“脾主肌肉”与“线粒体质量控制”相关性研究*

文颖娟 陈茉 赵欢 陈丽娟 王江

(陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046)

重症肌无力(Myasthenia gravis，MG)主要是由抗体介导的获得性神经-肌肉接头传递障碍的自身免疫性疾病，以眼肌或全身肌无力为主要临床表现，研究表明，乙酰胆碱受体(acetylcholine receptor，AchR)抗体是MG发病的关键[1]，据统计，MG全球患病率为(150～250)/百万[2]，我国MG发病率为0.68/10万，各个年龄段均可发病，儿童及青少年MG患病高达50%[3]。临床主要采取胆碱酯酶抑制剂、免疫抑制剂、补体抑制剂、生物制剂等药物治疗手段[4]，虽在一定程度上缓解患者临床症状，但长期服药患者易出现股骨头坏死、肝肾功能损害、内分泌系统失衡以及精神障碍等一系列不良反应，且部分患者会诱发MG危象，危及生命。

MG以全身肌肉病变为主，属于中医“痿证”范畴。基于“脾主肌肉”，痿证虽有痰浊、水湿、瘀血等浊邪堆积，却以脾虚为发病之本；线粒体是机体的动力工厂，MG虽以过量AchR抗体堆积以病理表现，而其深层次机制可能以线粒体功能失常为主。故统一于“痿证”与MG 的“脾-肌肉-线粒体”密切相关，而线粒体功能失常，可能取决于线粒体质量控制(Mitochondrial quality control，MQC)，既有其形成的源头如骨骼肌干细胞异常，又有其自身的融合与裂解、自噬与修复等的复杂因素影响。故线粒体质量控制的多样性决定了中医学“痿证”的发病围绕脾虚可能有丰富的内涵，故围绕“脾-肌肉-线粒体质量控制”的研究指导MG临床可能更有针对性。

1 基于“脾主肌肉”的前期研究为“脾-肌肉-线粒体质量控制”奠定了坚实基础

1.1文献研究显示葛根具有输肌以散邪与升精以濡养机体之功 脾胃为人体气血生化之源。“脾主肌肉”，是指全身肌肉的运动变化均与脾的脏腑功能变化密切相关，肌肉运动来源于脾所化生的精微物质，故肌肉运动失常可通过调理脾胃功能而得以缓解甚至治愈。中医归经理论指出，某种药物对某些脏腑经络的病变起主要或特殊作用，而对其他脏腑经络则作用较少，故中医临床常以归脾胃经药物来调理脾胃功能。我们前期文献研究表明：归脾胃经药物葛根，具有祛邪(如解肌、生津、退热、透疹等)和扶助正气(升精、止渴)的双重功效[5-6]。

基于“脾主肌肉”理论，葛根祛邪(和扶正)功能发挥的靶点可能在肌肉，而本草书籍对于葛根解肌升津之功效早有记载，如《药类法象》载：“葛根，治脾胃虚而渴，善解酒毒，通行足阳明脉经之药”；《本草乘雅半偈》载：“葛根，作用部位在肌分；解广义之痹，诸痹、诸毒、阴气不起皆为痹。”同时肌肉遍布全身，葛根通过输肌以散邪(即促进肌肉的运动以祛除浊邪)，亦可升发脾气、布散精津，为全身肌肉提供能量，而其配伍不同可能作用不同，且作用于平滑肌、心肌等不同肌肉部位[5-7]。

1.2实验研究显示葛根随配伍不同，作用于不同的肌层 鉴此，课题组立足“脾主肌肉”，结合对“线粒体”研究，分别探讨了葛根与黄芩、黄连等配伍对结肠平滑肌的作用，葛根与瓜蒌、薤白、丹参等配伍对心肌作用的实验研究，研究结果显示：葛根能够促进胃肠平滑肌运动，治疗溃疡性结肠炎效果明显[8-9]；葛根及其配伍可通过调节心肌线粒体功能，改善心肌纤维化，治疗糖尿病心肌病[10-13]。

1.3基于“脾-肌肉-线粒体”，葛根及其配伍可作用于重症肌无力骨骼肌线粒体 葛根是否作用于骨骼肌？重症肌无力是以骨骼肌的运动失常为主，中药葛根既能够升发脾气以输布津液，又可输散以调节肌肉的运动变化，是否能够作为重症肌无力治疗的主药?现代名老中医周仲瑛[14]、裘昌林[15]、李声岳[16]等均以葛根为主配伍治疗重症肌无力，均为开展以葛根为主治疗重症肌无力研究提供有力佐证。

