基于矿质元素指纹分析的陈皮产地溯源研究

李富荣，刘雯雯，文 典，徐爱平，李 蕾，陈永坚，陈楚国，王 旭,

（1.广东省农业科学院农业质量标准与监测技术研究所，广东广州 510640；2.农业农村部农产品质量安全风险评估实验室（广州） ，广东广州 510640；3.广东农科监测科技有限公司，广东广州 510640）

陈皮为芸香科柑橘属植物橘（Citrus reticulataBlanco）及其栽培变种的成熟果皮，经特定方法干燥并陈放后制成[1−2]。陈皮作为我国著名的传统中药，在广东、福建、四川、重庆、浙江等地均有大规模的生产，可分为广陈皮、闽陈皮、川陈皮等，其中以广陈皮的质量最优最为出名，而广陈皮的主产区为广东新会[3]。陈皮中富含黄酮类物质、挥发油类、柠檬苦素类、生物碱类、果胶多糖等多种生物活性成分，在理气健脾、和胃止呕、燥湿化痰等方面具有良好的疗效，是不可多得的药食同源佳品[4−6]。陈皮因产地不同而功效存在极大的差异，其中广陈皮因其独特的柑橘品种、气候、水土及传统制作技艺使其优于其他品种陈皮，而独具道地药材的特色，为“十大广药”之一，具有很高的市场价值[7−9]。而目前市场上存在较多以普通陈皮冒充广陈皮销售的情况，使消费者权益受到损害。因此，研究能将广陈皮与来自其他产地的陈皮进行鉴别区分的有效方法从而实现陈皮的产地溯源非常必要[10−11]。

为对不同产地来源的陈皮进行有效鉴定和区分，目前从陈皮有机代谢成分的角度开展了较多研究，包括对挥发油[2,10]、总黄酮和多糖等[6]，并利用高效液相色谱（HPLC）指纹图谱技术进行广陈皮与普通陈皮中挥发性物质成分的对比分析[7,9]，为陈皮的产地溯源提供了较好的参考依据。但是，受加工、贮藏过程中的影响，一些可用于产地溯源和确证的成分极容易受到损失，会造成利用该技术进行陈皮产地溯源时出现有效信息丢失和溯源效果不佳等问题[12]。而陈皮作为植物源食品，其植物生长过程所需要的矿质养分主要是从其产地土壤中吸取，所以某一产区的陈皮中矿质元素含量与其产地土壤的矿质元素含量存在极强的相关性，植物矿质元素的含量和种类可以作为一个重要的溯源指标[13−14]。而基于此理论的矿质元素指纹分析技术具有高灵敏度和分析速度快等优点，能有效避免基于有机成分的指纹溯源技术带来的上述弊端。在植物生长过程中，矿质元素作为植物自身无法合成的一类基本组成成分，通常是由植物从生长环境中的土壤、水、大气中摄取而进入植物体内参与各项生命活动，所以不同植物体内的矿质元素含量与其产地环境中的元素组成密切相关[15−16]。而不同地域的矿质元素组成和含量存在一定差异，因此不同产地来源的植物体内矿质元素组成特征也会有所不同[17]，这一规律为利用植物矿质元素分析用于农产品产地溯源研究提供了极大的可能[18−19]。矿质元素指纹分析技术成为了各种植物源性和动物源性食品产地判别的有效方法，已被广泛用于谷物[20]、豆类[21]、茶叶[22]、葡萄酒[23]、肉鸡[24]、蜂蜜[25]等的产地溯源。近年来，矿质元素指纹分析用于中药材的产地溯源方面得到了广泛应用，对准确判别其原产地和道地药材提供了很好的技术支撑[26−29]，但有关陈皮的相关研究尚未有报道。

