可可粉对DSS诱导的小鼠结肠炎的抑制作用 及分子机制

孙晶晶，季影，王勉，牟明军，邹璟，黄叶飞

（徐州医科大学公共卫生学院，江苏徐州 221004）

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）与克罗恩病（Crohn’s disease，CD）都是一组病因尚不十分清楚的慢性非特异性肠道炎症性疾病，同属于炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）[1]。与CD不同，UC病变连续，主要累及直肠、结肠黏膜和黏膜下层，临床主要表现为腹痛、腹泻、脓血便等[1-3]；此外，UC腹泻不超过6周的疾病过程，需要区别于传染性肠炎[2]；UC易反复发作且迁延不愈、极易诱发结直肠肿瘤，严重威胁着人类的健康[3-5]。UC在发达国家发病率较高，近年来，中国人群UC的发病率呈逐年升高的趋势，亚洲国家中处于较高水平[6,7]。目前UC的发病机制尚未明确，受环境、遗传、感染等多种因素的影响，但普遍认为是遗传、免疫、饮食、感染和菌群失调等因素之间相互作用的结果，其中免疫系统因素是其发病的重要环节，很大程度上与炎性因子的失衡和免疫反应的异常密切相关[7,8]。现有治疗药物可分为氨基水杨酸类、肾上腺相关激素、免疫抑制剂以及一些生物制剂等，虽然种类繁多，但仍然缺乏安全有效的药物，长期使用这些药物会导致严重的副作用，如机会性感染、胃溃疡、胰腺炎、恶性肿瘤等[9,10]。因此，寻找新型安全、治疗有效的药物具有十分重要的意义。

植物化学物质在改善UC患者营养不良和减少不良反应方面具有独特优势，如多途径、疗效好、副作用小等[11]。研究表明，可可消费与心血管疾病和全因死亡率的显著降低有关[12]。可可粉（CP）含有生物碱、挥发性物质、脂类及丰富的酚类抗氧化剂，研究发现抗氧化能力最高的50种食品中，有5种是基于可可的[13]。CP富含黄酮类化合物，特别是黄烷醇，在可可中发现的主要黄烷醇是表儿茶素和儿茶素[12]；黄烷醇是一类天然植物化合物，具有清除自由基、抗氧化、抗肿瘤、抗炎、保护心血管、降血脂等多种生物学功能[12,14-16]，在可可中的黄烷醇含量最高[14]。CP可以有效地改变炎症过程，从而有可能为动脉粥样硬化、心血管疾病和癌症危险因素较高的个体带来好处，还可以保护神经免受损伤，保护皮肤免受紫外线辐射的氧化损伤，对饱腹感、认知功能和情绪呈现有益的影响[12,17]。

葡聚糖硫酸钠盐（DSS）诱导的小鼠急性和慢性结肠炎模型是都是肠炎模型中应用最广的，该模型症状表现与人类UC极为相似，主要表现为腹泻、黏液样便、粪便潜血、肉眼血便、重量减轻、活动度减少，毛色变差等，是研究人类UC的理想模型。DSS是一种高分子的水溶性硫酸多聚糖，对肠道上皮细胞具有直接毒性，通过有效抑制DNA合成，破坏肠黏膜屏障，改变结肠黏液层菌群变化，还可以使结肠紧密连接蛋白基因表达能力下降，同时可能发生肝素样作用，导致急性结肠炎的发生[18-20]。本实验建立3% DSS诱导小鼠急性溃疡性结肠炎模型，通过给与CP灌胃治疗，观察结肠炎小鼠的一般情况、结肠长度和病理损伤程度，分析结肠组织中NF-κB p65信号通路相关蛋白以及下游炎症因子的表达水平，探讨CP对于小鼠溃疡性结肠炎的治疗作用及机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选用雌性6～8周龄C57BL/6小鼠（18～22 g）20只，购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司（许可证号：SYXK(苏)2021-0038），饲养条件为室温21 ℃，相对湿度45%，明暗交替，光照适度，通风良好，环境清洁卫生。在整个适应和研究期间，所有动物均可自由获取食物和水。

1.2 药物及试剂

Navitas无糖生可可粉227 g，购自乐淘美国酮人馆；葡聚糖硫酸钠（DSS，分子量为(3.6～5.0)×104，批号：160110），MP Biomedicals公司；RIPA蛋白裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、ECL化学发光液，购自上海碧云天生物技术有限公司；荧光定量PCR试剂盒，购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；IκBα、Phospho-IκBα、NF-κB p65、Phospho-NF-κB p65 (Ser536)、β-tubulin一抗，购自美国Cell Signaling Technology公司，TNF-α、IL-6、IL-1β一抗，购自美国Proteintech公司。

