RGB色彩模型在气动微混合芯片中的应用

刘旭玲， 左文思， 刘 威， 王良文， 张段芹， 李松晶

(1.郑州轻工业大学 机电工程学院， 河南 郑州 450002； 2.哈尔滨工业大学 机电工程学院， 黑龙江 哈尔滨 150001)

引言

微混合器是微流控应用中一个重要组件，特别是在生化分析和生物领域需要两个或更多的液体混合[1-2]。在微尺度下，低雷诺数流动处于层流状态，液体混合只能通过自然对流进行。在体积/面积比较小的微流控芯片中，缓慢的扩散混合远远不能满足需求，尤其是在有大分子(比如细胞)需要扩散的场合，实验时间、研究成本、试剂消耗量大大增加，有悖于“绿色环保”的科学实验宗旨[3-4]。为了克服这个问题，目前很多学者对被动和主动的微混合器进行了研究。为了增加不同液体样品的界面接触面积，实现更好的混合，被动混合器利用通道几何形状来折叠流体流[5-6]。这类无源微混合器的缺点是微通道较长和设计结构的较复杂， 在制造过程中容易增加故障率。在微流体网络中，主动混合可以通过多种方法来实现[7-10]。主动式微混合器中一种比较流行的是配置式气动微混合器，它由外部正、负气压驱动[11-12]。HSIUNG等[13]研究了一种新型气动微混合器，利用两对气动侧动壁在动态对称和动态不对称模式下对样品进行混合。但该类气动微混合器结构复杂，封装时容易造成坍塌，且很难操作。

在相对狭小、封闭且操作时间短的微流控芯片上作业，这种环境下混合效果的检测面临很大挑战。在传统方法中，利用人眼根据混合试剂的颜色来判断两种或多种液体试剂的混合效果。该方法受灯光、观察位置、视差和人为感知能力等因素影响，容易造成对结果判断的不精确。利用荧光显微镜获得定量混合效率来获取图像，用数字图像处理技术评估密封微通道网络中的混合效率，缺点是后期处理复杂且设备昂贵。一些学者通过图像中示踪粒子密度指标来反映混合均匀程度，该方法因需要考虑图像中每两个粒子之间的权值和图像灰度差，故示踪粒子密度的计算量较大。而且，利用微珠浓度来反应液体试剂的混合效率不是一种直接、有效、方便的测量方法[14-17]。

本研究提出一种新型基于RGB色彩模型的混合效率量化分析方法，根据数字图像对混合结果进行量化分析。利用高弹PDMS材料和软刻蚀方式对结构简单的气动微混合芯片进行封装，利用两种不同颜色的试剂进行混合实验研究。实验结果表明，这种微混合芯片和混合效率的量化分析方法简单、方便，可用于生物反应、孵化和其它生物化学应用场合。

1 基于RGB色彩模型的混合效率

利用数字电荷耦合设备(CCD)相机来捕捉混合图像的红、绿、蓝(RGB，三种原色)数据，以实现色度测量。通过色彩模型数学模型，可以实现RGB色彩模型向灰度模型的转换。Ri、Gi和Bi分别表示每个像素的三种原色R、G和B值，通过计算其RGB数据的平均值，得到每个像素的灰色数据(Ci)。根据人眼的视觉特征和对原色的敏感度，定义了线性加权平均的权重来补偿敏感度的不均匀性，一般R、G和B分量值得权值分别为0.299、0.587和0.114。该转换模型可以用式(1)来表示，实现RGB色彩空间到灰度空间的转化[18]。

Ci=Ri*0.299+Gi*0.587+Bi*0.114

(1)

混合效率灰度差评价法是根据颜色的分布表示混合效果的方法。利用立体式显微镜采集得到数字图像，对其进行分析处理，根据整个被测区域内图像色彩的偏移量(均匀性)评价混合程度，整幅图像的色彩均匀度通过计算数字图像上每个像素点的灰阶与其它各像素点的灰阶的偏差来表示。例如，CCD图像的像素分辨率为m×n，定义其某一像素(i，j)与另一像素(p，q)之间的灰度偏差Eij用式(2)表示[19]。

p≠i或q≠j

(2)

式中,aij—— 像素(i，j)的灰阶

apq—— 像素(p，q)像素(i，j)的灰阶

Eij—— 像素(i，j)与所有像素点灰度差的加权和，加权因子为距离的倒数

整个图像的总灰度差用式(3)表示[20]。

(3)

混合效率可用以下混合效率指数(混合指数)来量化，用式(4)表示。

(4)

