miR-451在雌激素诱导大鼠乳腺增生中的作用机制研究*

张洁妤，曹 飞，陈春香，王 敏，何云岩，邓仕标，余 婷

(南昌大学抚州医学院，江西 抚州 344000)

乳腺增生症又称为乳腺结构不良症，是乳腺组织增生及退行性变，与内分泌功能紊乱密切相关，是中年女性最常见的乳腺疾病，常表现为乳房疼痛和(或)乳腺触及结节，严重时影响女性正常工作和生活。有研究表明，乳腺增生可使患者罹患乳腺癌的风险增加2～5倍。乳腺增生的发病机制错综复杂，对其分子机制的研究多集中于内分泌激素紊乱方面[1-2]，在基因水平，特别是非编码RNA对其发生、发展影响方面的研究很少见。本研究检测了微小RNA(miR)-451基因及雌激素受体(ER)、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)在大鼠乳腺增生组织中表达的差异，探讨了miR-451与乳腺增生发生、发展的相关性，旨在为临床治疗提供新思路。

1 资料与方法

1.1资料

1.1.1研究对象 2020年6月选取20只大鼠作为研究对象。采用随机数字表法将其分为乳腺增生组和对照组，每组10只。

1.1.2主要试剂与仪器 黄体酮注射液购自浙江仙琚制药股份有限公司(规格：1 mL含黄体酮20 mg)，苯甲酸雌二醇注射液购自上海通用药业股份有限公司(规格：1 mL含雌二醇2 mg)，Trizol购自美国英杰生命技术有限公司，定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒购自日本TaKaRa公司，逆转录试剂盒购自美国英杰生命技术有限公司，聚偏氟乙烯电转膜购自美国默克密理博公司，丙烯酰胺购自美国Amresco公司，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自美国欧米伽生物科技公司，脱脂奶粉购自中国北大荒完达山乳业股份有限公司，曝光用显影粉/定影粉购自中国天津市鑫洋医疗器械有限公司，电泳仪购自中国北京六一仪器厂，移液器购自德国艾本德公司，PCR 扩增仪购自美国赛默飞世尔科技公司，生物安全柜购自中国苏州安泰空气技术有限公司，7500实时定量PCR仪购自美国赛默飞世尔科技公司，Western-blotting仪购自中国上海天能科技有限公司，UVP-GDS8000 凝胶成像系统购自美国斯博明科学器材公司。

1.2方法

1.2.1造模 乳腺增生组大鼠采用雌、孕激素序贯法造模，按体重0.5 mg/(kg·d)于大鼠后肢后外侧肌内注射苯甲酸雌二醇，每天1 次，左右交替，连续注射25 d，继而改用黄体酮注射5 mg /(kg·d)，每天1 次，连续注射5 d。对照组大鼠肌内注射生理盐水每只0.1 mL，每天1 次，连续注射30 d。

1.2.2标本采集 处死2组大鼠后分别切下10 g乳腺组织，经生理盐水处理后放置-80 ℃冰箱中保存备用。

1.2.3定量RT-PCR检测 使用RNA 提取试剂盒提取总RNA，在逆转录反应体系下进行逆转录，体系条件设定：16 ℃、30 min，42 ℃、30 min，75 ℃、15 min，4 ℃保存。将miR-451反转录为第一链cDNA，再以反转录得到的第一链cDNA为模板实施PCR扩增：引物10 pmol/L；95 ℃变性10 min，95 ℃、15 s；60 ℃、1 min，40个循环。内参为U6，并按以下公式计算拷贝数：目标基因△循环数(Ct)值=目标基因Ct值-同一样本 U6 Ct值。目标组的△Ct为平均值减去其对照的平均△Ct值得到每个目的基因相对Ct值(△△Ct值)，即△△Ct为目标基因=处理组△Ct值，即目标基因-对照组△Ct值目标基因。基因相对表达量采用2-ΔΔCt方法计算。△Ct=Ct miR-451-Ct U6，△△Ct= (Ct miR-451-Ct U6)乳腺增生组-(Ct miR-451-Ct U6)对照组。

1.2.4Western-blotting检测 取标本碾磨后按常规方法提取总蛋白，在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺蛋白上样缓冲液。沸水浴加热3～5 min，以充分变性蛋白。冷却到室温后将蛋白样品直接上样至十二烷基硫酸钠-聚丙稀酰胺胶加样孔内。经聚丙烯酰胺凝胶电泳处理后转移至聚偏二氟乙烯膜上，放置于预先准备好的洗涤液中，漂洗1～2 min，以洗去膜上的转膜液。用5%脱脂奶粉封闭1 h，结合一抗过夜后用缓冲液清洗3次，每次5 min，加入二抗室温孵育2 h，用缓冲液清洗3次，每次5 min，加入ECL显色剂，压片曝光、显影，经Quantity one软件扫描后进行灰度分析。