本研究针对广东和福建、重庆三个不同产地的陈皮样品，利用电感耦合等离子体发射光谱法（inductively coupled plasma atomic emission spectrometer，ICP-AES）和电感耦合等离子体质谱法（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS），同时测定陈皮中的多种常量、微量元素及稀土元素，开展不同产地陈皮矿质元素指纹分析，并筛选出具有显著差异的元素作为其产地鉴别指标，结合化学计量学进行陈皮产地区分。该研究成果可为陈皮产地溯源提供科学方法和理论依据，对提高陈皮的整体质量和市场监管水平具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

陈皮 于2019~2020 年间收集三个不同产地的陈皮样品共计206 份，其中产自广东（新会）的样品105 份，福建样品52 份，重庆样品49 份；元素测定标准溶液为多元素混合标样Muti-element Solution 1和Muti-element Solution 2 美国SPEX Certi Perp公司；内标溶液：1 μg·mL−1的Rh 溶液 美国Agilent公司；高纯硝酸、高氯酸 德国赛默飞世尔公司；水为经Millipore Milli-Q 水处理系统处理后的去离子水。

ICAP 6300 Duo 电感耦合等离子体发射光谱仪 美国Thermo Scientific；Agilent 7900 电感耦合等离子体质谱仪 美国Agilent 公司；DigiBlock ED54石墨消解仪 美国LabTech 公司；Millipore Mill-Q水纯化系统 美国Millipore 公司；TLE104 万分之一电子天平 瑞士Metter Toledo 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品制备 所有陈皮样品置于烘箱中50 ℃烘干24 h 左右，使样品粉碎时不粘壁，然后经充分研磨后过60 目筛备用。

1.2.2 矿质元素含量测定

1.2.2.1 矿质元素测定类别 对陈皮中的32 种矿质元素进行测定，包括大量元素钾（K）、磷（P），中量元素钙（Ca）、镁（Mg），人体必需微量元素铁（Fe）、铜（Cu）、锌（Zn）、锰（Mn）、钴（Co）、铬（Cr）、钼（Mo），人体可能必需微量元素钒（V）、镍（Ni）、硼（B），其他微量元素锂（Li）、铍（Be）、铅（Pb）、砷（As）、锶（Sr）、钛（Ti）、锑（Sb）、钍（Th）、铀（U），稀土元素镝（Dy）、钆（Gd）、钪（Sc）、镧（La）、钕（Nd）、镨（Pr）、钐（Sm）、铈（Ce）和钇（Y）。

1.2.2.2 矿质元素检测方法 元素含量检测是依据《食品安全国家标准 食品中多元素的测定》（GB 5009.268-2016）、《食品安全国家标准 植物性食品中稀土元素的测定》（GB 5009.94-2012）和《植物性食品中稀土元素的测定 电感耦合等离子体发射光谱法》（NY/T 1938-2010）等标准，并适当加以调整改进。

1.2.2.3 矿质元素检测过程 称取待测陈皮样品约0.2 g（精确至0.001 g），置于干净的聚四氟乙烯消解管中，加入8 mL 浓硝酸+高氯酸混酸（4:1），加盖后冷消化4~8 h，然后置于石墨消解仪中开始升温消解[30]。设置三阶升温程序为：100 ℃ 0.5 h—150 ℃1 h—210 ℃ 2.0 h，至消化液清亮无色并伴有白烟即判定为消化的终点，即可关闭电源停止加热，10 min后开盖沿管壁加入8 mL 2%硝酸，加盖后利用余温回流0.5 h。消解完全后将消解管取出冷却至室温，随后将消化液转移至25 mL 比色管中，用2%硝酸分三次冲洗消解管内壁，将洗液并入比色管，最后定容至混匀，同时做空白对照。再分别用电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）和电感耦合等离子体发射光谱法（ICP-AES）待测。

1.2.2.4 仪器参数设置条件 等离子体气流量为15 L·min−1，载气流量0.8 L·min−1，氦气流量4 L·min−1，雾化室温度2 ℃，样品提升速率0.3 r·s−1。ICPAES 参数设置为：射频功率1.150 kw，等离子氩气流量22 L·min−1，辅助气流量0.5 L·min−1，冷却气流量18 L·min−1，泵速50 r·min−1，进样速率2.0 mL·min−1，进样延迟15 s，清洗时间10 s，读数时间30 s，采用垂直观测方式。

