芹菜苷对葡聚糖硫酸钠诱导小鼠结肠炎的缓解作用

夏圣坤，王 辉，陈晓敏，陈春华，周文淦，黄晓君，聂少平

（南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，中加食品科学技术联合实验室，江西 南昌 330047）

炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）包括克罗恩病（Crohn’s disease，CD）和溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC），是病因不明的特发性肠道炎症。IBD的临床表现主要为腹泻、直肠出血、腹痛和体质量减轻等症状，常常给患者带来巨大的痛苦[1]。此外，已有研究表明，除了肠道，IBD还会累及全身各器官，进而引发关节炎、口腔溃疡、皮肤黏膜损害、眼部、肝肾脏等病变[2]。IBD发病率仍持续上升，已成为全球关注的健康问题。目前，治疗IBD的药物种类大多为糖皮质激素、氨基水杨酸、免疫抑制剂和生物制剂等[3-4]。除药物医治外，现有研究发现一些非药物类方法也具有改善作用，包括基因治疗及粪便移植等。但是这些疗法都有其局限性，并非对所有患者都有效。此外，皮质类固醇和免疫抑制剂还具有一定副作用，可引起多种不良反应。因此，寻找新的手段用于缓解患者症状迫在眉睫[5]。

芹菜（Apium graveolensLinn.）属于伞形花科的草本植物，适宜生长在肥沃的土壤，主要分布于南北美洲、南欧、非洲、亚洲[6]。芹菜具有优良的食疗效果，已被用于缓解炎症、便秘、高血压和高血脂、肝脏病变等疾病[7-9]。黄酮类化合物是植物次生代谢产物，在植物界广泛分布，大量报道显示其在细胞和啮齿动物模型中具有抗氧化和抗炎活性[10-11]。芹菜中的黄酮类化合物是其重要活性成分之一。目前，芹菜黄酮的研究热点主要集中在芹菜素，已有研究报道芹菜素具有抗氧化[12]、抗炎[13]、抗肿瘤[14]的生理活性。然而黄酮在植物中主要以其衍生物的形式存在，而非苷元。作为芹菜苷苷元的芹菜素在芹菜中含量较低，质量分数仅为0.003%～0.088%[15]。芹菜苷作为芹菜中芹菜素的主要存在形式之一，其含量是芹菜素的10～20 倍[16]，然而其相关的功能活性鲜有报道。

因此，本研究以芹菜苷作为对象，对葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium，DSS）诱导的结肠炎小鼠给予芹菜苷干预，利用现代生物技术手段评价芹菜苷缓解结肠炎的效果，以期提高芹菜的综合利用，并可为结肠炎患者膳食选择提供参考。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

5周龄雄性近交系C57BL/6J小鼠（（18f2）g）购自北京维通利华实验动物技术有限公司（生产许可证号：SCXK（京）2016-0006），在清洁级动物房中进行饲养，条件为室温（25.0f0.5）℃、相对湿度（50f5）%、光/暗循环为12 h/12 h。

芹菜苷（芹菜苷（67.85f0.89）%、3-甲氧基芹菜苷（9.76f0.23）%和木樨草素-7-O-芹糖苷（10.22f0.05）%）由南昌大学食品科学与技术国家重点实验室提供，其结构如图1所示。

图1 芹菜苷及其衍生物结构图Fig. 1 Structures of apiin and its derivatives

DSS 美国MP Biomedical公司；0.01 mol/L磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）（pH 7.2～7.4）、4%多聚甲醛溶液 上海碧云天生物技术有限公司；苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）、阿利新蓝（alcian blue，AB）-过碘酸席夫（periodic acid Schiff，PAS）染色试剂盒 武汉赛维尔生物有限公司；髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、诱导型一氧化氮合酶（inducable nitric oxide synthase，iNOS）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α与白细胞介素（interleukin，IL）-6酶联免疫吸附试验（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒 南京森贝伽生物科技有限公司；其他化学试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