2 结 果

2.12组大鼠乳腺组织miR-451表达比较 对照组大鼠乳腺组织miR-451表达量是乳腺增生组大鼠的1.75倍。见表1。

表1 miR-451基因PCR扩增结果

2.22组大鼠乳腺组织ER、Cyclin D1、Bcl-2 蛋白表达比较 乳腺增生组大鼠乳腺组织ER、Bcl-2蛋白相对表达明显高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)；2组大鼠乳腺组织Cyclin D1蛋白相对表达量比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 2组大鼠乳腺组织ER、Cyclin D1、Bcl-2蛋白表达比较

2.3miR-451与ER、Bcl-2蛋白表达的相关性 miR-451与ER、Bcl-2蛋白表达呈明显负相关(r=-0.87、-0.79，P<0.05)。

3 讨 论

作为育龄女性常见疾病之一，乳腺增生增加了患者罹患乳腺癌的风险，同时，随年龄增加发生恶变的风险也随之增加。当前，我国人口结构老年化趋势日益严重，乳腺癌发病风险居高不下，特别是在一些经济发达地区，乳腺癌已位居女性恶性肿瘤发病首位。因此，从分子水平阐述乳腺增生的发病机制、探讨新的治疗靶点、积极给予早期干预对降低乳腺增生的恶化具有积极意义。

miRNA是一类内生的、长度为20～24个核苷酸的非编码单链小分子RNA，其在细胞内具有多种重要的调节作用。目前为止，已被发现的miRNA超过1 000种，其可通过与靶基因的不完全配对，抑制靶向基因的表达，从而间接参与细胞代谢、增殖、分化、凋亡等过程[3-4]。

ALTUVIA等[5]在2005年最早提取了miR-451，其位于染色体17q11.2，与原癌基因ERBB2区域相邻。有研究发现，miR-451可能参与了调控恶性肿瘤细胞[6-8]、增生性瘢痕成纤维细胞[9]、增生型糖尿病视网膜[10]等增殖。如WANG等[11]在对非小细胞肺癌的研究中发现，miR-451能显著抑制RAB14蛋白的表达，而RNA介导沉默RAB14的表达能呈现出miR-451抑制肿瘤生长的作用，修复RAB14的表达后miR-451的抑癌作用将部分消失。巢海潮等[12]研究表明，膀胱癌组织中miR-451表达量明显低于正常膀胱组织，同时，其表达与膀胱癌患者临床分期及病理分级密切相关。

本研究以miR-451为导向，探讨了其对乳腺增生上皮细胞ER、Cyclin D1、Bcl-2的影响，旨在为更好地了解乳腺增生发病机制提供参考依据，结果显示，乳腺增生组大鼠乳腺组织miR-451表达量明显低于对照组，ER、Bcl-2蛋白相对表达量均明显高于对照组。黄君华等[13]通过病例对照研究也发现，ER在乳腺增生患者体内表达量升高。ER的高表达在ER信号传导机制中也具有非常重要的作用，作为雌激素核受体，ER通过直接或间接方式与特异DNA位点——雌激素反应元件(ERE)结合而发挥转录效应。ERE具有2个反向的回文基序PUGGTCA 。ER以ER-或ER-同二聚体或ER-/ER-异二聚体形式与ERE结合。ER结合的亲和力及特异性取决于基序的序列和空间结构。除通过ERE直接传递信号外，ER更多的是作为辅激活因子与其他结合DNA的转录因子(AP1、SP1等)相互作用来调节转录。此外，有研究发现，ER与细胞外信号调节激酶、内皮型一氧化氮合酶的表达均存在关联性，并在乳腺增生的发生、发展中具有关键作用[14-15]。

Bcl-2蛋白家族位于细胞内膜系统中，已发现25种Bcl-2家族同源蛋白，其成员中有些促进凋亡，如Bad 、Bid 、Bax 等，有些成员阻止细胞凋亡，如Bcl-2、Bcl-x、Bcl-w等。Bcl-2能阻止细胞色素C从线粒体释放至细胞质，从而抑制了细胞凋亡[16-18]。焦丹等[19]通过观察性研究发现，无腋窝淋巴结转移的乳腺癌患者Bcl-2阳性表达率明显高于有腋窝淋巴结转移者。刘云等[20]采用半定量法检测了Bcl-2在直肠癌中的表达，结果显示，Bcl-2蛋白表达与肿瘤分化程度、TNM分期、术前血清癌胚抗原水平、淋巴结转移有关。本研究结果显示，乳腺增生组大鼠乳腺组织Bcl-2蛋白表达量明显高于对照组，提示高表达Bcl-2蛋白可能抑制乳腺上皮细胞凋亡，从而间接促进乳腺上皮细胞增生。因此，miR-451可能通过调控ER表达进而影响ER信号传导，并调控Bcl-2蛋白表达从而抑制乳腺组织细胞凋亡，诱导乳腺增生的发生、发展。本研究下一阶段计划培养大鼠乳腺上皮细胞进一步通过使用miRNA转染技术使miR-451过表达，应用反义寡核苷酸技术抑制miR-451表达，探讨miR-451对大鼠乳腺上皮细胞形态和凋亡的影响，为阐述乳腺增生的发生、发展提供科学依据。