葡萄膨果肥最佳施用时期判断与生物标记的开发

王令宇，刘司瑜，杨毓贤，王子诚，房经贵，上官凌飞

（南京农业大学园艺学院/江苏省果树品种改良与种苗繁育工程中心，江苏南京 210095）

根据《中国农业统计年鉴》统计数据，截止到2019年，我国葡萄栽培面积已经达到726.20 hm2，仅次于柑橘、苹果和梨，居于第四位。葡萄是需肥量比较大的果树，化肥的不合理使用，不仅会造成肥料的浪费，也会造成环境的污染。肥料的精准施用既可以节约肥料，均衡土壤养分，又可以减少环境污染，增加葡萄产量。

叶面施肥操作简单、用量少，同时具有肥效快、利用率高、对环境污染小等优点[1-2]。在叶面施肥过程中可以结合农药喷施，在一定程度上能够减少劳动力的投入[3]。磷钾是植物生长必需的元素，在植物的生长发育过程中发挥着十分重要的作用，对葡萄果实的发育尤为重要[4-5]。因此，在葡萄果实膨大前喷施KH2PO4可促进其迅速膨大，但是生产上对其喷施时期不能精准把控，造成肥料浪费等问题。因此，葡萄精准施肥在产业提档升级和高质量发展中显得尤为重要。

基因的表达早于生物体性状的变化，利用基因信息开发的生物标记已广泛应用于动物（花斑裸鲤等）、植物（水稻、菠菜、亚麻等）、人类（遗传疾病等）等[6-10]。近几年，已有相关研究报道指出，基于基因表达信息变化开发的生物标记可以用于指导葡萄生产，如利用葡萄氮代谢基因的表达评价不同氮肥肥效、利用钾吸收相关基因评价葡萄叶面肥的效果和浓度、利用葡萄花果相关基因的表达情况来指导施肥等[11-14]。磷肥和钾肥是葡萄果实膨大期所需的主要肥料，本研究选择了7个磷钾吸收相关的基因用于生物标记的开发。其中，VvKUP1、VvKUP2属于KUP家族钾转运体，其功能是促进植物对钾的吸收和维持细胞内K+浓度。VvSORK、VvSIRK属于shaker家族，VvSIRK为shaker家族内向整流K+通道基因，主要功能为低亲和吸收K+。VvSORK为shaker家族外向整流K+通道基因，VvPHT1-4、VvPHT2-1属于PHT基因家族，为高亲和力磷酸盐转运蛋白，主要作用是从外界环境摄取磷酸盐。磷调节子VvPHO1属于高亲和力磷转运载体基因，增加植物磷元素的吸收[15-18]。本研究以‘阳光玫瑰’‘巨峰’葡萄为试材，在分子水平研究叶面喷施磷钾肥的最佳时期，开发相关的生物标记，对葡萄的精准施肥具有重要意义。

1 材料和方法

1.1 材料来源

试验位于淮安市盱眙县穆店镇，江苏省龙诚农业发展有限公司基地。‘巨峰’和‘阳光玫瑰’葡萄均为3年生，大H架设施栽培。园区为智能水肥一体化管理，土壤pH为5.8，有效磷含量为29.1 mg·kg-1、速效钾含量为51.4 mg·kg-1。

KH2PO4购自南京化学试剂有限公司。反转录试剂盒购自南京TaKaRa有限公司。荧光定量染料SYBR GreenⅠ购自上海浦迪生物科技有限公司。所用引物由北京通用生物技术有限责任公司合成（表1）。

1.2 肥料喷施处理

选取大面积种植园区，每个品种分别在坐果后7 d（6月7日，AFS7）、11 d（6月11日，AFS11）、15 d（6月15日，AFS15）选取发育基本一致的植株，选择阴天或者上午9:00前对葡萄叶片正反面均匀喷施0.3%KH2PO4溶液，以叶面下滴溶液为止，每处理3次重复。4个处理记为T1（AFS7）、T2（AFS11）、T3（AFS15）和喷施清水的对照CK。在AFS3（6月3日）、AFS7（6月7日）、AFS11（6月11日）、AFS15（6月15日）、AFS19（6月19日）喷施之前采集第8～9节位的成熟叶片，并用液氮处理，放-80 ℃冰箱，用于测定叶片内磷钾吸收相关基因的表达。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 生理指标

每个处理在喷施前采样一次和喷施后每4 d随机采集30粒果，最后一次采样为坐果后27 d，用于果实纵横径以及粒质量的测量。穗质量和粒质量用电子天平称量，精确到0.01 g，取平均值。用游标卡尺随机测量各个处理5粒果实的纵径和横径，精确到0.01 cm，取均值。

1.3.2 RNA提取与cDNA的合成

总RNA提取采用改良CTAB法[19]，DNA去除使用TaKaRa试剂盒，RNA浓度使用超微量分光光度计（型号为Nanodrop-100a）检测，完整性使用琼脂糖电泳检查。以提取的RNA为反转录模版，使用TaKaRa试剂盒（型号为ES10）反转录为cDNA，所得cDNA置于-20℃贮藏，用于基因表达趋势分析。

