矿质元素指纹技术结合化学计量学分析对中国葡萄酒原产地的判别研究

程文娟，苏颖玥，李潇潇，齐鹏宇，李军，张进杰*

（1. 河北科技师范学院食品科技学院，河北秦皇岛 066004；2. 秦皇岛海关技术中心/河北省葡萄酒质量安全检测重点实验室，河北秦皇岛 066000）

葡萄酒是一种广泛消费的酒精性饮品，其质量与安全问题越发受到人们的关注[1]。据国际葡萄与葡萄酒组织（OIV）全球葡萄酒行业数据统计显示，我国2020年葡萄酒生产量为6.6亿升（位列世界第十），消费量达到12.4亿升[2]。葡萄酒的品质属性与其产地紧密相关，许多国家和地区以生产高质量葡萄酒而闻名[3]。由于优质葡萄酒通常具有较高经济价值，在利益的驱使下，一些不法商贩制假造假，致使市场上存在着大量的低质量高价格的葡萄酒[4]。为维护市场秩序和为葡萄酒产业提供强有力的技术支持，急需开发一种可靠有效的分析技术用于识别、监管和追溯葡萄酒产地信息。

各国学者对产地溯源已进行了一系列探索性研究，主要基于矿质元素指纹、稳定同位素技术和某些特定的次生代谢产物[5]。矿质元素指纹技术因具有灵敏度高、分析速度快、检出限低等优点，目前已被广泛应用于蜂蜜、茶叶、水产、牛肉等[6-9]农产品产地溯源的研究中。近年来，该技术也被众多国家应用于葡萄酒产地鉴别，并得到良好成效。意大利学者Bronzi等[10]发现，运用电感耦合等离子质谱仪（ICP-MS）测定出31种元素，包括主要元素、微量元素和超痕量元素，结合偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）可以有效区分基安蒂产区与意大利其他产区的葡萄酒。葡萄牙学者Rocha等[11]研究表明，Ca、Li、Mn、Co、Zn、Br、Sr、Cd、Ba、W和Tl元素的浓度在葡萄牙6个不同地理标志保护产区（PGI）的葡萄酒中存在显著差异，因此可以对来自不同PGI的葡萄酒进行有效鉴别。Yamashita等[12]评估了12种化学元素在阿根廷、巴西、法国和西班牙4个国家的111个起泡葡萄酒样品的种类及含量，结果表明仅利用K、Li、Mn元素的分类准确率可达100%。

目前，我国虽已经出台葡萄酒地理标志产品保护规定，并建立了产品质量安全可追溯制度与产品追溯和查询系统，但相比于传统葡萄酒生产国家，我国葡萄酒的产地鉴别技术仍处于起步阶段。本文采用ICP-MS对来自于我国5个产区（东北、贺兰山东麓、黄土高原、新疆及西南高山）共205款原产地葡萄酒样品中的Li等28种矿质元素进行测定，讨论我国5个产区葡萄酒中的多元素自然特征，并结合化学计量学方法对葡萄酒的产地进行鉴别，建立判别模型并验证，旨在为我国葡萄酒产地溯源系统的建立和完善提供技术和数据参考。

1 材料与方法

1.1 样品准备

为了尽量减少酿酒工艺对葡萄酒中天然矿质元素的影响，试样为不经过澄清和陈年的2010—2014年份的葡萄酒。新疆产区（乌鲁木齐、五家渠、昌吉、伊犁哈萨克及石河子）、贺兰山东麓产区（青铜峡、银川、乌海、石嘴山及镇北堡）、黄土高原产区（铜川、泾阳、蓝田、乡宁、襄汾及鸣条岗）、西南高山产区（西昌、攀枝花、迪庆、弥勒、盐井）葡萄酒样品多为‘赤霞珠’‘美乐’；东北地区葡萄酒样品多为‘北冰红’‘威代尔’，每个产区酒样数量分别为43、57、21、45和39款。有部分样品使用两种以上葡萄品种进行混酿。所有样品酒发酵完成后自然澄清，罐装于750 mL酒瓶中，置于4 ℃冰箱保存备用。样品开启后立即进行测定，3次重复。同一产区葡萄酒样品做统一代码标记：贺兰山东麓（HL）、新疆（XJ）、西南高山（YCZ）、东北（DB）及黄土高原（HT）。另以相同方式收集并保存3个模型外样品（DB、XJ、YCZ），供模型检测使用。

