两种泽兰酸性多糖的结构和生物活性

张武霞，胡懿化，何嘉琦，王星滟，赵晋忠，李 鹏

（山西农业大学基础部，中兽医药现代化山西省重点实验室，山西 太谷 030801）

植物中丰富的活性多糖具有绿色天然、毒性低等独特的优势，因此被广泛应用于食品和医药领域[1]。例如，枸杞多糖能够促进双歧杆菌和乳杆菌的增殖，改善肠道健康[2]。五味子多糖能够增强机体免疫力，上调血清中硒水平和白细胞介素（interleukin，IL）-2的表达，直接或间接地抑制肿瘤细胞生长[3]。大枣多糖通过促进淋巴细胞增殖和淋巴细胞因子分泌提高机体免疫功能[4]。柴胡多糖能够降低炎症因子水平和巨噬细胞氧化应激的产生，从而有效地抑制巨噬细胞衰老和炎症衰老[5]。杜仲多糖可以通过增加机体的抗氧化因子活性，减少氧化应激对胰腺的损伤，从而改善胰腺组织的损伤[6]。研究发现多糖主要通过激活T、B淋巴细胞、巨噬细胞、补体和促进肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、IL-6等细胞因子的生成来发挥免疫作用[7-8]。

泽兰是多年生双子叶草本植物，其茎叶经过炮制后可入药，具有活血化瘀、行水消肿、改善血液循环和补养气血的功效，现今已被纳入保健食品原料（卫法监发[2002]51号文件）[9-10]。泽兰中含有寡糖水苏糖和α-低聚半乳糖混合物（alpha-galacto-oligosaccharides，GOS），水苏糖能够通过双歧杆菌的选择性增殖来平衡肠道微生态系统，GOS可显著提高体液免疫，并增强脾淋巴细胞增殖[11]。目前对泽兰中的多糖研究停留在粗多糖层面。因此本研究从泽兰中分离酸性纯多糖，利用高效凝胶渗透色谱（high performance gel permeation chromatography，HPGPC）、化学比色法，高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）以及红外光谱对其分子质量、单糖组成等进行分析，并通过化学和免疫学方法对这两种泽兰多糖的体外抗氧化活性和细胞免疫调节活性进行初步评价，以期为泽兰多糖的生物活性研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、动物与试剂

泽兰购买于安徽北铭药业有限公司。

C57BL/6小鼠购买于山西医科大学，动物生产许可证号：SCXK（晋）2020-0003，动物使用许可证号：SYXK（晋）2019-0001；RAW264.7细胞由西北农林科技大学段金友教授实验室提供，最初购买于上海中国科学院细胞库。

甘露糖（mannose，Man）、半乳糖醛酸（galacturonic acid，GalA）、鼠李糖（rhamnose，Rha）、阿拉伯糖（arabinose，Ara）、葡萄糖（glucose，Glc）、半乳糖（galactose，Gal）、岩藻糖（fucose，Fuc）、木糖（xylose，Xyl）、噻唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、伴刀豆球蛋白（concanavalin A，ConA）和脂多糖（lipopolysaccharide，LPS） 北京索莱宝公司；三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）和1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，PMP）美国Sigma-Aldrich公司；小鼠TNF-α酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒美国Novus公司；核因子-κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）激活-核转运试剂盒 上海碧云天公司。其他试剂药品均为分析纯级别。

1.2 仪器与设备

UV-1800型紫外分光光度计 上海精科仪器厂；1260型液相色谱仪 美国安捷伦公司； TCS SP8型激光扫描共聚焦显微镜 德国Leica公司；DNM-9602型酶标分析仪 北京普朗新技术有限公司；TENSOR 27傅里叶变换红外光谱仪 德国Bruker公司；515 HPGPC仪 美国Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 泽兰多糖的提取、分离及其纯化

将干燥的泽兰粉碎后，用体积分数为95%的乙醇溶液，80 ℃加热回流2 h脱脂，蒸馏水80 ℃浸提2 h（固液比1∶10），重复操作3 次，收集合并滤液，进行浓缩。浓缩后，向其中加入4 倍体积的95%（体积分数）乙醇溶液，在低温条件下沉淀24 h，使多糖完全沉淀后抽滤，收集多糖沉淀，蒸馏水溶解后透析（截留分子质量为1 000 Da）。透析后冻干获得泽兰粗多糖（记为LHP）。LHP分别用2 L蒸馏水和不同浓度的NaCl溶液（0.1、0.2、0.5 mol/L）进行梯度洗脱，经DEAE-52纤维柱（5 cmh50 cm，OH－型）分离纯化，上样量为15 mL，流速为0.5 mL/min，并用硫酸-苯酚法[12]检测多糖含量，根据多糖含量分别收集0.1 mol/L NaCl和0.5 mol/L NaCl洗脱组分，再用蒸馏水以0.2 mL/min流速洗脱，经SephadexG-100凝胶过滤柱层析分离纯化后得到两种纯多糖，分别命名为LHPS1和LHPS5。