1.3 主要仪器设备

RM2016石蜡切片机，上海莱卡仪器有限公司；Eclipse Ci正置显微镜，日本尼康；KZ-Ⅱ高速组织研磨仪，武汉塞维尔生物科技有限公司；Optima XPN-100超速冷冻离心机，美国贝克曼库尔特公司；NanoDrop 2000超微量分光光度计，美国赛默飞公司；Spark多功能酶标仪，瑞士Tecan公司；ABI 7500实时荧光定量PCR仪，美国赛默飞公司；BIO-RAD ChemiDocXRS+化学发光凝胶成像仪，美国伯乐公司。

1.4 试验方法

DSS诱导的急性UC模型的建立：C57BL/6小鼠20只，小鼠随机分成正常对照组（Control group）、模型组（DSS group）、低剂量可可粉组（DSS+low CP group）和高剂量可可粉组（DSS+high CP group），每组5只小鼠。适应性喂养7 d后，给与3% DSS连续饮水7 d，然后继续正常饮水3 d。对照组小鼠一直饮用常规饮水，模型组小鼠饮用水含3% DSS，低剂量组小鼠在3% DSS饮水的基础接受50 mg/(kg·d)剂量的CP灌胃处理，高剂量组小鼠在3% DSS饮水的基础上接受100 mg/(kg·d)剂量的CP灌胃处理，两组小鼠接受CP治疗的时间都是持续10 d，同时正常组和模型组小鼠灌胃同等剂量的溶剂（生理盐水）对照，实验过程中每天记录小鼠的体重。

实验结束，小鼠麻醉后用脊椎脱臼方法处死，剖开腹腔暴露结肠，取下全结肠，测量长度，然后纵向剪开，用PBS冲洗干净，用于后续的结肠病理分析以及目的蛋白、mRNA等指标的检测，剩余小鼠结肠组织于-80 ℃保存备用。

1.5 结肠病理分析

造模完成取出小鼠全结肠后，比较研究小鼠结肠（回盲连接部到肛门外缘）的长度，取部分用PBS冲洗干净的结肠，用4%多聚甲醛溶液固定过夜，石蜡包埋切片，苏木精-伊红（HE）染色，显微镜下观察结肠组织黏膜损伤情况，并由专业病理人员进行结肠组织病理学评分。结肠组织病理学评分=结肠上皮组织损伤评分+炎性浸润评分，评分标准见表1。

表1 结肠组织病理学评分标准Table 1 Colon histopathological scoring system

1.6 RNA提取及qRT-PCR实验

取一小段小鼠结肠组织（约0.2 g）至含有1 mL TRIzol的2 mL EP管（已经去除RNase）中，用KZ-Ⅱ高速组织研磨仪（武汉塞维尔生物科技有限公司）进行匀浆，频率：70 Hz，时间：共180 s，每60 s暂停30 s。TRIzol法提取总RNA，核酸蛋白测定仪测定总RNA浓度，每个样品上样总RNA量为0.5 μg，利用Applied Biosystems 7500 Fast实时荧光定量PCR系统，按照HiScript II One Step qRT-PCR SYBR Green Kit步骤进行目的基因TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA水平检测，每份样品至少重复三次。目的基因mRNA的相对表达量用CT值衡量，并以GAPDH的CT值作为内参，应用2-ΔΔCT方法进行计算分析。引物由Thermo Fisher公司构建，序列见表2。

表2 靶基因引物Table 2 Target gene primers

1.7 免疫印迹分析

取一小段小鼠结肠组织（约0.2 g）至含有500 μL组织蛋白裂解液的2 mL EP管中，KZ-Ⅱ高速组织研磨仪进行匀浆，频率：70 Hz，时间：共180 s，每60 s暂停30 s。匀浆制备完成后置于冰上裂解0.5 h，4 ℃、12000×g离心15 min，取上清，用BCA测定蛋白浓度。然后制备10%的SDS-PAGE，以40 μg蛋白量上样电泳。恒压条件下，浓缩胶电泳电压70 V，分离胶电压为100 V。电泳结束后，用湿法转膜至PVDF膜（250 mA，90 min）。转膜完毕，用5%脱脂奶粉室温封闭1 h，接着与IκBα、Phospho-IκBα、NF-κB p65、Phospho-NF-κB p65（Ser536）抗体、TNF-α、IL-6、IL-1β的一抗（1:1000稀释度）在4 ℃冰箱孵育过夜，接着用TBST洗涤一抗（5次，5 min/次），与适当稀释的二抗在室温共孵育1 h，膜用同样的方法洗涤二抗10次，最后用增强型化学发光试剂进行检测。条带灰度值使用Image J软件进行分析。