这种根据像素点的RGB值计算图像混合效率的方法直观清晰，但是因为要计算每个像素点与其它像素点的灰度差，因此计算量巨大，一个分辨率为100×100 ppi的CCD照片，乘法计算量可达到107次左右，耗费太多的计算时间。因此，采用简化的灰度偏差来评价混合区域的混合效率。用式(5)和式(6)的计算方法定义了混合效率Imix[21]。

(5)

(6)

式中,N—— 测量区域内的像素点数目

Ci—— 每一个像素点的灰阶

若两液流充分混合，则Imix=1，若完全没有混合，则Imix=0。

2 实验准备

2.1 材料和设备的选取

采用具有高弹易变形特性PDMS材料作为封装微混合器的主要结构材料，相比于其他常见的微流控芯片制备材料，具有许多理想的微制备特性，包括生物相容性、灵活性、透明度和易于封装的优越性[22]。

实验过程中使用的蓝、黄色试剂均采用两种固态水彩颜料和DI水混合而成，质量比为1∶1。固态水彩颜料颗粒细腻，具有水溶解性，试剂颜色较高，有利于观察和采集数字图像。液体水彩颜料具有色彩艳丽、透明高、表现力佳和高耐恒久的稳固特性，常用作微流控混合实验中的有色试剂[23]。

拍照环境为室内环境自然光源下，混合过程和结果由立体显微镜(MA2003A)用CCD摄像机拍摄，拍摄镜头垂直于微混合芯片表面拍摄照片。该显微镜变倍比为1∶6.4，目镜采用WF10X/20 mm，放大倍数为7x-45x。该显微镜照明采用透射光源12V/15W卤素灯，亮度独立可调，且底座配置7W荧光灯。CCD摄像机拍摄后上传到PC机中利用MATLAB图像处理功能进行处理。需要说明的是，在不同的光源强度、照度下，采集的数字图像的RGB值会有微小变化，但是基于图像的混合效率量化分析方法仅与图像像素任意两点之间的灰度差有关系，因此在自然光源下，辅助光源对后期混合效率量化分析影响不大。

2.2 设计和封装

气动微混合芯片结构如图1a所示，把液体溶液a和b分别放置于R1和R2储液区，利用气压驱动液流系统将其泵入液体微流道内。PDMS气压驱动微阀Vp1和Vp2分别控制a、b两种试剂参与混合的量，即当两种液流试剂驱动压力一定时，Vp1驱动腔压力决定了其膜阀阀口开度，从而控制系统中a试剂的流速及流量，同样Vp2驱动腔压力决定系统中b试剂的流速及流量，从而控制a和b试剂质量(体积)比。实际应用中，可根据需要参与反应的量，分别调节Vp1和Vp2驱动腔的压力，以控制不同试剂参与混合的量。

两种溶液在微混合器M中充分混合并反应后，经由蠕动式微泵P泵出，在储液区R3进行收集整理。上层液体微混合腔M设计尺寸为1.0 mm×1.0 mm×0.1 mm，下层驱动腔尺寸为0.8 mm×0.8 mm×0.1 mm，微混合腔和驱动腔的中心位置在空间上重叠放置，进气微流道和进液微流道在空间上垂直，形成对称结构，中间层是40 μm厚PDMS驱动薄膜。图中，黄色代表黄色试剂，蓝色代表蓝色试剂，绿色代表完全混合后试剂，粉色代表气体驱动层。

图1b是PDMS驱动薄膜在一个驱动循环内的运动，开关信号控制PDMS气压驱动微阀Vp打开，黄色和蓝色试剂分别进入液体微流道，然后进入微混合腔。当三通微阀Vt与气源连接的端口打开时，压缩气体进入驱动腔，PDMS驱动薄膜向微混合腔

图1 气动微混合芯片结构及其工作原理示意图

方向运动，促使微混合腔内流体产生对流，加速混合。三通微阀Vt与气源连接端口关闭，驱动腔与大气连接的端口打开，驱动腔内压力降低时，PDMS驱动薄膜形变恢复，挤压出的液体回流到微混合腔内。运行多个循环，微混合腔内两种试剂由于振动产生对流，快速、充分混合[24]。

微混合腔和驱动室的封装尺寸分别为1.0 mm×1.0 mm×0.1 mm和0.8 mm×0.8 mm×0.1 mm，如图2所示，微混合腔与驱动室的中心位置重叠，形成对称结构。与驱动腔连接的气体微通道和与微混合腔连接的液体微通道在空间上垂直，中间层薄膜厚度为40 μm，由匀胶机设置1500 r/min旋涂制备。