1.3.2 泽兰多糖分子质量和化学组分的测定

1.3.2.1 分子质量的测定

多糖LHPS1和LHPS5的分子质量通过HPGPC测定[13]。7 种葡聚糖（5.2、11.6、23.8、48.6、148、273、410 kDa）为标准品（纯度≥99%）。色谱条件：515 HPGPC仪（配备2414示差检测器）；3 根分子排阻色谱柱（Ultrahydrogel 250（7.8 mmh30 cm，6 μm）、Ultrahydrogel 1000（7.8 mmh30 cm，12 µm）和Ultrahydrogel 2000（7.8 mmh30 cm，12 µm））串联；洗脱液为3 mmol/L乙酸钠溶液，流速为0.5 mL/min，进样量为100 μL。根据洗脱峰的保留时间和对应葡聚糖分子质量得到的线性回归方程，如式（1）所示。

式中：m为分子质量；t为保留时间/min。

1.3.2.2 化学组分的测定

分别用硫酸-苯酚法[12]、考马斯亮蓝法[14]和间羟基联苯比色法[15]测定LHPS1和LHPS5的中性糖、蛋白质和糖醛酸的含量。

1.3.2.3 单糖组成的测定

利用柱前PMP衍生法，通过HPLC分析LHPS1和LHPS5的单糖组成[16]。将TFA加入多糖LHPS1或LHPS5溶液中振荡混匀，110 ℃反应4 h，彻底水解为单糖，冷却后旋蒸除去TFA，蒸馏水溶解得到多糖水解液。将50 μL多糖水解液或标准品溶液与等体积0.6 mol/L的氢氧化钠溶液充分混合后，加入100 μL 0.5 mol/L的PMP-甲醇溶液混匀，70 ℃反应100 min进行衍生化。盐酸中和后，用氯仿多次萃取除去未反应的PMP，制备好的样品溶液经0.22 μm滤膜过滤后进行HPLC分析。以等物质的量的Man、Rha、GalA、Glc、Gal、Xyl、Ara和Fuc作为单糖标准品（纯度≥99%）通过同样方法衍生化并进行HPLC测定。HPLC色谱条件：C18色谱柱（250 mmh4.6 mm，5 mm），柱温20 ℃，流动相A：15%乙腈＋85%磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）；流动相B：40%乙腈＋60% PBS；PBS为pH 6.7、0.05 mol/L磷酸二氢钾缓冲液，紫外检测波长为254 nm。各单糖的物质的量比参考文献[17]计算。

1.3.3 红外光谱分析

分别称取2 mg冷冻干燥的LHPS1或LHPS5与KBr粉末混合研磨，压片，用红外光谱仪在4 000～400 cm－1波数范围内进行扫描[18]。

1.3.4 泽兰多糖体外抗氧化活性的测定

将LHPS1和LHPS5配成质量浓度分别为0.5、1、2、4、8 mg/mL的样品溶液，参照文献[19]测定LHPS1和LHPS5的总还原能力和DPPH自由基清除能力，评估两种泽兰酸性多糖的体外抗氧化活性。样品总还原能力以700 nm波长处的吸光度A700nm表征，DPPH自由基清除能力以DPPH自由基清除率表征。

1.3.5 泽兰多糖细胞免疫调节活性的测定

1.3.5.1 小鼠脾淋巴细胞增殖活性的测定

MTT法体外评估泽兰多糖对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响[20]。利用颈椎脱臼法处死小鼠，无菌取出脾脏置于100 目的筛网上，用5 mL注射器芯缓慢研磨，用0.01 mol/L PBS（pH 7.4）洗涤2 次后，加入红细胞裂解液裂解，1 000 r/min离心5 min，弃去上清液后，用1640培养基洗涤2 次，将获得的脾淋巴单细胞培养于1640培养基。终质量浓度分别为50、100、200 μg/mL的LHPS1或LHPS5作用小鼠脾淋巴细胞（1h107个/mL，90 µL/孔），以等体积的PBS为空白对照，以ConA（终质量浓度5 μg/mL）和LPS（终质量浓度2.5 μg/mL）为两个阳性对照，孵育48 h后加入10 μL MTT（5 mg/mL），继续培养4 h，在600 nm波长处测定光密度值OD600nm以表征小鼠脾淋巴细胞增殖活性。