Feica APERIO LV1型病理切片扫描仪、倒置荧光显微镜德国徕卡显微系统公司；3K15冷冻离心机 美国Sigma-Aldrich公司；Varioshan Flash多功能酶标仪、702型－80 ℃冰箱 美国赛默飞世尔科技公司。

1.3 方法

1.3.1 动物实验设计

1.3.1.1 小鼠饲料配方的确定

AIN93G饲料定制于上海帆泊生物技术有限公司。饲料成分如表1所示，芹菜苷饮食配方基于AIN93G饲料进行调整。以小鼠3 g/d的饮食剂量为参照，芹菜苷剂量为25 mg/kgmb，相当于人的剂量为2.75 mg/kgmb[17]。

表1 饮食成分表Table 1 Ingredients of experimental diets

1.3.1.2 动物实验分组及模型建立

参照文献[18]方法并适当修改，利用DSS诱导建立小鼠结肠炎模型。静养1周后，选用30只C57BL/6小鼠为实验对象，将小鼠随机分成3 组（n＝10）：正常组、模型组、芹菜苷组。正常组和模型组全程给予AIN93G正常饲料，芹菜苷组全程给予根据AIN93G饲料配方调整的芹菜苷定制饲料。饲喂7 d后，模型组和芹菜苷组的饮水更换为含质量分数3% DSS的无菌水进行肠炎造模；正常组依然给予正常无菌水。造模6 d后，停止给予DSS无菌水（正常组也停止给予无菌水），24 h后，小鼠称质量后脱颈处死，眼眶取血，室温下静置1 h，3 000 r/min离心20 min，取上清液（血清），－80 ℃冻存待用。量取升结肠到直肠末端的距离作为小鼠结肠长度，称量脾脏质量并记录，收集小鼠各器官部分保存于－80 ℃冰箱或多聚甲醛溶液中。实验期间记录每天小鼠的体质量和饮食量。本研究中涉及动物的所有程序均按照国家卫生研究院实验动物护理和使用指南进行，并经南昌大学实验动物护理和使用委员会批准。

1.3.2 疾病活动指数测定

从第8天开始到动物饲养结束，参照文献[19]的方法，对小鼠的粪便形态、便血情况和体质量下降率3 个方面进行评分，评分标准如表2所示。疾病活动指数（disease activity index，DAI）为以上3 个指标得分总和的平均值。

表2 DAI评分标准Table 2 Scoring criteria for DAI

1.3.3 脾脏指数测定

称取小鼠脾脏质量并记录，按如下公式计算小鼠脾脏指数。

1.3.4 炎症因子水平测定

根据ELISA试剂盒操作说明，测定小鼠血清中炎症因子TNF-α与IL-6的质量浓度。

1.3.5 氧化应激指标测定

称取适量结肠样本，向其中加入预冷（4 ℃）的PBS匀浆，4 ℃、3 000 r/min离心10 min获得结肠上清液，根据ELISA试剂盒操作说明，测定小鼠结肠中MPO及iNOS活力。

1.3.6 结肠组织病理学分析

4%多聚甲醛固定结肠组织样本，石蜡包埋后，经切片、脱蜡、覆水、苏木精染色、乙酸分化、伊红染色、脱水和封片后，在病理切片扫描仪下观察各组的结肠组织学形态，并用相机采集图像。结肠组织学损伤评分标准如表3所示，组织损伤评分为各项指标评分的总和[20]。

表3 结肠组织学损伤评分标准Table 3 Scoring criteria for colonic histological injury

1.3.7 结肠杯状细胞观察

AB可以将唾液黏蛋白、硫黏蛋白和蛋白多糖染成蓝色，而PAS可以将既含中性黏蛋白又含酸性黏蛋白的组织和细胞染成深浅不同的紫色，因此常用AB-PAS技术研究肠道杯状细胞的生长状况[21]。根据AB-PAS染色试剂盒说明书，对结肠切片进行AB-PAS染色。石蜡切片脱蜡复水，使用染液进行浸染，切片用无水乙醇脱水、中性树胶封片。在病理切片扫描仪下采集切片图像信息。采用Image pro plus 6.0软件对切片中杯状细胞面积占结肠总面积的百分比（杯状细胞面积占比）进行计算。