1.2.2.5 检测过程质量控制 元素标准曲线配制溶液采用混合标样Muti-element solution 1（稀土元素）10 mg·L−1以及Muti-element solution 2（常规元素）10 mg·L−1。其中，K、P、Ca、Mg 这4 种元素用ICPAES 测定，采用标准曲线定量法定量，其加标回收率为93.5%~105.2%，检出限低于0.1 mg·kg−1；其他元素均用ICP-MS 测定，其加标回收率为86.3%~112.5%，微量元素检出限低于0.01 mg·kg−1，稀土元素检出限（μg·kg−1）分别为Sc 0.6、Y 0.3、La 0.4、Ce 0.3、Pr 0.2、Nd 0.2、Sm 0.2、Gd 0.1、Dy 0.08。

1.3 数据处理

实验数据的预处理采用Excel 2010 进行分析。将206 份样品按比例（80:20）划分为训练集（166 份样品，包括广东样品81 份，福建样品45 份，重庆样品40 份）和测试集（40 个样品，包括广东样品24 份，福建样品7 份，重庆样品9 份）。其中，训练集用作差异性分析和建立模型，测试集用作验证模型的有效性。采用SPSS 25.0 软件对独立样品进行方差分析和非参数检验，以P＜0.05 置信水平下评估不同产地陈皮样品之间元素组成差异的显著性。采用SPSS 25.0 进行线性判别分析（Linear discriminant analysis，LDA），并用SIMCA 14.1 进行主成分分析（Principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘法判别分析（Orthogonal partial least-squares discrimination analysis，OPLS-DA）[31]。在LDA 和OPLS-DA 之前，将数据进行标准化处理，以平衡元素含量的差异。

2 结果与分析

2.1 陈皮矿质元素含量差异及组成特征

通过对166 份陈皮样品中32 种矿质元素的含量进行多重比较分析，结果发现（表1），除大量元素P、中量元素Ca、微量元素Cr、Ni、Li 和稀土元素Sc 以外，其他26 种元素含量在广东与另外两个产地之间的差异显著（P＜0.05)）。而微量元素Co、B、Be、Sb，以及稀土元素Gd、La、Nd、Pr、Sm、Ce、Y 等11 种元素在广东省、重庆和福建省三个不同产地陈皮中存在显著的差异（P＜0.05）。其中，B 和Sb 元素含量在三个产地中的大小顺序为重庆>福建>广东；而其他9 个元素含量的大小顺序为福建>重庆>广东。这11 种元素在广东产地的含量均为最低，另外两个产地的含量是其1.4~18.1 倍，Be 和Sb 两种元素在各产地之间相差最大。通常来说，土壤中矿质元素的种类和丰度具有地理性质特异性，而土壤矿质元素特性直接影响植物矿质元素含量[15−17]。近年来，利用不同产地来源的植物中矿质元素组成的差异性进行区域特色农产品或道地药材的产地溯源已被证明有广泛的应用价值[32−33]。硼是植物所必需的微量元素，我国土壤硼含量有由北向南，由西向东逐渐降低的趋势，广东、福建土壤是全硼和有效态硼都偏低的典型区域，重庆作为我国西部内陆地区，硼含量相对丰富[34]，与本研究中不同产地陈皮中B 含量规律一致。稀土元素长期以来并不被认为是植物生长的必需元素，但这些元素很容易从土壤转移到植物体中[35]，稀土元素可作为植物产地鉴别的有效指标[22]。福建稀土资源丰富，储量位居全国第三位，使得三个不同产地陈皮中福建陈皮稀土元素含量往往较其他产地陈皮含量更高。

表1 不同产地陈皮中矿质元素含量（mg·kg−1）Table 1 Contents of mineral elements in tangerine peel from different producing areas (mg·kg−1)

