新疆小枝玫瑰醇提物对脂肪酸诱导的HepG2细胞脂质蓄积的改善作用

候欣启，王秋雨，陈立格,3，马红梅*，兰卫*

（1.新疆医科大学中医学院,新疆乌鲁木齐 830017）（2.新疆医科大学药学院,新疆乌鲁木齐 830017） （3.江苏省盐城市第一人民医院，江苏盐城 224000）

随着经济和生活水平逐年提高，国人的生活方式、饮食结构和运动状况也在发生重大变化。这些年来，我国代谢性疾病的患病率居高不下，非酒精性脂肪性肝病（non-alcohol fatty liver disease，NAFLD）、高脂血症（hyperlipidemia，HLP）、糖尿病、代谢综合征、肥胖症等占比持续增加。中国已经成为是世界上NAFLD人数最多的国家，患病率为29.2%，NAFLD干预治疗和药物研发工作紧急而重要[1]。NAFLD是一种与胰岛素抵抗相关的代谢应激性肝损伤的疾病，它也是糖尿病和心血管等疾病进程的危险因素之一，严重危害公众健康[2-5]。高脂血症是人体内脂代谢及转运异常导致血清中脂质水平异常的一种代谢性疾病，是NALFD和心血管疾病等的重要致病因素[6,7]。截止目前，市面上还未出现针对NALFD的药物，患病群体之庞大和临床需求之迫切使得NAFLD的药物研发成为热点[8]。对于改善人体血脂水平或者改善肝脏脂变性等，临床上常用他汀类药物进行干预，他汀类药物可引起横纹肌溶解或增加糖尿病患病风险，因此开发具有降血脂功能的疗效安全可靠的天然药物显得十分必要[9]。

新疆小枝玫瑰（Branchlets Rosa rugosaThunb.）是紫红花重瓣玫瑰（Rosa rugoeaThunb.）的亚种玫瑰。新疆小枝玫瑰主要分布在新疆和田地区，因其光照充沛，无霜期长，生长于沙漠边缘等地理环境，故玫瑰精油产量和品质均优于其他玫瑰，被誉为“液体黄金”[10,11]。新疆小枝玫瑰属国家药典收载品种[12]，其制剂玫瑰花口服液、玫瑰花糖膏已作为单方制剂收载于《国家卫生部药品标准（维吾尔药分册）》。小枝玫瑰是玫瑰花其中一种的分支，系药食两用植物，其味甘，性温，具有疏肝解郁，活血化瘀调经之功效[13]。在新疆南部，小枝玫瑰花在民间常常作为餐桌上各类食材的配料，它们被制作为玫瑰花茶、玫瑰花馕、玫瑰花酱、各类民族风味甜品的馅料等。新疆小枝玫瑰的活性成分有总黄酮、多糖、多酚和挥发性成分等[14]。课题组前期研究表明[15-19]，小枝玫瑰提取物具有很好的降血脂、降血糖和抗氧化作用，实验结果显示，小枝玫瑰醇提物、水提物、总多酚等均可显著改善高脂血症大鼠的肝脏脂肪变性和血清脂质生化指标。新疆小枝玫瑰具有降低高脂血症大鼠血脂作用，但具体降脂机制不明确，且尚未开展体外细胞层面的机制研究。本实验以新疆小枝玫瑰醇提物为对象，通过建立HepG2细胞体外脂肪酸负荷模型，研究小枝玫瑰醇提物对细胞内脂质蓄积的影响，完善小枝玫瑰醇提物对脂质代谢影响研究的基本数据，为开发新疆小枝玫瑰作为治疗NALFD、高脂血症等相关疾病的药物提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