1.4 数据处理与分析

通过Graph Pad Prism 8.0软件绘制统计图表，采用SPSS Statistics 23软件对数据通过单因素方差分析进行最小显著差异（least significant difference，LSD）的事后分析检验，结果以平均值±标准误表示。

2 结果与分析

2.1 各处理组小鼠饮食状况

对各处理组小鼠饮食量进行统计，并计算平均每只小鼠饮食量，结果如图2所示，在第2～9天，各处理组小鼠饮食量之间没有明显差异，均稳定在2.1～3.2 g之间，而从第10天开始，模型组和芹菜苷组小鼠饮食量开始逐渐下降，这可能是DSS处理使得小鼠肠道损伤所引起的。

图2 各处理组小鼠饮食量Fig. 2 Food intake of mice in each treatment group

2.2 芹菜苷对小鼠体质量的影响

为评估芹菜苷对DSS诱导的结肠炎小鼠体质量的影响，对小鼠体质量进行统计。从图3A可以看出，在第1～8天，各组小鼠体质量均缓慢上升，而在给予DSS后，模型组和芹菜苷组小鼠体质量逐渐下降。对比模型组，芹菜苷可减缓体质量降低，且在第14天时，芹菜苷组小鼠体质量显著高于模型组（P＜0.05）。为消除前7 d芹菜苷干预对体质量的影响，以第8天小鼠体质量为基准，计算8～14 d的体质量与第8天体质量的比值（相对体质量）（图3B）。结果发现，在第14天，模型组的体质量降至第8天时的89.34%，而芹菜苷可显著缓解由DSS诱导的体质量降低（P＜0.05）。

图3 芹菜苷对小鼠体质量的影响Fig. 3 Effect of apiin on body mass in mice

2.3 芹菜苷对小鼠脾脏指数的影响

脾脏是最大的免疫器官，炎症反应会使脾脏发生肿大，导致质量增加。如图4所示，模型组小鼠脾脏指数与正常组小鼠相比高度显著升高（P＜0.001），芹菜苷可高度显著降低肠炎小鼠脾脏指数（P＜0.001）。

图4 芹菜苷对小鼠脾脏指数的影响Fig. 4 Effect of apiin on spleen index in mice

2.4 芹菜苷对小鼠DAI的影响

为判断小鼠结肠炎的严重程度，对小鼠DAI进行评分，结果如图5所示。在造模期间，正常组DAI基本保持为0。给予3% DSS 2 d（第10天）后，与正常组相比，模型组DAI显著升高（P＜0.05），且在第14天DAI达到约3.5。而芹菜苷可显著降低结肠炎小鼠的DAI，芹菜苷组在第14天DAI为2，高度显著低于模型组（P＜0.001）。

图5 芹菜苷对小鼠DAI的影响Fig. 5 Effect of apiin on DAI in mice

2.5 芹菜苷对小鼠结肠长度的影响

结肠炎会引起结肠长度缩短，因此结肠长度变化是评价小鼠结肠炎严重程度的又一重要参数[22]。如图6所示，正常小鼠结肠长度为6.5 cm，而模型组小鼠的结肠平均长度仅为5.0 cm，高度显著低于正常组（P＜0.001），而芹菜苷饮食干预可极显著缓解结肠炎小鼠的结肠缩短（P＜0.01）。

图6 芹菜苷对小鼠结肠长度的影响Fig. 6 Effect of apiin on colonic length

2.6 芹菜苷对小鼠氧化应激的影响

为评价芹菜苷对氧化应激的调节能力，测定了结肠中MPO及iNOS的活力，结果如图7所示。正常组的MPO和iNOS活力分别为15 U/μg和0.75 U/μg，DSS的摄入会引起小鼠氧化应激反应，表现为模型组小鼠的MPO和iNOS活力显著增加（P＜0.001、P＜0.01），然而芹菜苷的摄入可以高度显著抑制MPO与iNOS活力的增加（P＜0.001），说明芹菜苷具有较强的调节氧化应激能力。