1.3.3 荧光定量PCR

利用Primer Premier 5.0软件，分别设计看家基因以及与磷钾吸收相关基因：Shaker家族内向整流钾离子通道（inward rectifying shaker-like K+channel, VvSIRK）、shaker家族外向整流钾离子通道（shaker-like potassium channel, VvSORK）[12]；磷转运体1-4（phosphate transporters1-4,VvPHT1-4）、磷转运体2-1（phosphate transporters2-1,VvPHT2-1）、木质部磷离子转载转运体1（Xylem phosphorusion transporter1,VvPHO1）、钾转运蛋白基因1（Potassium protein, VvKUP1）、钾转运蛋白基因2（Potassium protein, VvKUP2）等基因的定量PCR引物见表1。

以葡萄看家基因Actin为内参，按照SYBR Premix ExTaqTM试剂盒说明书，采用实时荧光定量PCR（realtime quantitative PCR, RT-qPCR）方法测定基因的相对表达量。反应体系分为（1）扩增体系：cDNA 1.0 µL，上下游引物为0.8 µL（表1），反应MIX 10 µL，ddH2O 7.4 µL，总体系是20 µL。（2）程序是：95 ℃变性1 min，Tm退火20 s，72 ℃延伸30 s，40个循环，退火温度58 ℃，反应结束后分析融解曲和荧光值变化曲线。3个重复，试验数据用Excel和LinReg PCR[13]软件分析，采用2-△CT计算方法，以CK计算相对表达量。

表1 荧光定量PCR引物Table 1 Fluorescent quantitative PCR primers

2 结果分析

2.1 不同时期喷施KH2PO4对果粒纵横径的影响

由表2可以看出，T3处理‘巨峰’果实纵径和横径与CK差异显著，纵径增加大约21%，横径增加大约10%。由表2可以得到，经施肥处理的‘阳光玫瑰’果实的纵横径与CK相比增加明显，尤其是T3处理效果最好，纵径与CK相比增加约17%，横径增加约15%。结果表明，在不同时期喷施的KH2PO4均促进了果实纵横径的增加，以T3效果最好。

表2 不同时期喷施KH2PO4对果实纵横径的影响Table 2 Effect of spraying KH2PO4 in different times on fruit vertical and horizontal diameter

2.2 不同时期喷施KH2PO4对果粒质量的影响

葡萄果实粒质量是评价果实外观品质的重要参考，也是本试验最重要的一个指标。结果显示，叶面喷施磷钾肥均有效的增加了果粒质量。‘巨峰’以T3施肥效果最好，如图1A施肥处理较对照处理差异明显，在喷后27 d，T3处理粒质量已经超过5 g，对照组不足4 g，增加约25%。‘阳光玫瑰’也是第3次施肥效果最好，如图1B，T3（AFS15）处理在喷后27 d时果实粒质量达到了6.5 g以上，对照为5.5 g左右，增加大约为18%。

图1 不同时期喷施磷酸二氢钾对两品种果粒质量的影响Figure 1 Effect of spraying KH2PO4 on fruit weight in different periods

2.3 不同时期葡萄叶片磷钾吸收基因的表达情况

2.3.1 不同时期‘阳光玫瑰’叶片磷钾吸收基因的表达

通过对‘阳光玫瑰’5个时期的叶片进行基因表达趋势分析（图2）可得：磷钾吸收基因VvKUP1的表达趋势先上升再下降，以AFS7表达量最高；VvKUP2的表达趋势先降低再上升再降低，以AFS3和AFS11表达量较高。VvSORK的表达趋势总体下降；VvPHT1-4的表达趋势是先下降再上升，在AFS15表达量达到最大值然后下降。VvSIRK基因的表达趋势是先上升再下降，以AFS11和AFS15表达量较高。VvPHT2-1表达趋势是先下降再上升再下降，以AFS3表达量最高。VvPHO1基因的表达趋势是先上升再下降，再上升，以AFS19表达量最高。经过表型数据可得‘阳光玫瑰’最佳的施肥处理为T3，即花后15 d施肥最佳。此时，VvKUP2、VvPHT2-1基因表达趋势表现为在AFS11上升、在AFS15下降；VvPHO1的表达趋势都为AFS11下降，AFS15上升，VvPHT1-4的表达趋势则为在AFS15突然上升并表达量到达最大值。

图2 坐果后‘阳光玫瑰’叶片磷钾吸收基因的表达情况Figure 2 Expression of phosphorus and potassium genes in leaves of 'Shine Muscat' after fruit setting