小枝玫瑰醇提物（依照前期课题研究[20]，小枝玫瑰总黄酮提取工艺：50%乙醇，料液比1:16，采用紫外分光光度法测定总黄酮纯度为29.02%。课题组成员对小枝玫瑰醇提物进行液质联用分析，其主要成分为二水槲皮素、木犀草素、鞣花酸、黄酮没食子酸、没食子酸等18种化学成分）；HepG2细胞系，上海细胞库；DMEM高糖培养基、胎牛血清（FBS）、双抗（青霉素-链霉素溶液）、0.25%胰蛋白酶溶液，美国Gibco公司；二甲基亚砜（DMSO）、噻唑兰（MTT）、油红O染液、油酸（OA）、棕榈酸（PA），美国Sigma公司；25 cm2细胞培养瓶、96孔板和6孔板，美国Corning公司；牛血清蛋白（BSA），Biofroxx公司；磷酸盐缓冲液（PBS），美国Hyclone公司；甘油三酯（TG）检测试剂盒，中生北控公司；非诺贝特胶囊，法国利博福尼制药公司；ACOX1多克隆兔抗体、CPT1A多克隆兔抗体，北京博奥森生物技术有限公司；PPARα单克隆鼠抗体，武汉三鹰生物技术有限公司；GAPDH多克隆抗体，Affinity生物科学公司。

1.2 主要仪器设备

MultiskanGo酶标仪、PowerPacTMHC电泳仪、BIO-RAD蛋白显色仪（ChemiDOC MP全自动成像系统），美国Bio-Rad公司；SW-CJ-2F超净工作台，美国Airtech公司；371型直热式CO2恒温培养箱，美国Thermo scientific；5424R低温高速离心机，德国Eppendorf公司；IX73荧光倒置显微镜，日本Olympus公司；IMS-300制冰机，美国Scotsman公司。

1.3 试验方法

1.3.1 细胞培养[21]

取HepG2细胞用含1%青霉素-链霉素溶液，10%胎牛血清的DMEM完全培养基接种于25 cm2无菌培养瓶中，在5% CO2培养箱中，37 ℃饱和湿度培养，荧光倒置显微镜下观察细胞密度。细胞正常生长后，可继续实验。

1.3.2 HepG2细胞体外脂肪酸负荷模型的建立

1.3.2.1 FFAs造模液对HepG2细胞活力的影响

参考文献方法[22]，按油酸:棕榈酸=2:1的比例进行混合，即可将其制成2.0、1.5、1.0、0.5、0.25 mmol/L的脂肪酸造模液。取HepG2细胞接种至96孔板培养24 h，设立空白组、对照组、不同浓度FFAs（0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L）诱导细胞，每组设立6个复孔，干预24 h后，每孔分别加入10 μL MTT溶液，孵育4 h，加250 μL的DMSO溶解，用酶标仪测定490 nm波长处的OD值，确定脂肪酸造模液对HepG2细胞活力的影响[23]。

1.3.3.2 油红O染色确定脂肪酸造模浓度及细胞内脂质蓄积情况

参照油红O染液说明书，按体积比油红O染液:蒸馏水＝3:2配制工作液，避光操作，双层中性滤纸过滤，即得。细胞在6孔板培养24 h后，分别加入不同浓度FFAs（0、0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L）诱导细胞，37 ℃培养箱孵育24 h，加入组织细胞专用固定液固定细胞，PBS洗2次，油红O孵育30 min，PBS洗2次，60%异丙醇脱色，PBS洗2次，镜下观察细胞内脂质蓄积情况，拍片记录[24]。参照1.3.3.1的安全浓度，同时结合各组油红O染色结果，确定脂肪酸最佳造模浓度。

1.3.3 确定小枝玫瑰醇提物的安全浓度[23]

HepG2细胞培养24 h（96孔板，接种密度为5×104cells/mL），设立空白对照组、小枝玫瑰醇提物组（稀释储备液至50、100、200、400、600、800 μg/mL），加入不同处理组样品，继续培养24 h后，每孔加入10 μL MTT溶液，培养4 h，弃上清，加DMSO 100 μL，酶标仪测定490 nm波长的OD值，计算细胞存活率，确定小枝玫瑰醇提物的安全浓度。