图7 芹菜苷对小鼠氧化应激的影响Fig. 7 Effect of apiin on oxidative stress in mice

2.7 芹菜苷对小鼠炎症因子分泌水平的影响

结肠炎患者常伴有严重的炎症反应，进而体内产生高浓度的促炎因子[23]，为了评价芹菜苷的抗炎能力，本实验测定了血清中TNF-α与IL-6的质量浓度，结果如图8所示。与正常组相比，模型组小鼠血清中促炎因子TNF-α和IL-6分泌水平显著升高（P＜0.05），质量浓度分别达到493 ng/L、99 pg/mL，而芹菜苷干预可显著降低血清中这两种炎症因子质量浓度（P＜0.001、P＜0.01），并达到与正常组相近的水平。

图8 芹菜苷对小鼠血清TNF-α（A）和IL-6（B）质量浓度的影响Fig. 8 Effect of apiin on serum TNF-α (A) and IL-6 (B) levels in mice

2.8 芹菜苷对结肠组织病理的影响

为评价芹菜苷对DSS诱导的结肠炎小鼠结肠组织结构和形态的影响，对小鼠结肠组织进行HE染色及组织病理学综合评分。如图9A所示，正常组小鼠结肠上皮及隐窝结构正常，且无炎症细胞浸润发生；模型组小鼠结肠出现严重的肠上皮损伤、隐窝结构变形或消失，以及大范围的炎症浸润；芹菜苷组小鼠结肠结构较为完整，组织损伤轻微，黏膜上皮结构较为完整，隐窝结构基本完整与规则。如图9B所示，与模型组相比，芹菜苷组结肠组织损伤得分高度显著降低（P＜0.001），说明芹菜苷可显著减轻DSS引起的小鼠结肠组织损伤。

图9 芹菜苷对小鼠结肠病理组织的影响Fig. 9 Effect of apiin on colonic damage score in mice

2.9 芹菜苷对结肠组织中杯状细胞的影响

与正常组相比，模型组小鼠组织学检查结果显示隐窝结构变形或消失，这表明芹菜苷可能通过刺激杯状细胞分泌黏液对肠道上皮细胞产生有益作用。因此用ABPAS进行特异性染色，以评估芹菜苷处理后的小鼠杯状细胞的生长情况。如图10A所示，在模型组小鼠结肠中，杯状细胞萎缩且几乎被完全破坏，而芹菜苷组小鼠结肠杯状细胞数量众多并均匀地分布在隐窝当中，且分泌有大量黏液。如图10B所示，与模型组相比，芹菜苷处理小鼠杯状细胞的AB-PAS染色面积百分比显著更高（P＜0.05），这表明芹菜苷的摄入对杯状细胞具有明显的保护作用。

图10 芹菜苷对结肠组织中杯状细胞的影响Fig. 10 Effect of apiin on number of goblet cells in colon tissue

3 讨 论

DSS诱导的小鼠结肠炎具有与人类UC相似的病理特征，表现为体质量减轻、粪便出血、肠上皮细胞丢失和中性粒细胞浸润等病理改变[24]。在本研究中，通过连续6 d在雄性C57BL/6小鼠的饮水中添加3%的DSS诱导急性结肠炎。模型组体质量急剧下降，肛门可见血便，组织病理改变，结肠组织出现隐窝破坏、杯状细胞的丢失、黏膜下水肿和上皮结构损伤以及大范围的炎症浸润等现象。而芹菜苷能减轻DSS处理小鼠的结肠炎症状和炎症反应，维持正常的肠道形态结构。