2.2 陈皮矿质元素含量的主成分分析

主成分分析（PCA）是通过原始变量的少数几个线性组合来解释原始变量的绝大部分信息，并寻求主成分来研究样本的一种方法，是通过综合的方式把样品中多种元素的信息直观地表达出来，目前在农产品溯源技术中被广泛运用[36]。将PCA 应用于三个不同产地陈皮中32 种元素的分析数据后，发现前4 个主成分的累积方差贡献率为70.0%（表2）。在PCA 得分图中，不同形状的点指示不同产地来源的陈皮样品（图1）。基于PCA，陈皮样品可根据其来源进行初步聚类。主成分1 能将广东陈皮与产自福建、重庆的陈皮区分开，而主成分2 能将福建陈皮和重庆陈皮进一步区分开。分析各主成分的主要变量对分类的贡献，变量绝对值越大，对某一成分的贡献越大，由图2 可见，其中第1 主成分的主要变量包括Dy、Sm、Gd、Pr、Nd、Y、La、Fe、Be、V、Ce，主成分载荷图表明稀土元素含量对第1 主成分的贡献最大，进一步证实稀土元素作为陈皮产地溯源有效判别指标的可行性[37]；第2 主成分的主要变量包括Sc、Co、P、Y、La、Be、Nd、Mo、As、Pb、B 等元素，而稀土元素Sc、微量元素B、Co 和大量元素P 对第2 主成分的贡献最大。

表2 主成分分析特征值及方差贡献率Table 2 Principal component analysis eigenvalue and variance contribution rate

图1 第1、2 主成分分析的各陈皮产地得分图Fig.1 Score plot of the first and two principal component for each producing area of dried tangerine peel

图2 陈皮中各元素前两个主成分载荷图Fig.2 Loading plot of the first two principal components of each element in dried tangerine peel

2.3 陈皮矿质元素含量的判别分析

植物体内的矿质元素含量通常取决于其生长环境，因此不同产区同一植物之间在矿质元素含量方面存在着一定差异[38]。上述矿质元素含量的差异揭示了不同产地的陈皮确实存在差异，但不足以对陈皮产地进行准确判别，为了实现对不同产地陈皮的产地溯源判别，分别采用线性判别分析（LDA）和正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）方法对来自3 个不同产地的陈皮样本进行判别分析。

2.3.1 LDA 判别分析 为进一步验证陈皮中各矿质元素含量指标对其产地判别结果的影响，采用LDA判别分析方法对陈皮样品进行多变量判别分析，以本研究涉及的32 种矿质元素作为判别分析的自变量，从中选出对陈皮产地判别有效的变量，建立判别模型。为验证模型的有效性，采用“留一法”对模型进行原始和交叉验证分析，采用测试集对模型进行外部验证[23]。对测试集样本进行逐步判别分析的结果显示，有21 种对陈皮产地判别显著的元素（包括K、P、Ca、Co、Cu、Mn、Mo、V、Ni、B、Li、Pb、As、Sr、Ti、Th、Gd、Sc、Nd、Pr、Y）被引入到判别模型中，并提取模型前2 个典则判别函数。根据Wilks’ Lambda检验结果进一步证实，在а=0.05 的显著性水平下，2 个函数对分类效果均为显著（图3）。

图3 不同产地陈皮的LDA 得分图Fig.3 Score plot of dried tangerine peel from different producing areas by LDA

LDA 得分图（图3）显示，重庆陈皮通过函数1（粗虚线）与广东和福建陈皮样本明显区分开，广东陈皮样本通过函数2（细虚线）与福建样本明显区分开，来自三个不同产地的陈皮样品形成了三个独立的紧密簇。该判别模型显示出良好的预测能力，在原始分类、交叉验证和外部验证中，分类准确率均为100%（表3）。该判别分析结果表明了K、P、Ca、Co、Cu、Mn、Mo、V、Ni、B、Li、Pb、As、Sr、Ti、Th、Gd、Sc、Nd、Pr、Y 这21 种元素对不同产地陈皮样品具有有效的鉴别力。