1.8 统计分析方法

所有实验均独立重复三次以上，采用SPSS 21.0版本软件进行统计分析，所有数据均采用均数±标准差（x±s）表示，多组之间的比较采用单因素方差分析，两两比较使用t检验方法分析，p<0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果与讨论

2.1 CP对结肠炎小鼠体重减轻的抑制作用

研究报道[21]，有18%～62%的UC患者有体重下降的临床表现，这可能与长期腹泻、血便导致的继发营养不良有关。观察CP对DSS诱导的急性溃疡性结肠炎小鼠体重的影响，结果见图1。正常对照组小鼠体重增加，精神状态良好，饮水、饮食、活动及大便等性状正常，体毛柔软光亮。各造模组小鼠在给与DSS后，体重开始下降，开始出现精神萎靡、活动量减少、进食量下降、毛发灰暗凌乱无光泽等现象，模型组小鼠在给与DSS 3 d后开始出现稀便、血便、体重减轻、懒动、厌食及毛发干枯等UC急性期症状，说明造模成功，到第10 d，模型组小鼠的平均体重仅为初始平均体重的76.81%，而低、高剂量CP组小鼠平均体重分别为初始平均体重的83.02%和87.58%。与模型组相比，CP处理组小鼠的体重丢失明显减少，且高剂量处理组小鼠的体重丢失也要少于低剂量组，同时，处理组小鼠的进食、体重、活动度都有所改善。大量人群和动物实验已经证实，可可即使在慢性毒性和致癌实验中也没有出现毒副作用[22,23]。实验结果提示，CP能够有效的抑制DSS诱导的结肠炎小鼠的体重丢失，这对改善UC炎症期间营养不良可能具有较好的作用。

2.2 CP对结肠炎小鼠结肠长度缩短的抑制作用

取各组小鼠完整结肠，观察CP对结肠炎小鼠结肠长度的影响，结果如图2所示。与正常对照组（9.85 cm）相比，模型组（6.89 cm）小鼠结肠长度明显缩短（p<0.01），CP低剂量（8.16 cm）和高剂量组（9.19 cm）小鼠结肠长度缩短明显少于模型组，差异具有统计学意义（p<0.05），且随着CP剂量增加，结肠长度缩短进一步减少。结肠炎症期间，伴有组织水肿，结肠长度缩短[24]，CP能减少DSS诱导所致的结肠长度缩短，表明其对DSS诱导的小鼠UC炎症反应具有一定的抑制作用。

2.3 CP对结肠炎小鼠结肠黏膜损伤的抑制作用

通过小鼠结肠HE染色病理分析，考察CP对结肠炎小鼠结肠黏膜损伤的影响，结果如图3所示。与正常对照组小鼠（结肠组织病理学评分，0.60）相比，模型组小鼠（5.20）结肠组织病理学评分明显增高（p<0.01），镜下正常对照组小鼠肠腺清晰、排列整齐、无明显炎性细胞浸润、绒毛排列整齐、无明显断裂，而模型组小鼠肠黏膜结构遭到严重破坏、可见大量炎性细胞浸润、绒毛排列杂乱无序、可见明显断裂、绒毛长度缩短，局部有轻重度坏死，坏死处成纤维细胞增生，黏膜下层水肿。与模型组相比，CP低剂量（3.20）和高剂量组（2.00）小鼠结肠组织病理学评分明显降低（p<0.05），低剂量组小鼠结肠黏膜结构明显改善，高剂量组小鼠结肠黏膜结构基本恢复正常，上皮结构较完整，几乎没有炎症细胞浸润。可可是抗氧化剂的丰富来源，含有大量表儿茶素及黄酮类化合物[13]，Zhang等[25]发现表儿茶素能够明显减轻DSS诱导的小鼠体重下降、结肠黏膜损伤、结肠缩短和隐窝损害，与本研究的发现是一致的。研究表明CP能够减轻DSS诱导的结肠黏膜损伤，抑制炎症的严重程度，从而有效改善DSS诱导的结肠炎症病变。

