振腹环揉法对PCPA 失眠模型大鼠脑电活动及下丘脑5-HT、β-EP 含量的影响

郅晓宇，刘 鹏，丛德毓，张 野，刘杨圣洁，张红石*

（1.长春中医药大学，长春 130117；2.长春中医药大学附属医院，长春 130021）

失眠是一种常见疾病，大多数成年人对自己的睡眠时间或质量不满意，包括易醒、睡眠持续时间短、彻夜不眠[1]。现代神经生物学与心理学观点认为，失眠与大脑功能变化，遗传因素及情感因素相关[2]。在失眠的演变进程中，患者的大脑皮层与躯体均会出现过度唤醒状态[3]。有1 项Meta 分析通过对17 项研究共计3 693 万人进行评估发现，失眠与死亡率之间没有关系，而使用催眠药物会增加死亡风险[4]，推拿作为一种非药物疗法被越来越多的患者接受。观察失眠大鼠的脑电活动以及下丘脑内5-HT、β-EP 含量的变化，探讨“振腹环揉法”改善睡眠的作用机制，为临床提供更多科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康6 月龄SD 大鼠18 只（雌雄各半）[购自长春市亿斯实验动物技术有限责任公司，许可证号：SCXK（吉）2020-0002]，体质量200～230 g。

1.2 电极埋置 大鼠气麻后对其头部表面进行消毒，沿着头部中线将头部皮肤剪开，将颅骨充分暴露，剥离骨膜。将大鼠头部固定于大鼠脑立体定位仪上，在大脑右侧皮层前额叶上方和枕叶上方放置不锈钢电极，在小脑上方放置接地参考电极。将所有电极用牙科水泥固定于大鼠头部，缝合皮肤切口，连续3 d 腹腔注射4 万U 青霉素，每只大鼠放入鼠盒中单独饲养1 周。

1.3 分组及造模方法 术后1 周将大鼠按体重随机分为空白组、模型组、推拿组，每组各6 只。空白组：腹腔注射生理盐水（400 mg/kg）。模型组、推拿组：采用PCPA 法造模。每日上午8 时～10 时对大鼠进行PCPA 混悬液（400 mg/kg）腹腔注射，每日1 次，连续注射2 d。在注射结束后第2 天对造模后大鼠进行翻正反射检测，以30 mg/kg 戊巴比妥钠进行腹腔注射后将大鼠腹部向上放置于垫板上，以翻正反射消失记录为睡眠开始，记录睡眠潜伏期以及睡眠时间，所测时间与空白组出现统计学差异（P＜ 0.05），证明模型复制成功。

1.4 干预方法 空白组：正常饮食与饮水，不予干预治疗。模型组：每日将大鼠束缚鼠板仰卧位1 次，不予推拿治疗，12 min 解开束缚，连续7 d。推拿组：采用“振腹环揉法”进行推拿治疗，连续7 d。分“振腹法”和“环揉法”两部分进行操作。振腹法：将穴位按摩仪置于中脘（穴位参照《实验针灸学》），以按摩仪自身重量70 g 为压力，仪器保持直立，作用于中脘1 min 后将仪器离开大鼠腹部，间隔30 s 后与环揉法进行交替操作。环揉法：将穴位按摩仪直立于腹部，以中脘为中心，1 cm 为半径做顺时针的环揉操作，频率为每分钟15 圈，间隔30 s 后与振腹法进行交替操作。振腹环揉法操作全程共计12 min。

1.5 脑电监测 脑电采集，在治疗结束后对各组大鼠进行脑电监测，在适应1 h 后进行2 h 脑电采集，截取两段60 s 平稳信号（间隔1 h），采集过程均在屏蔽室中进行。分别计算各组大鼠的δ 波百分比，θ 波百分比，α 波百分比，β 波百分比。