表3 基于选定变量的三个产地陈皮样品产地溯源判别分析结果及外部样品验证Table 3 Origin traceability discriminant analysis results and external sample verification of tangerine peel samples from three origins based on selected variables

2.3.2 OPLS-DA 判别分析 对3 个不同产地陈皮样本中的32 种矿质元素含量进行OPLS-DA 分析，利用该方法来区分各产地间元素轮廓的总体差异，并构建判别模型。在OPLS-DA 模型中，R2Y（cum）代表在Y 轴方向上主成分1、2 对变量的解释能力，Q2（cum）表示模型对分组的预测能力[39−40]。分析结果显示，R2Y（cum）和Q2（cum）分别为0.919 和0.902，接近1，说明该OPLS-DA 模型中2 个主成分能有效解释3 个陈皮产区之间的差异，且具有较好的预测性能。

由OPLS-DA 得分图（图4）可见，3 个不同产地的陈皮样本群体形成了明显的聚集。其中，横坐标作为第1 主成分得分，将广东的陈皮样本与福建、重庆的样本明显地区分开来；纵坐标为第2 主成分得分，可以进一步将福建样本与重庆样本区分开。通过VIP 值筛选重要分类变量，其中VIP 值大于1 的有Sc、B、Y、Co、Nd、La、Pr、Be、Gd、Dy、Sm、Mo、Fe 这13 种元素，其中包括5 种微量元素和8 种稀土元素。再利用构建的模型对3 个不同产地的陈皮样品进行原产地判别，结果发现，在交叉验证和外部验证中，分类准确率均达到了100%。由于不同产地土壤和植物的矿质元素组成除了受土壤类型、成土母质、降水、气候等自然因素影响外，还受施肥、农药使用、人类活动排放等人为因素影响，可能会对利用常量矿质元素作为农产品产地溯源判别指标造成误判的风险。而稀土元素在自然界中丰度小，性质稳定，相对而言是利用无机元素指纹分析技术进行农产品产地溯源更为理想的指标[41]。

图4 OPLS-DA 模型第1、2 主成分得分图Fig.4 Score plot of first and second components in OPLS-DA

3 结论

本研究通过分析广东、福建、重庆三个不同产地陈皮的矿质元素组成特征，明确了26 种矿质元素含量在广东与另外两个产地之间存在显著差异，其中Co、B、Be、Sb、Gd、La、Nd、Pr、Sm、Ce、Y 等11 种元素在在三个产地之间存在显著差异。PCA结果明确了基于矿质元素含量可实现不同产地陈皮样品的初步分类，Dy、Sm、Gd、Pr、Nd、Y、La、Fe、Be、V、Ce、Sc、Co、P、Mo、As、Pb、B 这18 种矿质元素含量是关键的陈皮产地区分指标。LDA 结果确定了K、P、Ca、Co、Cu、Mn、Mo、V、Ni、B、Li、Pb、As、Sr、Ti、Th、Gd、Sc、Nd、Pr、Y 这21 种矿质元素含量为陈皮产地的有效判别指标。且该LDA 模型的回代检验和交叉检验的整体正确判别率均达到100%。基于OPLS-DA 建立的判别模型的整体正确判别率也为100%，并确认了Sc、B、Y、Co、Nd、La、Pr、Be、Gd、Dy、Sm、Mo、Fe 等矿质元素含量在陈皮产地判别中发挥了重要作用。结合以上分析，利用矿质元素的指纹分析技术结合多元统计分析方法对陈皮的产地判别有效可行，B、Be、Co、Fe、Mo 和部分稀土元素（如Ce、Dy、Gd、La、Nd、Pr、Sc、Sm、Y）有望作为陈皮产地溯源的重要指标。总的来说，该研究为下一步分析环境因素（土壤、水、肥料等）对陈皮矿质元素指纹信息的影响提供了基础数据；而上述判别模型的建立可用于陈皮原产地识别，对广东新会陈皮地理标志性产品及消费者合法权益的保护提供了有效的技术支撑。