氧化应激和氧化细胞损伤是结肠炎的标志之一。氧化应激酶活力升高会导致自由基大量生成，而自由基会与肠细胞膜上脂类物质发生相互作用，导致脂质过氧化，从而破坏肠道黏膜屏障，加重炎症反应[25-26]。MPO是一种中性粒细胞溶酶体中富含的酶，其活性与炎症直接相关，在特定条件下，MPO催化反应生成过量的氧化自由基，会导致氧化应激和氧化性组织损伤[27]。iNOS是催化NO生成的协助巨噬细胞在免疫系统中对抗病原体的一类氧化应激酶。研究发现，结肠炎患者内NO含量超过正常值时，iNOS表达合成量升高[28]。本研究发现，与正常组相比，DSS处理的模型组小鼠MPO和iNOS活力显著升高，而添加芹菜苷处理后，这两种酶活力恢复至正常水平，表明芹菜苷具有较强的调节机体氧化应激能力。贾佳等[29]在对芹菜苷体外活性研究中发现，芹菜苷具有强抗氧化能力，能减缓油脂过氧化。

炎症因子是一类主要由免疫系统细胞分泌的具有许多强大生物学效应的内源性多肽，可介导单核细胞等炎症细胞浸润肠组织，从而引起肠组织损伤[29]。TNF-α是炎症反应过程中出现的最早、最重要的炎性介质，能激活中性粒细胞和淋巴细胞，使血管内皮细胞通透性增加。IL-6能诱导B细胞分化和产生抗体，并诱导T细胞活化增殖、分化，参与机体免疫应答，是炎症反应的促发剂[30]。IL-6水平常与结肠炎患者疾病的严重程度呈正相关[31]。研究结果表明，促炎因子（如TNF-α和IL-6）的表达量升高可促使肠道炎症发生，导致疾病恶化和组织破坏[32]。也有研究发现，TNF-α可以通过调节核因子（nuclear factor，NF）-κB诱导激酶和抑制酶比例（NF-κB-inducing kinase/inhibitory-κB kinase α，NIK/IKK-α）激活NF-κB通路促进肠道通透性增加[33]。据报道，NO产量的增加与促炎细胞因子释放的增加成正比，而iNOS活力增加会导致产生大量的NO[34]。因此，本研究利用ELISA法测定血清中的TNF-α及IL-6的质量浓度，结果表明，DSS诱导能显著提高血清中这些炎症因子的质量浓度，而芹菜苷可显著抑制这些细胞因子的表达，提示芹菜苷可以缓解全身性的炎症。

肠道黏液层作为肠道屏障的重要组成部分，主要由杯状细胞及其分泌的黏蛋白组成。黏蛋白是一类糖蛋白，其结合位点可与肠上皮细胞上的结合位点竞争，以阻止细菌与肠上皮结合，使细菌处于黏液层，以利于肠蠕动时被清除，以维护肠道内环境稳态[35]。结肠组织中过多的炎症细胞因子会引起杯状细胞凋亡，从而导致黏膜屏障完整性严重被破坏[36]。因此，利用AB-PAS进行特异性染色，以评估芹菜苷处理后的杯状细胞生长情况，结果发现，芹菜苷组小鼠的杯状细胞数量显著高于模型组，这表明芹菜苷可能通过刺激杯状细胞增殖分泌黏液对肠道屏障产生有益作用。也有研究表明，一些黄酮具有上调黏蛋白和保护结肠黏液层完整性的功能[37]，与本实验研究结果相似。

芹菜苷作为芹菜素的天然存在形式，其结构上比芹菜素多连有两个糖苷；且与芹菜素相比，芹菜苷在体外几乎不被细胞吸收，并且没有表现出明显抗炎活性[38]。这表明芹菜苷发挥抗炎作用可能涉及到其他机制，如机体代谢及肠道菌群的改变，有待进一步研究。

综上所述，芹菜苷可以缓解结肠炎小鼠的体质量降低和结肠缩短，降低DAI；并减弱DSS诱导小鼠结肠炎的组织病理学改变。此外，芹菜苷能抑制结肠炎小鼠血清中促炎细胞因子表达水平的增加，调节结肠氧化应激酶MPO及iNOS活力，促进杯状细胞增殖，保护肠道屏障完整性，修复结肠炎导致的肠道损伤。因此，芹菜苷可作为缓解结肠炎的潜在天然活性物质。