1.2 试剂及仪器

MOS级硝酸：北京化学试剂研究所；超纯水（18.2 MΩ·cm）：美国Millipore公司；Li、Be、Ti、V、Cr、Mn、Co、Ni、Cu、Zn、As、Rb、Sr、Mo、Cd、Sn、Sb、Ba、La、Tl、Pb、Bi、U、Al、Ce、Mg、Cs和Sc 28种元素标准溶液100 mg·L-1，介质为0.5% HNO3、2% HCl及1%HF：加拿大SCP SCICENCE公司。

Perkin Elmer ICP-MS Elan DRC-e电感耦合等离子体质谱仪，配备40.68 MHz自激式射频发生器、Gem Clean TM十字交叉雾化器、Ryton TM高分子惰性材料双通道雾化室：美国Perkin Elmer公司；Lab Tech EHD36电热消解板、消解管：北京莱伯泰科仪器公司；微量移液器：德国Eppendorf公司。

1.3 湿法消解流程

使用微量移液器精确量取5.00 mL样品于消解管中，置于100 ℃电热板上加热驱赶乙醇至1 mL，冷却至室温后加入5 mL HNO3，室温消解3 h，再置于85 ℃电热板上加热30 min，随后150 ℃电热板上蒸发至1 mL，冷却至室温后转入容量瓶，用2% HNO3定容至25 mL，待测。所有消解管及其他玻璃容器使用前均在20% HNO3溶液中浸泡2～3 h，取出后用超纯水冲洗2～3次，烘干后使用。

1.4 ICP-MS仪器条件

仪器预热后经调谐液优化仪器参数，仪器软件推荐校正方程外标法定量，以10 μg·L-1标准溶液Y作为内标。以2% HNO3为介质配置混合标准母液，再以母液为基础分别配置0.25、0.5、1.0、5.0、10.0、50.0 μg·L-1的不同浓度梯度混标溶液，绘制标准曲线。具体仪器条件和运行参数为：射频功率1000 W，等离子气流量15 L·min-1，载气流量0.94 L·min-1，辅助器气流量1.2 L·min-1，透镜电压5.5 V，雾化室温度2 ℃，蠕动泵转速0.1 r·s-1，采样流量0.8 mL·min-1，采样深度8.0 mm。

1.5 数据处理

采用SPSS 24.0软件对数据进行方差分析（ANOVA）、Duncan's多重比较分析、主成分分析（PCA）及线性判别分析（LDA）；SIMCA-P 14.1软件对数据进行偏最小二乘判别分析（Partial Least-Squares Discrimination Analysis，PLS-DA）；Origin 2018软件绘图。

2 结果与分析

2.1 分析过程的质量保证

为保证试验结果的可靠性，在测定实际葡萄酒样品前对所用方法进行方法学验证，表1显示了该分析方法的验证数据。R2均大于0.98，标准液浓度与吸收峰面积呈良好的线性回归关系。酒样RSD在2.4%～4.6%，回收率在78.7%～116.9%。该方法测定的元素回收率和RSD值符合实验需求，仪器条件稳定，可进行实际样品检测。

表1 ICP-MS方法学验证结果Table 1 ICP-MS methodology verification results

2.2 产区元素差异分析

采用Duncan's多重比较，对葡萄酒样品中28种检测元素含量进行方差分析，结果显示（表2），除U元素外，其余27种检测元素的含量在不同产区的样品中存在显著性差异。表3显示，各样品中Mg、Al、Cu、Zn、Mn、Sr、Rb的含量相对较高，且显示出产地差异，其他微量元素的含量也与产地具有一定的差异相关性。葡萄酒中矿质元素含量主要来自于果实从土壤中吸收，土壤本身的元素含量不同，果实对每种元素吸收程度不同及人工施肥等都均会影响酒中元素的自然分布特征。

