瞬态过程研究用新型低温生物显微成像冷冻台研制

张宏彬，黄永华*，韩厦，李铮

（1-上海交通大学制冷与低温工程研究所，上海 200240；2-上海交通大学附属第一人民医院泌尿中心男科，上海 200080）

0 引言

低温显微镜是研究生物切片组织和细胞在低温下冻融机理的重要工具之一，它不仅包括显微成像系统，还嵌入生物样本冷冻、保温和复温功能[1-4]，通常以液氮或冷氮气为冷源。过去几十年中，文献报道了多种类型的低温显微镜冷冻平台，用于观察不同条件下的冷冻现象。根据低温降温方式的不同，可分为对流型和导热型。DILLER等[5-6]较早研制了用于观察生物细胞的对流型低温显微镜，以恒定氮气流为冷源，以载物片上的透明氧化锡镀膜为加热器，所设计的自动温度控制系统可调节冷冻和解冻过程中的温度变化率，降温速率约100 ℃/min。邬申义等[7]研制出国内首台低温显微镜，采用冷氮气冷却样品，用水或者热氮气加热样品，并通过调控电磁阀的启闭时间来实现温度变化速率的控制，升降温速率在0～100 ℃/min内可控，控温精度为0.1 ℃，控温范围-196～50 ℃。NAMPERUMAL等[8]设计了一种定向固化的冷冻台，通过使样品横跨冷热台之间微小间隙达到超高速的降温升温，最高能提供18 000 ℃/min的升降温速率。张绍志等[9]研制了同样以冷氮气为冷源的对流型低温显微镜，最低温度约为-50 ℃，通过电子膨胀阀控制冷却介质的流量，计算机输出模拟信号控制镀膜玻璃的加热量，采用比例积分微分算法控制升降速率，实现了50 ℃/min的降温速率以及100 ℃/min的升温速率。范菊莉等[10]对低温台温度场的分布情况进行了数值模拟和实验验证，发现对流型显微镜样品层温度在水平方向上基本均匀。LEGROS等[11]设计了可以通过旋转低温台一次性观察多份样品的低温显微镜，低温台通过一根浸入液氮的导热柱进行降温，低温台上有小孔用于存放不同样品，控温范围为-190～27 ℃，降温速率约30 ℃/min，拍摄的图片分辨率最高可达250 nm。因此，以往的低温生物显微镜系统已实现降温和观察两大基本诉求，且基本以对流型降温为主。但是对于单项设备，其综合升降温速率、极限低温和成像效果等仍无法满足诸如人类配子和切片组织的超快速降温过程研究要求。上述设备对降复温过程中生物样品所处的气体氛围缺乏相关的考虑和举措。

本文设计和研制了一种新型低温生物显微成像冷冻台，通过控制装载生物样本的环境舱运动，进而与真空绝热腔体内低温热沉的接触来实现瞬间启动的快速降温效果。相较于以往的低温生物显微镜，其生物样本与低温冷源分离，既可以实现样本的环境氛围可控，还使生物样本在实验前的任意时刻都处于常温状态，排除降温初期的干扰和不确定性，并有利于提升降温速率和提高过程可控性。

1 实验系统设计与研制

当高速显微成像需求和深低温环境两个要素结合在一起时，所需要实现的技术难度绝不是两者的线性叠加，其挑战性成倍增加。在此基础上，要实现对生物组织切片或者细胞的高速降温，则又增加了一个技术的维度。为了同步满足上述多方面的技术要求，设计并搭建了如图1所示的生物样品低温冷冻和显微成像系统，主要由真空腔体、液氮热沉、环境舱、气浮减震平台、分子泵机组、驱动电机、液氮供排系统和测量控制系统等组成。

图1 低温冻融和显微成像系统

低温显微镜系统与普通显微镜相比，其特点在于低温的实现和对温度的控制，主要体现在升降温速率和极限低温。一方面，为了获得较高的降温速率需要样品与冷源之间具有良好的传热能力；另一方面为了达到并保持足够低的温度，以及保持视窗不起雾，则需要较强的保温性能。新型降复温系统使用电机控制真空环境中物体间的接触与分离，能很好实现以上两种传热要求。如图2所示，真空腔体为扁平圆腔，上表面中心设有观察窗，垂直向下依次设有环境舱和液氮热沉。