1.6 下丘脑5-HT 及β-EP 含量检测 治疗结束后，对各组大鼠进行气麻，断头处死，迅速取出全脑，在冰盘上剥离下丘脑。按照Elisa 试剂盒说明书进行操作，使用酶标仪进行OD 值测定，以ELISA Calc 软件进行浓度计算。

1.7 统计学方法 本实验数据采用Graph Pad 8 进行统计，方差齐采用单因素方差分析（ANOVA），方差不齐采用Brown-Forsythe and Welch ANOVA 分析，组间比较采用Dunnett’s T3 multiple comparisons test。

2 结果

2.1 振腹环揉法对PCPA 失眠模型大鼠脑电活动的影响 治疗结束后，模型组与空白组相比，脑电波中的δ 波百分比降低，θ 波百分比升高，α 波百分比升高，β 波百分比升高；推拿组与模型组相比，脑电波中的δ 波百分比升高，θ 波百分比降低，以上差异均具有统计学意义。结果见图1、图2、图3、图4。

图1 δ 波功率谱百分比

图2 θ 波功率谱百分比

图3 α 波功率谱百分比

图4 β 波功率谱百分比

2.2 振腹环揉法对PCPA 失眠模型大鼠下丘脑5-HT及β-EP 含量的影响 模型组与空白组相比，下丘脑5-HT 的含量下降；推拿组与模型组相比，下丘脑5-HT的含量升高，见图5。模型组与空白组相比，下丘脑β-EP的含量下降；推拿组与模型组相比，下丘脑β-EP 的含量升高，见图6。以上差异均具有统计学意义。

图5 下丘脑内5-HT 含量

图6 下丘脑内β-EP 含量

3 讨论

研究表明，失眠是由于大脑皮层的兴奋和抑制功能失调导致的疾病，以入睡难和睡眠维持障碍为特征[5]。大鼠的脑电波可分为以下四个频段：δ 波：频率0.5～3.5 Hz，通常只在睡眠状态时出现；θ 波：频率3.5～7.5 Hz，通常在困倦状态时出现；α 波：频率7.5～13.5 Hz，通常在安静清醒且闭目的状态下会出现；β 波：频率13.5～30 Hz，通常在大脑皮层兴奋的时候出现[6]。本实验结果表明，造模后大鼠的δ 波显著降低，θ、α、β 波显著增加；推拿治疗后大鼠的δ波显著升高，θ、α、β 波显著降低，提示振腹环揉法治疗失眠大鼠脑电活动有影响。

5-HT 是具有多种生物学效应的神经递质，主要存在于中枢神经系统和肠神经系统中，参与着情感、认知、睡眠等重要生理活动[7]。研究证明，5-HT 能够促进觉醒过程，对快速眼动睡眠产生抑制作用，是网状激活系统的重要组成部分[8-10]。5-HT 分泌不足时会导致大脑皮层兴奋和抑制功能的紊乱，进而导致睡眠时相慢波睡眠和快波睡眠发生了紊乱[11]。β-EP 是脑内重要的神经递质，具有镇静、止痛作用，与睡眠密切相关。本实验结果表明，造模后大鼠下丘脑内5-HT 及β-EP 含量显著降低；推拿治疗后的大鼠下丘脑内5-HT及β-EP 含量显著升高，证明振腹环揉法可以对下丘脑内5-HT 及β-EP 含量产生影响。

目前药物是治疗失眠的常用方法[12]。苯二氮卓类受体激动剂是首选药物，但在停药后易出现反射性失眠和戒断反应[13]。推拿作为一种中医外治法可以调节脏腑功能，平衡阴阳气血，达到补益心脾，交通心肾，滋阴潜阳，安神定志的作用[14]。振腹环揉法传习了脏腑推拿“外通经络，内调脏腑”的诊疗经验，临床治疗各型失眠取得了较好疗效[15]。本实验初步揭示了振腹环揉法对大鼠脑电活动及下丘脑内5-HT 及β-EP 含量的影响，从神经电生理角度及神经递质角度为振腹环揉法治疗失眠的作用机制提供了多维度的证据。