表2 不同产区葡萄酒中28种元素的含量Table 2 The content of 28 elements in wine from different regions（μg·L-1）

表3 LDA判别结果Table 3 LDA classification result table

2.3 化学计量学分析

2.3.1 主成分分析

主成分分析（PCA）属于无监督性学习，用于降低数据维度，并提取数据主要特征。以PC1和PC2为主成分做图累计方差贡献率达46.6 %，其中PC1和PC2分别解释了总方差的34.2 %和12.4%。以主成分1（方差贡献率为34.2%）和主成分2（方差贡献率为12.4%）为横纵坐标所做得分图和散点图分别如图1和图2所示。由散点图可知，PC1与Li元素呈正相关，而PC2与Sr、Mg、Li、Ti、Mo呈较高程度正相关。由图1所知，两个主成分对5个葡萄酒产区具有不同解释程度，DB产区的葡萄酒样品主要分布在PC1的负半轴，并与其他4个产区的样品显示出明显的不同，这主要是因为DB产区与含量相对较高的元素具有很强相关性，如Mn、Zn、Tl、Sb等。而XJ和HL产区的样品相对更为聚集，它们均与PC1和PC2正半轴更相关，这与XJ和HL产区样品中Li的含量较高有关。YCZ的葡萄酒样品多与PC2的负半轴相关，其能够与DB、HL、XJ三产地明显区分，但未能与HT产区明显区分，这主要是因为YCZ和HT产区样品中含有种类相似和含量相近的元素有关。

图1 主成分分析得分图Figure 1 PCA score chart

图2 主成分分析散点图Figure 2 PCA scatter chart

2.3.2 葡萄酒产地判别分析

与PCA不同，LDA和PLS-DA均属于有监督的降维技术，经训练集训练后的同组数据投影尽可能接近，而不同组数据尽可能分散，可以实现对测定样品的分类。LDA的分类结果及判别模型分别见表3、表4，结果显示，经过留一法交叉验证得到5个产区葡萄酒样品预测结果的整体正确率为87.3%。其中，对DB产区的判别效果最好，产区分类正确率为100%。对于其他产区而言，采用该方法均有部分样品被错误判别。该分析方法利用2个典则判别函数，即function1和function2，function1和Bi、Ni、Cd、Be、As具有绝对最大相关性，function2与Sr、Li、Mg、Ti、Cs之间具有绝对最大相关性，根据每个样品在这两个典则判别函数上的不同得分，绘制得分图，结果显示样品之间的产地差异。根据LDA得分图（图3）显示，DB产区的葡萄酒样品能够与其他4个产区进行区分，HL、XJ产区的样品可以和HT、YCZ产区的样品进行区分。为验证模型准确率，将3个模型外样品测定数据输入模型，如图3显示的3个粉色点均被正确分类到相应产区分组中，判别准确率达100%。

表4 LDA判别模型Table 4 LDA discrimination model

图3 LDA得分图Figure 3 LDA score chart

利用PLS-DA建立判别模型，通常筛选差异物时以投影重要度（VIP）值为参数，其值越大，产生的影响越大。以205个样品建立模型，其中VIP值大于1的元素依次是Li、Rb、Sr、Mg、Mo、Pb、Cd、Ti、Co。在X（R2X）方向可以拟合70.9%的方差，Y（R2Y）方向可以拟合56.2%的方差，Q2（预测准确率）为47.3%，R2Y＝70.9%＞50%，R2Y-Q2＝23.6%＜30%，表明方程拟合效果好，且不存在过度拟合情况。但该模型总体对产区判别时的预测效果不佳。为了获得更加准确的判别效果，又分别对DB、HL、HT三个产区和XJ、YCZ两个产区建立模型（1）和模型（2），表5显示了两个PLS-DA模型的判别结果，其得分图分别为图4A、图4B所示，其预测准确率分别为81.1%和81.8%（见表5）。模型（1）中VIP值大于1的元素依次为Rb、Li、Sr、Mg、Ti、Bi、Cd、Ni；模型（2）中VIP值大于1的元素依次为Sr、Li、Mg、Rb、Ti、Cs、Mo、Cd、Cu、Be。通过三个模型共同筛选，得到对分组产生影响较大的差异元素共6个，包括两个碱金属Li、Rb；两个碱土金属Sr、Mg以及Ti、Cd元素。