2.4 CP对结肠炎小鼠肠组织中促炎因子表达的抑制作用

UC的发生与炎症因子的失衡和免疫反应的异常密切相关，UC患者结肠组织中促炎因子的水平会增高，产生免疫功能紊乱，最终导致UC的发展[7,8]。与对照组相比，模型组小鼠结肠组织中的促炎因子TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA表达水平分别升高了9.72、7.08和7.39倍（p<0.01）；与模型组相比，低、高剂量CP组小鼠TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA水平分别降低了0.64、0.72、1.05倍和2.03、2.27、2.07倍，差异具有统计学意义（p<0.05）；与对照组相比，模型组小鼠结肠组织中的促炎因子TNF-α的蛋白表达水平升高了0.93倍（p<0.01），IL-6和IL-1β的蛋白表达水平分别升高了0.44和0.52倍（p<0.05）；与模型组相比，低剂量CP组小鼠TNF-α、IL-6和IL-1β的蛋白表达水平分别降低了0.22、0.14和0.18倍，高剂量CP组小鼠则分别降低了0.58、0.37和0.68倍，差异具有统计学意义（p<0.05）。大量的人群和动物模型研究显示，IL-6、TNF-α和IL-1β等炎症因子在维持UC慢性炎症反应中发挥重要的作用[26]。因此，CP可能通过抑制DSS诱导的UC小鼠肠组织中促炎因子TNF-α、IL-6和IL-1β的表达从而减轻炎症反应的严重程度。

2.5 CP对结肠炎小鼠结肠组织中NF-κB信号活化的抑制作用

核因子kappa B（nuclear factor-kappa B，NF-κB）是一类细胞核转录调节因子，其在炎症、应激反应、细胞分化和增殖以及细胞凋亡过程中都发挥重要作用[27,28]。同时，在UC患者结肠黏膜中，存在着NF-κB p65的高表达[29]，NF-κB信号通路激活后，诱导其下游炎症因子（如TNF-α、IL-6和IL-1β）的转录和表达，并促进这些炎症因子迁移、黏附及与肠上皮细胞(IECs)的相互作用[30-32]。观察CP对结肠炎小鼠结肠组织中NF-κB的活化影响，结果如图5所示。每个泳道代表一只小鼠，每组选取了三只不同的小鼠，与正常对照组相比，模型组小鼠结肠组织中NF-κB p65蛋白S536位点的磷酸化水平增高了4.00倍（p＜0.01）；与模型组相比，低、高剂量CP组小鼠结肠组织中NF-κB p65蛋白S536位点的磷酸化水平分别下降了0.62倍和2.07倍，差异具有统计学意义（p<0.05）；同时，NF-κB p65总蛋白的表达水平在各组之间的差异无统计学意义。Park等[33]已经发现，NF-κB p65蛋白S536位点的磷酸化可能会增强蛋白质之间的相互作用，从而影响二级结构的构象变化激活NF-κB p65，活化后的p65经过核转位最终介导靶基因的转录，从而直接或间接的调控炎症因子的表达。IκB是调节NF-κB活性的重要蛋白，而IκBα是IκB蛋白家族中最常见的成员，Wang等[34]的研究表明，几乎所有IκBα磷酸化修饰都促进NF-κB活化，同样，IκBα的去磷酸化对于抑制NF-κB的激活至关重要。本实验结果发现，与正常对照组相比，模型组小鼠结肠组织中IκBα蛋白的磷酸化水平增高了2.12倍（p＜0.01）；与模型组相比，低、高剂量CP组小鼠结肠组织中IκBα蛋白的磷酸化水平分别下降了1.69倍和2.19倍，差异具有统计学意义（p<0.01）；同时，IκB总蛋白的表达水平在各组之间的差异无统计学意义。综上所述，CP可能通过抑制NF-κB p65信号通路的活化，进一步减少相关促炎细胞因子的分泌，从而减轻DSS诱导的UC炎症反应。

3 结论

UC的临床治疗效果不佳，容易反复发作，而且具有多种副作用，CP含有许多生物活性化学物，虽然其抗炎机制还不是十分清楚，但是其抗炎和无毒副作用的优点决定了其用作UC治疗药物的前景。综上所述，本实验发现CP可以显著抑制UC引发的体重减少和结肠缩短、减轻肠黏膜组织损伤破坏和炎性细胞浸润，降低促炎细胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的表达水平，其减轻炎症的机制可能与抑制NF-κB p65炎症信号通路有关。上述研究为深入探索UC的发病机制及制定UC患者营养支持策略提供了一定的理论基础。