1.3.4 小枝玫瑰醇提物清除HepG2细胞脂肪堆积实验[25]

1.3.4.1 油红O染色及细胞内脂质含量的测定

HepG2细胞接种到24孔板培养24 h，设立空白对照组（DMEM完全培养基）、模型组（1.5 mmol/L FFA）、非诺贝特组（1.5 mmol/L FFA+100 μmol/L非诺贝特）、小枝玫瑰醇提物组（1.5 mmol/L FFA+50 μg/mL，1.5 mmol/L FFA+100 μg/mL，1.5 mmol/L FFA+200 μg/mL），每组设立4个复孔，干预24 h，然后按1.3.3.2方法进行油红O染色，镜下观察脂滴大小及数量，拍片记录。

按上述方法处理后，加60%异丙醇脱色，PBS清洗，用100%异丙醇溶解，490 nm处测得吸光度值。

1.3.4.2 细胞内TG含量测定

将HepG2细胞接种到培养瓶中，37 ℃，5% CO2培养24 h，按上步方法分组并加入不同浓度药物干预24 h后，常规细胞消化步骤操作，离心后得细胞沉淀，弃上清，加细胞裂解液（RIPA:PMSF=100:1），用TG试剂盒方法测定细胞内TG的含量。

1.3.5 Western Blot检测各组PPARα、ACOX1、CPT1A蛋白的表达

参考BCA蛋白定量试剂盒方法测定蛋白浓度[26]。根据10% SDS-PAGE凝胶快速制备试剂盒说明书制胶，等量蛋白样品（上样量统一为10 μL），电泳结束后，电转至PVDF膜上。5%脱脂奶粉封闭，一抗孵育过夜。二抗室温孵育50 min，电化学发光（ECL）显色拍照，GAPDH为内参。

1.4 统计学处理

利用SPSS 25.0软件对实验数据进行统计学分析。数值以¯x±S表示，多组间比较采用单因素方差分析和LSD法统计。p<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果与讨论

2.1 小枝玫瑰醇提物对HepG2细胞存活率的影响

以小枝玫瑰醇提物为研究对象，评价在24 h内，小枝玫瑰醇提物（0、50、100、200、400、600、800 μmol/L）对HepG2细胞活性的影响，结果如图1所示。不同浓度的小枝玫瑰醇提物处理HepG2细胞24 h后，与正常组细胞相比较，当干预浓度小于等于200 μmol/L时，细胞存活率高于95%，保持着良好的生长活性；但当干预浓度为400、600 μmol/L和800 μmol/L时，与空白对照组相比，HepG2细胞存活率显著下降（p<0.01），细胞存活率已低于70%。本实验中为了避开小枝玫瑰醇提物本身对细胞造成抑制作用，后续药物干预实验采用的梯度浓度为（50、100、200 μmol/L）。

2.2 FFAs诱导HepG2细胞建立体外脂肪酸负荷模型

2.2.1 不同浓度FFAs对HepG2细胞活性的影响

采用饱和或者不饱和FFAs孵育细胞建立脂肪堆积模型（脂肪酸负荷模型）是目前NAFLD的体外研究普遍采用的方法，以HepG2细胞最为常见。如图2所示，本实验借助MTT法考察FFAs在24 h内对HepG2细胞存活率的影响，分别设置浓度为0、0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L。实验结果显示随着FFAs浓度的增大，HepG2细胞存活率逐渐加大，直到1.5 mmol/L时细胞的存活率仍处于90%以上，细胞活性良好；而当达到2.0 mmol/L时，与空白对照组相比细胞存活率大大降低（p<0.01）。因此FFAs的造模的安全浓度小于等于1.5 mmol/L，最终造模的浓度的选择还需结合参考不同浓度FFAs诱导HepG2细胞的油红O染色结果。