图2 真空腔体内部设计

环境舱亦为扁平圆盘结构，主体为不锈钢材质，上盖板中心为玻璃观察窗，底面中心开有圆形小孔，内嵌低温下热导率极大[12]的蓝宝石片并以低温胶粘接密封形成密闭环境。蓝宝石片上表面开有粗细两条样品槽以及一个温度传感器安装槽，其结构如图3所示。环境舱侧壁面通过导气管与外部洁净气源连通，其内部气体氛围可控，通常处于常压下，但可更换为空气、氧气或氮气等各种气体。图2中液氮热沉为铜质中空圆筒，容积为2 L，内部充有液氮，顶板焊接三根导热效率极高的铜柱，向下插入液氮浴中，保持顶面处于液氮温度。测量控制系统由计算机、温度传感器、数据采集仪、测控柜、高速相机、显微镜等组成，其中主要设备的性能参数如表1所示。

图3 蓝宝石玻璃载物台结构

表1 测控系统性能参数

在真空度为10-3Pa的真空腔体中，环境舱与液氮热沉分离时，两者之间仅存在极低的辐射换热，这确保了液氮冷源在待机期间不会影响环境舱。当通过步进电机移动环境舱与液氮热沉接触并提供一定预紧力时，两者之间的传热瞬间强化。需要说明的是，蓝宝石载物台的底面相比环境舱的底面微凸0.1 mm，这使得冷量的传递集中在载物台区域，从而实现了核心区域的快速降温。在样品复温时，则使环境舱与液氮冷源处于分离状态，并启用加热丝进行加热。

2 系统传热计算与分析

系统降温过程中，为了达到更高的降温速率，必须在减小样品漏热的同时，增强从液氮冷源到样品各个环节间的传热。图4所示为真空腔体传热流程。由于蓝宝石在低温下导热系数极高、可忽略其热阻。载物台与液氮热沉间的接触热阻是制约降温速率的主要因素，同时载物台的厚度及边界条件也会对降温速率产生一定影响。本文将通过对换热核心区域进行数值模拟以优化设计方案。

图4 真空腔体传热流程

2.1 传热计算模型

低温显微镜系统中，关注的核心区域是环境舱内部。由于环境舱为圆盘状中心对称结构，故建立以A-A'为对称轴的二维数值模型，如图5所示，其中蓝宝石载物台的半径为r，厚度为δ，温度传感器布置点（即监测点）的坐标为（r，0.8δ）。

图5 环境舱数值模型

假设环境舱外表面为绝热，环境舱与冷源的辐射换热忽略不计，温度传感器及样品体积极小，不考虑其对载物片温度分布的影响。基于以上假设，对所选取区域进行二维非稳态导热计算。材料物性参数随温度变化，特别是蓝宝石随着温度的降低，其导热系数会明显增大，将蓝宝石Al2O3的导热系数k随温度T的变化按k=A+B/T来拟合[13]，其中A=-2.599 W/(m·K)，B=11 760 W/m。采用有限差分法将空间和时间离散化，通过空间步长及迭代计算的稳定性条件确定时间步长，根据实验条件设置温度场初始条件。对不同边界条件的每个单元进行能量守恒计算，依次得到后一时刻的温度场[14]。不同计算区域的传热方程不同。

图6所示为冷源边界网格。针对坐标（i,j）所在的单元体建立能量平衡式如式(1)。其中Ti，j为对应坐标的单元体温度，Tc为冷源温度，hc为冷源与单元体之间的传热系数，τ为时间，λ1、ρ和cp分别为单元体的导热系数、密度和定压比热容。

图6 冷源边界网格

图7所示为自然对流区域，针对坐标（i,j）所在的单元体建立能量平衡式如式(2)。其中下标1和2表示不同材质的单元体。

图7 自然对流区域离散处理

采用格拉晓夫数Gr作为传热规律转变判据[15]，当Gr<104，按导热计算传热量，对流换热表面传热系数h的计算式如下：

当Gr>104，按有限空间自然对流计算，采用如下所示的Nu经验公式[15]：

Pr为普朗特数，则对流换热表面传热系数h的计算式为：

式中，l为自然对流边界的几何尺度。基于上述方法，采用Matlab编写计算程序。

2.2 数值模拟降温过程

在液氮热沉温度保持80 K恒定、环境舱内为常压空气的条件下，利用上述模型计算得到的图5所示测温点从室温开始的降温曲线如图8所示，同时给出了利用实验装置获得的实测数据。由图8可知，实验数据证明了预测模型的准确性，特别是降温后期误差仅在0.5 K以内。