故此，课题组以MG为切入点，针对MG病机以脾气不足，生化乏源，无法濡养肌肉，导致肌肉运动无力的虚证为主；又兼见脾胃升清降浊失常，引起湿热、瘀血等浊邪壅滞(如MG中AchR-Ab的过度增加)之实证，以既有升发脾气布散津液之功，又可输肌以促进肌肉运动的葛根，作为重症肌无力治疗的主药；并针对脾气虚以及瘀血湿热阻滞的病机，则分别与益气健脾的代表药物黄芪、活血化瘀的代表药物丹参以及治疗痿证的四妙散配伍，发挥益气升阳，发挥利湿活血或益气输肌，利湿活血之功效。

实验结果显示[17-23]，脾为肌肉提供气血，线粒体为肌肉提供能量，脾与线粒体密切相关，即“脾-肌肉-线粒体”相关，而基于“脾主肌肉”理论，归脾胃经药物葛根实质作用于肌肉线粒体发挥作用，葛根及其配伍通过减少骨骼肌乙酰胆碱受体抗体的堆积和增强骨骼肌线粒体功能而发挥其治疗作用，其对线粒体的作用是通过调控骨骼肌成纤维细胞生长因子(FGF)、神经生长因子(NGF)、胰岛素样生长因子(IGFs)，进而改善EAMG大鼠骨骼肌线粒体结构与功能。而线粒体作用的增强，也会缓解甚至降低乙酰胆碱受体抗体的堆积，促进神经肌肉接头部位传导正常，缓解MG,故线粒体作用失常是MG 发病的关键。

1.4基于“脾-肌肉-线粒体质量控制”，葛根及其配伍治疗重症肌无力的深层次机制可能为保证线粒体的源头与活力 痿证病本在于脾气虚，难以化生气血濡养肌肉；运化无力，产生痰浊、水湿、瘀血等浊邪堆积，进一步阻滞气血输布，肌肉运行所需气血乏源，影响肌肉运动。基于MG与痿证，脾气虚是其病机之本，骨骼肌线粒体作用失常是MG发病的关键，而线粒体作用失常的调控是基于线粒体质量控制，包括如何形成优质的线粒体，以及如何保证优质线粒体充满活力。故结合肾为后天之本，肾主骨，可针对MG骨骼肌无力以填精益髓，在前期葛根及其配伍基础上，增加熟地填精益髓，与黄芪配伍，发挥其升发脾阳、滋养肌肉的作用，而其配伍也体现了调动脾肾之先后天之本，使气血生化有源，也使优质线粒体生成有源，并保持优质线粒体持续活力。以此，葛根及其配伍对重症肌无力的深层次机制可能是以保障线粒体质量控制为主(见图1)，而线粒体质量控制的具体内涵分析也是研究的前提。

图1 葛根及其复方配伍对线粒体调节示意图

2 恢复骨骼肌干细胞再生修复功能是形成优质线粒体的基础

MG是以骨骼肌功能失常为主，骨骼肌由大量的肌纤维束组成，其功能的维持取决于肌纤维再生能力。肌纤维再生则有赖于(Muscle stem cells，MSCs)的自我更新、高度增殖与肌源性分化[24]。有研究表明，当新生肌肉组织出现异常，将导致肌肉干细胞在数量和功能上存在明显缺陷，出现进展型肌退化或肌萎缩现象[25]。

因此，骨骼肌干细胞再生修复是MG治疗的关键，而MSCs的生长发育受多种因素调控，多种信号因子和生长因子参与其中(见图2)。以恢复骨骼肌干细胞再生修复功能为前提，重建受损骨骼肌线粒体结构和功能，实现恢复骨骼肌线粒体质量的目标。

图2 骨骼肌卫星细胞再生修复过程

2.1Myod和Pax7动态变化保护正常MSCs增殖，保障骨骼肌再生修复 肌肉转录调节因子(myoblastdetermining，Myod)是反应肌肉细胞再生的主要指标[26]，实验研究证实，当肌肉出现损伤后，MSCs启动Myod基因，肌卫星细胞进入增殖状态；上调Myod蛋白表达，能够促进肌卫星细胞增殖，发挥保护骨骼肌正常功能的作用[27]。

