的差异发现，经过DSS诱导可降低以下益生菌的相对丰度：Lactobacillus、Blautia、Muribaculum、unidentified_Ruminococcaceae、Dubosiella、Akkermansia、Candidatus_Saccharimonas、Roseburia、Bifidobacterium、Enterorhabdus、Odoribacter、Ruminiclostridium；显著增加以下有害菌的相对丰度：Bilophila、Parabacteroides、Alistipes、unidentified_Lachnospiraceae、Bacteroides、Parasutterella、Erysipelatoclostridium、unidentified_Enterobacteriaceae、Lachnoclostridium、unidentified_Erysipelotrichaceae、Faecalibaculum、Helicobacter、Oscillibacter、Anaerotruncus、Desulfovibrio。经山药多糖干预后，部分在DSS组中相对丰度显著降低的属会有所回升，其中在CYH组和CYF组中相对丰度均有所回升的属有：Muribaculum、unidentified_Ruminococcaceae、Dubosiella、Roseburia、Bifidobacterium、Enterorhabdus、Odoribacter、Ruminiclostridium，仅在CYF组中相对丰度有所回升的属有：Lactobacillus、Candidatus_Saccharimonas，Gao Ruichang等[25]在研究鲟鱼水解物对DSS诱导的结肠炎小鼠的影响中也观察到了类似变化。

乳酸杆菌属（Lactobacillales）和罗斯氏菌属（Roseburia）是与调节机体免疫相关的菌属[26-27]，DSS组小鼠肠道菌群中，这两种菌的相对丰度均低于CD组，而通过山药多糖干预的CYH组和CYF组Roseburia的相对丰度均有所提高，CYF组的Lactobacillales相对丰度也相应提高；拟杆菌属（Bacteroides）和另枝菌属（Alistipes）是常见的致病菌，它们与结肠炎的发生和恶化密切相关[28-29]，DSS组小鼠肠道菌群中，这两种菌的相对丰度均高于CD组，而通过山药多糖干预的CYH组和CYF组，Alistipes相对丰度有所降低，其中CYF组降低程度更大，CYF组的Bacteroides相对丰度也相应降低。这说明经乳酸芽孢杆菌发酵液护色后的山药多糖也能通过提高有益菌的相对丰度、降低有害菌的相对丰度，调节DSS诱导的肠道菌群紊乱，使结肠炎小鼠肠道菌群相对丰度与正常小鼠更为相似，从而达到改善小鼠结肠炎的目的。

图6 小鼠肠道菌群物种组成分析Fig. 6 Analysis of species composition of intestinal flora in mice

图6D是属水平丰度聚类热图，该图更加直观地反映了各组小鼠肠道菌群相对丰度的差异，其结果与相对丰度柱形图相似。CD组和DSS组小鼠肠道菌群相对丰度明显不同，CYF组与CD组则较为相似，再次验证了经乳酸芽孢杆菌发酵液护色后的山药多糖能够调节DSS诱导的小鼠肠道菌群失调，从而改善小鼠结肠炎。

2.4.3β多样性分析

β多样性分析是对不同样品或不同组间样品的微生物群落构成的比较分析。主坐标分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）和非加权组平均法（unweighted pairgroup method with arithmetic means，UPGMA）聚类分析是常见的β多样性分析方法之一。在PCoA图中，DSS组与CD组相距较远，说明DSS诱导的结肠炎小鼠肠道微生物群落构成与CD组明显不同，CYH组、CYF组与DSS组相距较远，而与CD组相距较近（图7A），说明与清水护色的山药多糖效果一致，乳酸芽孢杆菌发酵液护色后的山药多糖干预也能恢复由DSS诱导的肠道微生物组成变化；在UPGMA聚类树图中，CD组先与CYF组聚为一类，再与CYH组聚为一类，最后与DSS组聚为一类（图7B），说明经乳酸芽孢杆菌发酵液护色后的山药多糖干预后的结肠炎小鼠肠道菌群群落构成与正常小鼠最为相似，该结果不仅再次验证了乳酸芽孢杆菌发酵液护色后的山药多糖干预能恢复由DSS诱导的肠道微生物组成变化，还提示乳酸芽孢杆菌发酵液护色后的山药多糖对于调节由DSS诱导的小鼠肠道菌群紊乱可能效果更佳。

图7 基于非加权Unifrac距离的PCoA分析（A）和UPGMA聚类分析（B）Fig. 7 Principal co-ordinates analysis (PCoA) (A) and unweighted pair-group method with arithmetic means (UPGMA) cluster analysis (B)based on unweighted Unifrac distance

3 结 论

本研究从发酵液护色处理的山药中提取了粗多糖，研究了该粗多糖的抗结肠炎活性及机制。主要实验结论如下：1）乳酸芽孢杆菌DU-106发酵液护色的山药多糖也能显著降低结肠炎小鼠的DAI、结肠质量、结肠长度和结肠组织学损伤病理评分（P＜0.05），且与清水护色处理的山药多糖无显著差异；2）乳酸芽孢杆菌DU-106发酵液护色的山药多糖也能显著降低小鼠促炎因子TNF-α的分泌水平，且与清水护色处理的山药多糖效果相当；3）乳酸芽孢杆菌DU-106发酵液护色的山药多糖也能通过提高结肠炎小鼠肠道菌群多样性和有益菌的相对丰度，降低有害菌的相对丰度以及厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidetes）的丰度比值，调节由DSS诱导的肠道菌群失调。在小鼠肠道菌群物种组成聚类分析中，CYF组与CD组肠道菌群结构更为接近。综上，乳酸芽孢杆菌DU-106发酵液护色处理后的山药多糖也能改善DSS诱导的小鼠结肠炎，其作用机制可能与调节促炎因子的分泌及调节肠道菌群有关。该结果可为山药的加工以及含山药多糖功能食品的开发研究提供理论依据。