关于HepG2细胞用FFAs造体外脂肪酸负荷模型，不同的文献[27-29]中造模浓度（0.5、1.0、1.5 mmol/L）不尽相同，为了保证本次实验结果的准确可靠，对FFAs的浓度进行考察，并得到安全浓度范围（0～1.5 mmol/L）。

2.2.2 不同浓度FFAs干预HepG2细胞后脂滴形成情况

如图3所示，正常组（图3a）HepG2细胞大多呈短梭形或菱形，结构完整，形态规则，分布均匀，生长状态良好，胞浆内无明显脂滴，边界清晰。FFAs诱导的各组细胞，随着FFAs浓度的增加，有不同程度的脂变性，倒置显微镜下观察可见各组细胞形成了不同程度的红色脂滴；在浓度为0.25 mmol/L至1.5 mmol/L时（图3b～3e），随着FFAs浓度增大，红色脂滴数量开始逐渐增加并呈现连续排列成环状，常常围绕在细胞核周围；但当FFAs浓度增大2.0 mmol/L时，脂滴融合，界限不清，排列无序，乃至出现细胞破损状况。由图2的结果可知细胞在FFAs浓度为2.0 mmol/L时存活率低于70%，影响了细胞正常生长。因此，为了实验结果的准确可靠，结合图2的MTT结果和油红O染色形态学指标，最终选择1.5 mmol/L的FFAs作为HepG2细胞脂肪堆积模型的造模浓度。

2.3 小枝玫瑰醇提物对FFAs诱导HepG2细胞脂质蓄积和TG的影响

2.3.1 小枝玫瑰醇提物对脂肪堆积HepG2细胞内脂质蓄积的抑制作用

本实验中用油红O染色定性和定量的表征小枝玫瑰醇提物对HepG2细胞脂肪堆积模型脂滴的影响。油红O染色已经成为研究动物组织和细胞中脂质代谢的常规定性和半定量的分析方法[30,31]，半定量的方法有些是借助图谱ImageJ软件对各组细胞的平均光密度分析或是异丙醇溶解油红O后在490 nm处测定OD值各组进行比较分析。油红O染色和细胞TG含量测定评估细胞脂质积累的经典指标[32]。

各组细胞油红O染色结果如图4所示，与正常组相比，模型组细胞中显示大量红色脂滴，成串珠样或者脂滴融合为不规则形状，肉眼可见脂变程度明显。随着小枝玫瑰醇提物浓度的增加（50、100、200 μg/mL），细胞内红色脂滴数量大大减少，脂变性状况得到缓解（图4d～4f）。与模型组相比，阳性药非诺贝特组和小枝玫瑰醇提物高、中、低浓度组的脂滴数量和密度均显著减少，细胞内脂滴融合情况减少，这表明阳性药物组和各给药组均能不同程度地对抗FFAs诱导的肝细胞的脂肪堆积，抑制细胞内脂滴的形成。如图5所示，细胞内脂质含量：模型组细胞为1.12（OD值），正常组细胞为0.10（OD值），两组相比，差异显著（p<0.01）；随着小枝玫瑰醇提物浓度的增加，HepG2细胞内脂质含量呈现逐渐下降的趋势。与模型组相比，阳性药组（OD值为0.88）和小枝玫瑰低中高剂量组（OD值分别为0.84、0.75、0.71）的细胞内脂质含量均明显减少（p<0.01）；当小枝玫瑰醇提物浓度达到200 μg/mL，细胞内脂质含量降低了36.61%。这说明小枝玫瑰醇提物具有清除细胞脂肪累积的能力，能够显著缓解FFAs诱导细胞内脂质蓄积。