2.3.2 不同时期‘巨峰’叶片磷钾吸收基因的表达情况

图3显示，磷钾相关基因在不同时期叶片的表达量不同，这可能与植株在各个时期所吸收的营养元素有关。‘巨峰’和‘阳光玫瑰’的磷钾吸收相关基因的表达趋势大致相同，如‘阳光玫瑰’和‘巨峰’在最佳施肥时期时，VvKUP1基因都表现为先上升后下降的趋势，VvPHO1的表达量都表现为先下降再上升的趋势，VvSORK总体表现为下降的趋势，VvPHT1-4、VvPHT2-1基因都是先下降再上升再下降的趋势，VvSIRK表达量都是先上升后下降。VvKUP2基因的表达量在‘巨峰’中表现为先升高再降低，而在‘阳光玫瑰’中表现为先降低再上升再降低。经过纵横径和粒质量分析可得，‘巨峰’最佳的施肥处理为T3，VvKUP2、VvSORK基因的表达趋势都表现为AFS11表达量上升、AFS15表达量下降；VvPHT2-1和VvPHO1的表达趋势都为AFS711先下降，在坐果后AFS15再上升。

图3 坐果后‘巨峰’叶片磷钾吸收基因的表达情况Figure 3 Expression of phosphorus and potassium genes in leaves of 'Kyoho' after fruit setting

2.4 生物标记的开发与利用

2.4.1 生物标记的开发

通过对‘阳光玫瑰’和‘巨峰’果实粒质量和纵横径分析，确定出最佳施肥日期，再结合基因表达趋势分析结果可以得出，VvSORK和VvKUP2基因的表达趋势由上升转为下降，VvPHO1和VvPHT1-4基因的表达趋势由下降转为上升，且VvPHO1/VvPHT2-1的比值为3～4，VvPHT1-4/VvPHT2-1的比值为27～35时为最佳施肥日期（图4）。综合考虑可以作为确定最佳喷施膨果肥日期的判定依据，达到减肥增效的目的。

图4 坐果后叶片VvPHO1-4/VvPHT2-1和VvPHO1/VvPHT2-1的比值Figure 4 The ratio of VvPHO1-4/VvPHT2-1 and VvPHO1/VvPHT2-1 of leaves after fruit setting

2.4.2 生物标记的利用

当‘巨峰’‘阳光玫瑰’果实坐果后，每隔3 d采集一次叶片，用于RNA的提取、反转录，再进行荧光定量RCR分析是否符合标记规律。若符合，立即叶面喷施KH2PO4，此时喷施促进果实膨大效果最好，流程见图5。

图5 生物标记使用示意图Figure 5 Biomarker diagram of biomarker utilization

3 讨论

磷、钾元素在植物细胞中较为丰富，对植物的生长发育具有重要的影响，如促进光合作用、维持渗透压、调节气孔和细胞伸长、提高叶片叶绿素含量等[20-21]。叶面施肥技术已经在番茄、小麦、棉花等作物上广泛使用和深入研究[22-24]。葡萄叶面喷施是弥补土壤缺肥的有效措施，具有利用率高、效果显著、用肥少、见效快的特点[25-26]。本研究表明，对‘阳光玫瑰’‘巨峰’叶面喷施磷钾肥均促进葡萄果实纵横径的增加和粒质量的提高。

肥料施用的种类、浓度和时期是决定叶面肥效果的关键因素。不同时期的葡萄对磷钾肥的要求不同，传统施肥时期是基于树木生长确定磷肥和钾肥的需求判断，属于经验判断，很难做到精准施肥[22-23]。传统施肥不仅没有最佳的施肥效果，也造成了肥料的浪费和环境的污染。开发用于施肥最佳时期判定的生物标记，利用分子诊断方法提前预测和精准判断树体生理状况，可以做到精准施肥，减少肥料浪费[24-25]。

生物标记能够精准鉴定有机体的生命状态和生理阶段，预判某种疾病是否存在[26-27]。随着农业科技的不断发展，农业生产逐步由“传统农业”过渡走向“精准农业”。农业对精准的要求以及生物标记在生命体特征预判上的优越性促进了生物标记在农业上的应用，已经成为精准农业的重要依据。有很多研究证据表明，利用相关基因的表达情况，可以预测植物的营养状况[1,28-32]。基因信息可以精准地反映植物体各种生理状态，可以作为精准施肥的依据。

李傲等[29]研究表明，在葡萄果实膨大期喷施0.3%的KH2PO4的效果最好，可以促进果实膨大。在葡萄对磷钾元素的研究中，主要聚集在根系吸收磷钾元素和不同钾肥种类对葡萄果实品质的影响上，对于叶面喷施磷钾肥最佳时期的判断研究不多[33-37]。本试验在果实膨大期进行叶面喷施KH2PO4，测定果实的粒质量和纵横径，并采集不同时期的叶片用于测定叶片中磷钾吸收相关基因的表达，结合生理和基因表达，筛选出一套可用于提前预测喷施膨果肥的最佳时期的生物标记。将来，可以开发快速检测试剂盒，结合高密度田间采样，实现葡萄大规模种植园的精准施肥管理，达到减少肥料施用和省工省力的目的。

4 结论

叶面喷施磷钾肥可以有效促进果实增大，结合生理数据和基因表达，筛选出一套可作为喷施磷钾肥最佳时期判定的生物标记，VvSORK和VvKUP2基因的表达趋势由上升转为下降，VvPHO1和VvPHT1-4基因的表达趋势由下降转为上升，且VvPHO1/VvPHT2-1的比值为3～4，VvPHT1-4/VvPHT2-1的比值为27～35。