1.3.5.2 RAW264.7细胞吞噬能力和TNF-α质量浓度的测定

采用中性红法测定RAW264.7细胞的吞噬能力[21]。将RAW264.7细胞（1h105个/mL）接种于96 孔板（90 μL/孔），分别加入10 μL LHPS1或LHPS5（终质量浓度分别为50、100、200 μg/mL）孵育24 h，再加入0.07%中性红溶液孵育2 h。弃去培养液，PBS洗涤2 次。加入裂解缓冲液（1%（质量分数）冰醋酸-乙醇（等体积混合），100 μL/孔），在540 nm波长处测定OD值。分别以等体积PBS和LPS（2.5 μg/mL）作为空白对照和阳性对照。按式（2）计算吞噬指数。

式中：A加药组为加入不同质量浓度泽兰多糖或LPS溶液孵育24 h后测得的吸光度；A空白对照为加入PBS孵育24 h后测得的吸光度。

用LHPS1或LHPS5（终质量浓度分别为50、100、200 μg/mL）处理RAW264.7细胞24 h，以等体积的PBS为空白对照，LPS（终质量浓度2.5 μg/mL）为阳性对照。收集上清液，根据ELISA试剂盒的操作说明测定细胞上清液中的TNF-α的质量浓度。

1.3.5.3 甘露糖抑制剂处理

将RAW264.7细胞（5h105个/mL）接种到96 孔板（80 μL/孔）中。设置无Man预处理组和Man预处理组，LPS作为阳性对照。无Man预处理组先各加10 μL PBS作用1 h后，再分别加入10 μL PBS（空白对照）、LPS（25 μg/mL）、LHPS1（2 000 μg/mL）、LHPS5（2 000 μg/mL）；Man预处理组：提前加入10 μL Man（5 000 μg/mL）作用1 h后，再分别加入10 μL的PBS（空白对照）、LPS（25 μg/mL）、LHPS1（2 000 μg/mL）、LHPS5（2 000 μg/mL）。37 ℃孵育24 h后，使用ELISA试剂盒检测培养上清液中TNF-α的质量浓度。

1.3.5.4 NF-κB激活-核转运检测

用NF-κB激活-核转运试剂盒检测LHPS1和LHPS5是否能够激活RAW264.7中的NF-κB核转录因子。分别用200 μg/mL LHPS1、LHPS5和2.5 μg/mL的LPS处理RAW264.7细胞3 h，吸除培养液，洗涤和固定，用封闭缓冲液孵育细胞1 h。加入一抗NF-κB p65亚基孵育1 h后，加入异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）标记的山羊抗兔抗体G（H＋L）孵育1 h。4’,6-二氨基-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）处理5 min后，用激光共聚焦显微镜观察呈蓝色荧光的细胞核和呈绿色荧光的NF-κB p65亚基。

1.4 数据统计与分析

结果以平均值±标准偏差表示。用GraphPad Prism 5软件对数据进行处理。采用单因素方差分析对数据进行统计学分析，采用t检验进行显著性分析，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著，P＜0.001表示差异高度显著。

2 结果与分析

2.1 泽兰多糖的组成

2.1.1 分子质量和化学组成

LHPS1和LHPS5的HPGPC分析结果如图1所示，样品LHPS1和LHPS5分别在37.988 min和39.067 min出现较窄的吸收峰，说明这两种多糖纯度比较高。根据公式（1）计算得LHPS1和LHPS5的分子质量分别为1.13h105Da和7.40h104Da。

图1 LHPS1（A）和LHPS5（B）的HPGPC图Fig. 1 High performance gel permeation chromatograms of LHPS1 (A)and LHPS5 (B)

LHPS1和LHPS5的化学组成如表1所示，LHPS1主要成分是中性糖（（91.55f0.22）%），还含有（11.47f0.23）%糖醛酸。LHPS5主要含有中性糖、蛋白质和糖醛酸，质量分数分别是（28.38f0.14）%、（51.60f2.05）%和（12.43f0.33）%。两种多糖中均含有一定量的糖醛酸，这说明LHPS1和LHPS5均是酸性多糖。

表1 泽兰多糖分子质量及组分质量分数Table 1 Molecular masses and compositions of polysaccharides from Lycopi Herba