2.3.2 小枝玫瑰醇提物对FFAs诱导细胞内TG含量的影响

肝脏是脂肪酸代谢的中枢器官，通过复杂而精确调控生化、信号和细胞通路来控制脂质稳态的中心器官。肝脏发生着众多的生理生化和代谢反应，肝脏的细胞类型有很多种，其中肝实质细胞，也是我们常说的肝细胞是其中最重要的细胞类型之一，它是多种生化反应和代谢（如：糖脂代谢）场所。脂肪酸在细胞和血液中常常以TG的形式存在，而TG的合成贮存和代谢转运等常常在肝细胞中进行[33]。肝细胞可从血液中摄取脂肪酸，也可以通过脂肪从头合成过程而产生。脂肪酸的消除形式有两种，一是组装到极低密度脂蛋白（very low density lipoprotein，VLDL）中分泌出到血液中而消除，一是在细胞内通过氧化分解而消除。VLDL的蛋白组装和功能关系到TG能否顺利转出肝细胞[34]。肝细胞内TG的含量是检测NAFLD脂变性的重要指标。

关于玫瑰提取物的动物实验，有研究报道[18]，玫瑰花多酚可以降低高脂血症大鼠血清TG水平，同时显著改善高脂血症大鼠肝脏脂肪变性，抑制脂肪酸合成酶的形成，但在此研究中并未开展对大鼠肝脏TG的检测和机制研究，只是形态学指标上观察到玫瑰多酚可以改善肝脏脂肪变性。另有研究指出[15]，玫瑰黄酮提取物可改善高脂血症大鼠血脂四项指标并抑制单核细胞趋化因子1的表达，研究结果显示，大鼠血清TG水平，模型组TG含量4.98 mmol/L显著高于玫瑰黄酮高剂量组TG含量3.25 mmol/L（p<0.05）。本课题组前期发现[16,17]：动物实验结果显示，小枝玫瑰水提物和醇提物对四氧嘧啶糖尿病小鼠均有降血糖作用，同时可改善小鼠糖耐量；体外实验，小枝玫瑰醇提物可抑制α-葡萄糖苷酶活性（其IC50为11.35 μg/mL），其抑制活性超过阳性药阿卡波糖（其IC50为15.92 μg/ mL）。这些研究表明，玫瑰提取物对于糖代谢和脂代谢均有非常好的调节作用，为开发小枝玫瑰醇提物对糖脂代谢类疾病的研究奠定了基础。

小枝玫瑰醇提物对FFAs诱导细胞内TG含量的影响，结果如图6所示，模型组TG含量为0.53 mmol/L极显著高于正常组TG含量0.05 mmol/L（p<0.01）；随着小枝玫瑰醇提物浓度的逐渐增加，与模型组相比，小枝玫瑰各浓度组细胞内TG含量显著减少（p<0.01），中浓度组TG含量降低了49.06%，低浓度组TG含量降低了47.17%；当小枝玫瑰醇提物为200 μg/mL时，细胞内TG含量降低至0.21 mmol/L。与模型组TG含量（0.53 mmol/L）相比，阳性药非诺贝特组TG含量（0.29 mmol/L）明显降低（p<0.01）。在本实验中，小枝玫瑰醇提物能够显著降低FFAs诱导细胞内TG和脂质含量，改善肝细胞内脂质蓄积情况。