Pax7作为一种成肌性诱导物，随着Pax7的表达下降，骨骼肌干细胞逐渐失去干性，进而转变为成肌细胞[28]，这对于骨骼肌的发育、再生和修复具有至关重要的意义。同时，Pax7能够通过促进Myod降解，降低Myod的表达，保护正常MSCs增殖、保障骨骼肌再生修复[29]。但对其影响机制尚未完全明确。

2.2P38MAPK、AMPK信号通路相互调节MSCs再生修复 作为调控骨骼肌线粒体的重要通路之一，P38MAPK信号通路通过参与成肌细胞分化，实验研究发现，废用性肌萎缩的大鼠骨骼肌中P38MAPK的蛋白表达显著低于正常组，调节P38MAPK信号通路，有效调控大鼠骨骼肌卫星细胞，保障线粒体正常功能，增加肌肉总量[30]。

腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)作为调节细胞能量代谢的开关，研究证实，其不仅能够有效刺激线粒体自噬发生，清除受损线粒体，保障线粒体能量供给，改善MG症状，同时通过调控自噬-溶酶体途径发挥维持骨骼肌质量，缓解肌萎缩的重要作用[31]。

3 动态调节线粒体质量控制是保障优质线粒体功能的核心

近几年来，随着对线粒体认识的不断深入，发现线粒体作为动态细胞器，在人体生长、运动、饥饿、炎症、缺氧等刺激作用下，能够通过线粒体融合/分裂，线粒体自噬、线粒体生物合成的协同调控，形成一个高度动态的可塑性网络，限制和延缓功能受损线粒体的积累，维持线粒体数量、形态和功能的动态平衡[32]，实现线粒体质量控制。

线粒体质量控制，存在正向和逆向两个对立统一方面，是发挥线粒体正常生理功能的核心，是维持细胞内线粒体稳态的重要机制[33]。不仅包含线粒体的新生，同时包含对损伤或衰老线粒体的清除，主要包括线粒体生物合成、线粒体动力学、线粒体自噬、细胞内钙调节四个方面[34-36](见图3)。

图3 线粒体质量控制调节示意图

3.1PGC-1α和NRF的协同表达促进线粒体生物合成 线粒体生物合成是增加细胞中线粒体质量的过程，通过维持线粒体正常功能保障线粒体质量控制[37]。需要包括过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1(peroxisome proliferator-activated receptorγcoactivator-1，PGC-1α)和核呼吸因子(nuclear respira-tory factor，NRF) 在内的多种因子协同表达[38]。

PGC-1α作为调节骨骼肌线粒体生物发生的主控基因，能够引发胞浆中钙离子浓度升高，并通过激活钙调素依赖的蛋白激酶(CaMK)和钙神经素响应基因，参与线粒体生物合成等多种生物过程[39]。

NRF-1作为线粒体基因特异性转录因子，在细胞核与线粒体通讯中发挥关键作用[40]，通过调节转录因子NRF-1与共激活剂PGC-1α相互作用，将有助于细胞核和线粒体呼吸基因的表达[41]，改善骨骼肌线粒体生物发生，维持骨骼肌线粒体正常功能，保障线粒体质量控制。

3.2通过相关蛋白对线粒体分裂与融合的调节促进线粒体动力学正常表达 线粒体正常情况下，能够通过快速和可逆的分裂融合过程，完成从小圆形细胞器到巨大管状结构的转变，这一动态过程称为线粒体动力学[42]。它与细胞代谢、增殖、凋亡等各种生物学功能密切相关。若线粒体动力学失调将导致多种疾病发生。骨骼肌高度依赖线粒体动力学维持正常功能[43]，线粒体融合与分裂是对骨骼肌能量代谢的一种适应性快速应答。实验研究发现，MG患者外周血单个核细胞存在分裂过度化，出现线粒体形态缩短，线粒体动力学异常现象[44]。

3.2.1Drp1与Fis1相互作用促进线粒体分裂 动力相关蛋白1(dynamin-relatedprotein 1，Drp1)驱动线粒体分裂，实验研究表明[45-47]，抑制Drp1的活性不仅抑制线粒体分裂，同时阻碍细胞色素C(cytochrome C，CytC) 和细胞凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor，AIF) 依赖的线粒体凋亡途径。

在哺乳动物细胞中线粒体分裂蛋白1(Mitochondrial fission protein 1，Fis1)和 Drp1 相互作用，在维持线粒体完整性方面发挥重要作用[48]。Romanello等[49]通过实验研究证实，过表达Drp1或Fis1 将导致肌肉萎缩，而通过抑制骨骼肌线粒体分裂在一定程度上能够降低肌萎缩现象。