2.1.2 单糖组成

为了确定单糖的组成，用TFA水解LHPS1或LHPS5，用PMP进一步对水解产物进行柱前衍生化后，HPLC分析结果如图2所示，LHPS1和LHPS5具有相似的单糖组成，都主要含有Man、Rha、GalA、Glc、Gal和Ara，但比例不同，LHPS1中Man、Rha、GalA、Glc、Gal和Ara物质的量比为13.05∶6.08∶1.83∶7.79∶55.32∶15.93，LHPS5中为17.65∶10.81∶12.52∶10.43∶25.54∶9.15。

图2 单糖标准品（A）、LHPS1（B）和LHPS5（C）的HPLC图Fig. 2 High performance liquid chromatograms of a mixture of monosaccharide standards (A), LHPS1 (B) and LHPS5 (C)

2.2 泽兰多糖红外光谱分析结果

如图3所示，LHPS1和LHPS5分别在3 391.33 cm－1和3 299.7 cm－1处出现较宽的吸收峰，这说明它们结构中均含有羟基官能团。在1 640 cm－1附近有C＝O伸缩振动产生的吸收峰，说明LHPS1和LHPS5的结构中含有糖醛酸。此外，LHPS5在1 640 cm－1附近的透光率比LHPS1的大，结合表1结果分析可知，LHPS5在1 640 cm－1附近的峰还可能是蛋白质结构中酰胺键的伸缩振动引起的。在1 401 cm－1附近的吸收峰是由CüH的可变角振动引起的。在950～1 200 cm－1处的吸收峰是由CüOüC和CüO的伸缩振动引起的[22]。

图3 LHPS1（A）和LHPS5（B）的红外光谱图Fig. 3 Infrared spectra of LHPS1 (A) and LHPS5 (B)

2.3 泽兰多糖的体外抗氧化活性

通过体外补充抗氧化成分可以减轻氧化损伤和延缓衰老[23]。因此，从植物中研究筛选出抗氧化活性成分对于保护人类健康具有重要意义[24]。通过测定LHPS1和LHPS5的总还原能力和DPPH自由基清除率评估其抗氧化活性。结果表明LHPS1和LHPS5具有良好的体外抗氧化活性（图4）。样品总还原能力（A700nm）与样品呈剂量依赖关系，这说明样品溶液的还原能力随质量浓度的升高而增强，LHPS5的总还原能力强于LHPS1（图4A）。LHPS1和LHPS5 DPPH自由基清除能力（以DPPH自由基清除率表征）也随样品质量浓度的升高而增强。样品质量浓度达到8 mg/mL时，LHPS1和LHPS5的DPPH自由基清除率达到最高，分别是54%和65%。此外，LHPS5 DPPH自由基清除能力也强于LHPS1（图4B）。这些结果说明LHPS1和LHPS5具有成为抗氧化补充剂的潜能。

图4 泽兰多糖抗氧化活性评估Fig. 4 Assessment of antioxidant activity of polysaccharides from Lycopi Herba

2.4 泽兰多糖的细胞免疫调节活性

2.4.1 泽兰多糖对小鼠脾淋巴细胞增殖活性的影响

脾淋巴细胞增殖活性是评估多糖免疫活性的重要指标[25]。如图5所示，LHPS1和LHPS5能够明显促进脾淋巴细胞的增殖。LHPS1的促增殖能力呈剂量依赖增强，质量浓度为200 μg/mL时，LHPS1的促增殖能力最强。LHPS5在质量浓度为100 μg/mL和50 μg/mL时表现出最强的促增殖能力。

图5 LHPS1和LHPS5对脾淋巴细胞增殖的影响Fig. 5 Effects of LHPS1 and LHPS5 on splenocyte proliferation

2.4.2 泽兰多糖对RAW264.7细胞吞噬能力和TNF-α质量浓度的影响

先前研究表明在炎症反应过程中最早产生的炎症细胞因子TNF-α能够激活淋巴细胞和中性粒细胞，同时能够调节免疫反应并促进其他细胞因子的产生[26]。如图6A所示，LHPS1和LHPS5能显著增强RAW264.7细胞的吞噬能力。LHPS1和LHPS5显著促进了RAW264.7细胞中TNF-α的产生，其中LHPS5的促进作用强于LHPS1（图6B）。研究表明TNF-α表达失调和许多疾病有关，如阿尔茨海默症、抑郁症、银屑病等[27-28]，因此，能够促进TNF-α产生的LHPS1和LHPS5可能对这些疾病具有预防和治疗作用。

图6 LHPS1和LHPS5对RAW264.7细胞吞噬能力（A）和TNF-α分泌水平（B）的影响Fig. 6 Effects of LHPS1 and LHPS5 on the phagocytosis index (A) and TNF-α production (B) of RAW264.7 cells