2.4 小枝玫瑰醇提物对FFAs诱导的HepG2细胞PPARα通路蛋白表达的影响

肝脏脂肪酸代谢失衡导致肝细胞内TG的过度积累。代谢相关脂肪性肝病表现为TG以脂滴的形式在肝细胞中异常蓄积，肝脏脂肪变性严重可发展为NASH、肝硬化和肝癌。肝脏脂质异常沉积，大多是因为脂肪酸β氧化不足或脂质合成过度导致，受损肝细胞的PPARα失去了对下游参与脂质合成、脂肪酸氧化等相关靶基因调控作用[35-37]。脂肪酸氧化分解代谢过程，根据脂肪酸链的长短不同，发生场所不同，主要是在线粒体和过氧化物酶体中进行。脂肪酸氧化发生的关键酶是CPT1A和ACOX1。PPARα是一种通过调控其下游靶基因CPT1A和ACOX1来发挥影响脂肪酸氧化的[38]。机体PPARα的异常会导致脂质代谢的紊乱，从而引发脂代谢障碍等相关疾病，如：非酒精性脂肪肝、高脂血症、心血管疾病等。在生理条件下，人们通过饮食摄入的脂肪酸可在细胞内转换为脂酰辅酶A，然后再进入线粒体中氧化分解释放能量，以便机体利用。脂酰辅酶A由于分子量较大，不能直接进入线粒体，此时需要和肉碱结合促进其转运，CPT1A是催化脂酰辅酶A结合的酶，因此其含量的高低直接决定长链脂肪酸是进入线粒体还是存储于胞质[39]。在脂肪酸进入线粒体后，β氧化酶系之一ACOX1又在其中占有重要地位，有文献报道ACOX1-/-小鼠表现出脂肪性肝炎、肝脏H2O2水平升高，广泛的自发性过氧化物酶体增殖的增加，证明了ACOX1在PPARα生理调节功能中的必不可少的作用[40]。脂肪酸氧化代谢通路在抗肝脏脂变性研究中显得尤为重要。

鉴于前期实验中发现小枝玫瑰醇提物对FFAs诱导的HepG2细胞中TG的改善作用显著，我们选择研究从脂肪酸氧化代谢途径探究小枝玫瑰醇提物。因此在本实验中，我们考察了脂肪酸β-氧化的关键蛋白PPARα及其下游的ACOX1、CPT1A。如图7所示，与正常组相比，模型组细胞PPARα、ACOX1、CPT1A的蛋白表达明显下调（p<0.01）。与模型组相比，小枝玫瑰醇提物中、高浓度组的PPARα、ACOX1的蛋白表达显著上调，中浓度组（p<0.05），高浓度组（p<0.01），呈现剂量依赖性；小枝玫瑰醇提物低、中、高浓度组的CPT1A的蛋白表达显著上调，低浓度组（p<0.05），中、高浓度组（p<0.01），呈现剂量依赖性；阳性药非诺贝特组PPARα、ACOX1、CPT1A的蛋白表达明显上调（p<0.05）。此外，实验结果发现，小枝玫瑰醇提物不同剂量组对于HepG2细胞中相关蛋白表达水平的影响同样呈现浓度依赖性。

本文研究显示，FFAs孵育HepG2细胞建立的脂肪酸负荷模型，模型组细胞的脂肪酸分解代谢相关蛋白PPARα、CPT1A和ACOX1的表达显著下调。这表明，HepG2细胞中脂肪酸的积累可能导致肝脏脂肪酸氧化分解途径受阻或影响相关的代谢通路，使得肝细胞中脂质蓄积，脂变性严重。经小枝玫瑰醇提物干预后后，PPARα、CPT1A和ACOX1的表达均升高，提示小枝玫瑰醇提物可通过上调PPARα及其转录靶基因CPT1A和ACOX1的蛋白表达水平，促进肝细胞内脂肪酸β-氧化，在一定程度上减轻肝细胞脂质累积。

3 结论

本实验以小枝玫瑰醇提物为原料，以FFAs诱导HepG2细胞建立体外脂肪堆积模型，研究了小枝玫瑰醇提物对FFAs诱导HepG2细胞脂肪变性的改善作用及相关作用机制。小枝玫瑰醇提物通过激动PPARα信号通路，上调了PPARα的表达，并上调了由其调控的下游CPT1A和ACOX1的表达，促进脂肪酸氧化分解，改善FFAs诱导的肝细胞内脂质蓄积，减少细胞内TG蓄积，进而达到改善NAFLD作用。小枝玫瑰或可成为改善NAFLD的候选植物药，为治疗提供新的选择。