图2 封装的PDMS气动微混合芯片照片

采用干膜负光刻胶模具制备具有矩形截面的气动层，带圆弧角的方形微混合腔和带圆弧边缘的微通道可采用正性光刻胶高温回流工艺实现，关于封装过程的详细工艺可以在本课题组之前的研究中找到[25]。

2.3 试剂混合

实验前，用去离子水(DI)水清洗微微流控芯片约10 min，以排出微混合腔内的气泡。利用蓝色和黄色两种明亮而易区分的颜色，进行混合性能实验研究。蓝色液体和黄色液体分别用于代表两种不同的样品试剂。实验研究中，黄色试剂约0.04 μl，蓝色试剂约0.02 μl，通过驱动装置泵入到微混合腔中。根据颜色匹配原理，当蓝色试剂大于黄色试剂时，人眼观察到的混合试剂颜色为灰色，否则为绿色。对微混合腔中两种试剂的混合现象进行观测，需要借助显微镜来观察其变化过程。试剂注入和混合过程的图像经由MA2003A体视显微镜的光路放大后，由高速图像采集系统CCD感应混合动态目标光线生成数字图像，传输给计算机，经由存储处理平台完成数字图像数据的合成并动态存储，为混合效率的量化提供试验数据。

3 实验结果和讨论

利用图像采集系统采集黄色和蓝色试剂分别充满微混合腔的数字图像，并利用图像处理软件Adobe Photoshop中的颜色拾取器工具或仿真软件MATLAB中的数据提取点工具，提取其每个像素点的RGB值。后续处理的数字图像是通过CCD线性相机的成像装置放大后拍摄，其放大倍数为30倍。获取图像过程中应根据实际光线效果调整CCD参数，

以实现正确的自动曝光、聚焦和白平衡等。CCD数字图像分辨率为每英寸96个像素点，测量区域数字图像包含1104×1098个像素点。向微混合器的微混合腔内充入一定比例的黄和蓝色试剂，自然对流情况下，观察微混合腔内两种不同颜色试剂的混合情况，如图3a所示，颜色强度的变化过程表示样品混合的过程。根据显微照片的颜色，可以看出在自然对流条件下25 min时还没有完全混合。驱动腔压力为0.01 MPa，采用振动混合方式，气动微混合芯片振动频率设置为2 Hz，振动混合过程显微照片如图3b所示。人眼观察微混合腔图片时，在5 s时混合试剂颜色几乎接近于统一，说明微混合腔内两种试剂接近于完全混合，即溶剂在经历5次振动后几乎完全混合。

图3 微混合腔内自然对流混合和振动混合图片对比

因为试验条件有限，图片中会显示出设备棱角、反光和有制造瑕疵的地方，这些原因造成的色差会给混合效率的计算带来背景性误差。因此，读取测量区域图片的RGB值后，应去除上述具有瑕疵的像素点后，再进行混合效率的计算，以减小计算误差。利用式(1)至式(6)计算混合效率，为了减少计算量，在CCD数字图像中每隔5个像素点提取一个像素点进行混合效率计算。如图4所示，计算得到自然对流混合条件下，25 min时试剂总体混合效率为68.75%，在上述振动混合试验条件下，5 s时试剂总体混合效率为94%，从量化的混合效率对比结果看出，振动混合器在5 s时的混合效率高于自然对流条件下25 min时的混合效率。

图4 微混合腔内试剂自然对流混合和振动混合量化结果比较

与目前通常用来测定微混合器混合效果方法——PH检测法、荧光粒子示综法和染色对比法相比，基于数字图像的混合效率量化分析方法简单直接，仅需要根据混合过程中图片的颜色变化即可判断密闭微混合腔内流体流动及混合情况，进而评定微混合芯片性能的优劣。

4 结论

设计了一种结构简单、封装容易的PDMS气动微混合芯片，给出了基于RGB色彩模型的混合效率量化分析方法，对微混合腔内蓝、黄试剂充分混合，并与自然对流混合效率进行对比。研究结果表明，基于数字图像的混合效率量化分析方法简单有效、方便可行，且该PDMS气动微混合芯片能够满足大多数需要混合应用场合的需求。相对现有的微混合芯片，该设计结构简单且易于实现，为未来微流控试剂混合技术提供了研究基础。此外，由于基于图像的混合效率量化分析方法仅与图像像素的RGB值和相邻两点之间的灰度差有关系，因此该方法不仅适用于两种不同颜色试剂混合，也适用于多种颜色试剂混合。

可通过流体仿真软件进一步研究微混合腔的质量流动特性，通过研究其质量流动特性来获得合适的驱动空气压力和驱动频率和优化PDMS薄膜厚度和微混合腔的深度，进一步提高混合芯片上不同试剂的混合效率。