2.4.3 甘露糖对泽兰多糖激活RAW264.7免疫应答的影响

为了验证Man受体（Man receptor，MR）是否参与LHPS1和LHPS5对RAW264.7细胞的激活作用，本实验采用MR的抑制剂Man预处理RAW264.7细胞。如图7所示，LHPS1和LHPS5（200 μg/mL）刺激Man预处理的RAW264.7细胞后，培养液中TNF-α质量浓度降低。这说明MR可能是RAW264.7细胞中LHPS1和LHPS5激活巨噬细胞的受体之一。单糖组成分析结果显示两种泽兰多糖含有一定比例的Man，因此其可以和细胞表面的MR结合从而激活RAW264.7细胞分泌TNF-α。

图7 Man对泽兰多糖刺激RAW264.7细胞分泌TNF-α的影响Fig. 7 Effect of mannose on TNF-α production in RAW264.7 cells stimulated by polysaccharides from Lycopi Herba

2.4.4 NF-κB激活-核转运实验结果

NF-κB是存在于动物细胞中的一种核转录因子，一般与NF-κB的抑制蛋白IκB以复合体的形式存在于细胞浆中。当细胞受到外界药物刺激，复合体被激活后解聚，核定位序列暴露，被转运到细胞核内识别靶基因上的结合位点，从而促使靶基因的转录[29]。

如图8所示，LPS、LHPS1和LHPS5分别与RAW264.7细胞作用后，在RAW264.7细胞中观察到所有刺激都导致NF-κB p65蛋白亚基（绿色荧光）移位到细胞核（蓝色荧光）中，NF-κB被激活，这证明LHPS1和LHPS5都是有效的NF-κB激活剂，能够参与细胞的炎症反应、免疫应答等过程。结果表明，LHPS1和LHPS5能够通过激活RAW264.7细胞的核转录因子NF-κB来增强巨噬细胞免疫活性。

图8 LHPS1和LHPS5激活RAW264.7细胞中NF-κB p65蛋白Fig. 8 LHPS1 and LHPS5 activated NF-κB p65 in RAW264.7 cells

3 讨 论

近年来，采用不同工艺手段从泽兰中提取出粗多糖。例如，通过超声提取、酶法提取和水提取等不同工艺提取的泽兰粗多糖具有抗氧化的药理活性[30-31]。本研究旨在提取分离出泽兰中潜在的纯多糖，并探讨其结构和生物学活性。

本研究从泽兰中鉴别出两种酸性纯多糖LHPS1和LHPS5。结果表明，LHPS1和LHPS5具有显著的还原能力和DPPH自由基清除能力，这说明LHPS1和LHPS5与泽兰粗多糖一样具有抗氧化活性，并且还发现LHPS5的抗氧化能力强于LHPS1。此外，LHPS1和LHPS5能够显著增强RAW264.7细胞的吞噬能力，促进脾淋巴细胞的增殖和RAW264.7细胞中TNF-α的产生。研究报道植物多糖的生物活性与其单糖组成、分子质量、化学组成、构象、分支程度和官能团有关[32-33]。例如，水果桑葚由糖醛酸和7种中性单糖组成，可有效激活小鼠腹腔巨噬细胞，同时诱导包括TNF-α、IL-6和COX-2等其他免疫相关基因的表达[34]。类似地，高分子质量、高糖醛酸质量分数和丰富的单糖种类使LHPS1和LHPS5具有显著的抗氧化活性和免疫调节活性，但由于LHPS1和LHPS5中中性糖、蛋白、糖醛酸质量分数和各种单糖比例不同，因此它们的抗氧化作用和免疫调节作用强弱也不同。

Toll样受体（Toll-like receptors，TLR）介导髓样分化因子（myeloid differentiation factor88，MyD88）和NF-κB的这条信号通路（TLR-MyD88-NF-κB）是机体炎症体系中最经典的途径，在多种疾病的发生和治疗过程中发挥重要的作用[35]。据报道，百合多糖[36]、小鹿藿根多糖[37]和黄芪多糖[38]能够通过TLR4和MR介导的信号通路促进免疫反应中细胞因子的表达。LHPS1和LHPS5能够激活RAW264.7细胞中的NF-κB，并且MR抑制剂能够部分抑制其诱导的TNF-α的分泌，这说明LHPS1和LHPS5可以通过MR和NF-κB信号通路激活RAW264.7细胞发生免疫应答。此外，MR抑制剂不能完全抑制TNF-α的分泌，说明巨噬细胞上还存在其他可识别泽兰多糖的受体。