表5 偏最小二乘分析判别分析模型（1）与模型（2）的判别结果Table 5 Discriminant analysis model (1) and model (2) discriminant results of PLS-DA

图4 PLS-DA得分图Figure 4 PLS-DA score chart

3 讨论与结论

随着我国葡萄酒质量的不断提升，开发和应用更快速、准确的原产地判别技术显得尤为重要。本研究通过ICP-MS技术，对我国5个产区205款葡萄酒中的28种矿质元素进行分析，得到各产区葡萄酒中各元素的分布特征。其中，所有样品中Mg元素含量最高，并以新疆葡萄酒样品中的含量最多（169 613.4 μg·L-1），其余地区样品中Mg元素含量依次为贺兰山东麓＞东北＞黄土高原＞西南高山。Mg元素主要由葡萄植株从土壤中吸收，通过直接影响葡萄植株的细胞结构、光合作用速率及细胞内酶活性，进而影响葡萄果实及所酿葡萄酒的品质[13]。研究发现，通过施加含Mg肥料可以明显提高葡萄果实的产量和品质[14]，肥料中的Mg元素被果实吸收，导致最终酒液中Mg元素含量增加。本研究中西南高山产区葡萄酒中Mg元素的含量最低，这很可能与该产区雨水较多，而Mg元素易随水土流失有关[13]。本研究不同产区酒样中Al元素（794.60～1383.80 μg·L-1）和Cu元素（169.22～203.71 μg·L-1）的含量存在一定的差异，这很可能与不同产区在葡萄栽培中所使用的肥料类型有关。有研究表明，在葡萄生长过程中施用无机肥会使所酿葡萄酒中Al元素的含量增加，而施用有机肥则会使Cu元素的含量增加[15]。5个产区葡萄酒样品中Zn元素的含量依次为东北＞黄土高原＞西南高山＞贺兰山东麓＞新疆，新疆产区Zn含量最低，这可能是由于该产区的土壤存在一定的缺Zn现象[16]。Mn元素在东北产区葡萄酒样品中的含量最高（10 691.5 μg·L-1），约为贺兰山东麓产区样品中Mn含量的6倍，很可能与灌溉水源以及成土母质影响土壤中Mn元素的含量有关[17]。Sr元素与地质特征有关，其中87Sr是由Rb经过一个β衰变而来的，并且这两个元素多存在于含钾矿物质中[18]。本研究发现，Sr元素的含量在东北产区、贺兰山东麓、新疆三个产地与黄土高原、西南高山两产地的样品间差异显著。而Rb元素在5个产区葡萄酒样品中的含量均差异显著。

确定样品原产地关键元素第一步由ANOVA完成[19]，后续还可以应用其他方法进行分类，本研究应用3种统计学方法对数据进行处理。PCA结果得出，新疆、贺兰山东麓及西南高山产区的葡萄酒样品与碱金属元素（Li、Cs、Rb）的含量具有较强相关性。采用LDA模型对不同产区酒样进行判别的整体准确率为87.3%，其中对东北产区判别效果最好，可达到100%，并重新测定3个新样品，输入数据验证模型准确率为100%。采用PLS-DA模型对不同产区酒样进行判别的整体准确率可达到80%以上，最终得到6种元素对产地差异贡献率最大，包括两个碱金属Li、Rb；两个碱土金属Sr、Mg及Ti、Cd。综上所述，矿质元素分析技术与化学计量学分析相结合在我国葡萄酒产地的鉴别中可以发挥重要作用。