3.2.2Mfn1、Mfn2与Opa1共同参与调节线粒体融合 线粒体融合主要受线粒体融合蛋白1/2(mitofusion 1 /2，Mfn1/2)、视神经萎缩蛋白1(optic dominant atrophy 1，Opa1)调控。Opa1作为线粒体内膜重构决定性因子之一，与Mfn1共同参与线粒体内膜融合并维持嵴形态。实验研究发现，在后肢废用模型中线粒体融合基因Mfn1/2、Opa1基因表达显著降低，小鼠骨骼肌横叠面积下降[50]，证实线粒体融合与分裂在调控骨骼肌和肌肉质量中发挥十分重要的作用。缺失Mfn1/2、Opa1将干扰线粒体的融合过程，导致正常线粒体功能受阻，影响线粒体的质量。综上，线粒体分裂可控制线粒体数目、调节线粒体凋亡途径、介导细胞自噬，防止损伤线粒体的过度堆积；而线粒体融合则能够在保障线粒体内容物、调节线粒体嵴形态等方面发挥保障线粒体正常功能的作用，两者相互影响，双向调节，起到保障线粒体质量控制的作用。因此，在线粒体质量控制中起主导作用。

3.3PINK1/Parkin通路与线粒体外膜蛋白 FUNDC1协同介导线粒体自噬 从分子机制上来讲，线粒体质量控制不但涉及分子水平上单个蛋白质的降解、合成和基因转录，同时包含在整个细胞器上线粒体的降解与新生[51]。而线粒体自噬(Mieap-inducedvacuole，MIV)作为一种选择性自噬，能够在应激条件下通过选择性清除受损或功能障碍的线粒体，完成识别去极化损伤线粒体，保障细胞内环境稳定，是线粒体质量控制的核心[52]。

PINK1/Parkin信号通路，作为介导骨骼肌线粒体自噬的主要途径，在修复或清除损伤线粒体方面发挥重要价值[53]。线粒体外膜蛋白FUN14结构相关蛋白1(FUN14 domain-containing protein 1,FUNDC1)在调节骨骼肌线粒体质量以及机体代谢稳态维持中同样起着至关重要的作用。当敲除小鼠骨骼肌特异性线粒体外膜蛋白FUNDC1，可以导致 LC3介导的线粒体自噬受阻，影响线粒体 ATP 能量生成，导致骨骼肌脂肪酸利用率下降[54]。

因此，通过调节线粒体自噬清除损伤线粒体，防止异常线粒体的过度堆积，从而保障线粒体质量控制，对于恢复MG骨骼肌线粒体具有重要意义。

另外，Mieap(Mitochondria-eatingprotein)作为一种新型分子，能够通过介导线粒体自噬，即细胞自噬选择性地清除受损线粒体[55]。若 Mieap 对线粒体的修复或清除受损，则可能导致大量异常线粒体堆积。

3.4调控细胞内钙离子浓度以维持线粒体跨膜电位正常 线粒体除产生ATP外，也是细胞钙(Ca2+)的主要储存中心。通过调控细胞内钙离子浓度，能够防止炎性因子过度表达，维持线粒体跨膜电位正常，提高ATP活性，恢复细胞线粒体正常功能，是线粒体质量控制的有效保障之一。实验研究发现，脾气虚MG患者外周血淋巴细胞线粒体膜电位水平明显降低(P<0.01)[56]。细胞内离子浓度无法保持平衡，影响细胞能量代谢受损。为从亚细胞分子水平上治疗MG提供了强有力的理论基础[57]。

综上，本研究在前期“脾-肌肉-线粒体”研究基础上，从MG病理以线粒体功能失常为关键点，基于“脾主肌肉”，结合中医学“痿证”以脾虚为本、虚实夹杂的病机特点，延伸研究“脾-肌肉-线粒体质量控制”，而线粒体质量控制源于骨骼肌干细胞，受制于线粒体自身动态调节，故探讨葛根及其配伍可能通过两个层次调节线粒体质量，治疗重症肌无力：

其一，在形成更多优质线粒体层面，从骨骼肌干细胞为切入，通过Myod与Pax7动态调节以及P38 MAPK、AMPK信号通路激活，保护正常MSCs增殖，保障骨骼肌再生修复，使优质线粒体生成有源；其二，在线粒体自身动态调节层面，以线粒体生物合成、融合与分裂、自噬以及细胞内钙调节为主，形成线粒体活力的高度动态的可塑性网络，保证优质线粒体充满生机。