图8 模拟的降温过程曲线及实测温度对比

2.3 载物台厚度及接触热阻对降温效果的影响

基于上述计算模型，在实验台设计初期进行了环境舱温度场模拟分析，考察载物台厚度以及液氮热沉与蓝宝石载物台间不同接触热阻对温降曲线与温度分布的影响。不同厚度载物台的温度监测点降温曲线如图9所示。随着载物台厚度减薄，样品的初期降温速率会有明显提升，载物片厚度每减薄1 mm，监测点降温速率提升20 %左右，但对于样品的极限低温影响不大。原因是低温下蓝宝石的热扩散系数明显高于空气，随着蓝宝石厚度的减薄，一方面蓝宝石法向空间范围内温度梯度增大，载物台上表面更容易受到附近热空气的影响，另一方面冷量传递到参考点的空间距离缩短，在两者的共同影响下，参考点总体上呈现降温速率增加的趋势。

图9 不同厚度载物台时样品降温曲线

以3 mm和5 mm两个载物台厚度为例，环境舱温度分布如图10所示。由图10可知，两者在降温初期（τ=5 s）水平方向上均存在明显温度梯度，载物台四周与中心点的温差最高可达8 K左右；将样品放置在载物片的中心位置可在降温初期获得较高的降温速率。

图10 载物台温度分布

根据上述对载物台的数值模拟结果，考虑到载物台受力、环境舱密封性能等各方面因素，确定了蓝宝石玻璃材质载物台的具体结构尺寸，其半径r为10 mm，厚度δ为5 mm。

载物台与液氮热沉之间的界面接触热阻R对于系统的降温效果有很大的影响，针对不同接触热阻，监测点的降温曲线如图11所示。

图11 液氮热沉与环境舱间不同接触热阻下样品降温曲线

接触热阻的实验数据为减小接触热阻提供指导。在后续实验中，将对比研究了环境舱和液氮热沉间采用不同接触方式（裸接或填充不同厚度铟箔）时的实际降温效果。

3 低温显微冷冻台调试

在数值模拟优化的基础上完成了载物台、环境舱及真空系统的设计，试制了低温显微成像冷冻台，如图12所示。

图12 低温冻融和显微成像系统

本文对该系统进行了性能测试。首先将待测样品放置在环境舱中的蓝宝石载物台上，通过螺丝及氟胶圈将环境舱上盖板压紧密封，随后对整个真空腔体抽真空至10-3Pa量级。再向液氮热沉内加注液氮，此时环境舱与液氮热沉处于分离状态，环境舱温度所受影响较小。通过嵌入液氮热沉及蓝宝石载物台的热电偶温度计实时监测温度变化并记录数据，其过程曲线如图13所示。

图13 液氮热沉加注过程的温度曲线

液氮热沉内部存在0.2～0.3 MPa压力，其对应温度约86 K，停止注入液氮并调节液氮出口阀门使其逐渐恢复常压，一段时间后液氮热沉温度降至80 K左右（图14的初始段）。待稳定后，驱动电机使环境舱向下移动直至与液氮热沉上表面接触，样品温度迅速下降，载物台及样品的降温过程如图14中40 s之后所示。当载物台温度到达极限温度完成降温和实验观测后，抬起环境舱同时启动电加热进行复温。

图14 载物台及样品的降温过程温度曲线

界面接触热阻是影响系统降温效果的决定性因素。界面接触热阻是由于固体表面存在粗糙度，界面间不完全接触形成的[16-17]。特别是处在真空环境时，微观孔隙中不存在气体对流，热阻相比常压环境更大[18]。系统中采取了在液氮热沉与蓝宝石载物台之间充垫铟箔来消除/减小界面接触热阻。图15所示的实验证明，这一举措大大改善了系统的降温效果。

图15 接触面裸接和使用铟箔垫片时的样品降温曲线

采用裸接方式时其降温速率甚至还不如对流型生物显微镜的水平。当采用0.1 mm厚铟箔后，降温速率显著提升；当采用更厚的0.2 mm铟箔，样品降温速率在0～10 s内达到558 K/min，从室温298 K降至150 K的平均降温速率为388.9 K/min，样品的极限低温也从裸接方式的240 K降至89 K。在采用铟箔的基础上，通过增大载物台与液氮热沉的预紧，可以进一步减小界面接触热阻，达到系统最优的降温效果，其各温区的降温数据如表2所示。

表2 系统各温区降温速率数据

4 成像情况检验

利用本套低温显微镜系统，拍摄了高降温速率下人类生精小管细胞（直径约100 μm）在水、冷冻保护剂（10%二甲基亚飒DMSO）中的冷冻复温视频，观察到了管外水的支状冰晶形成以及管内细胞液的不同结晶方式[19-21]，如图16和图17所示。拍摄视频分辨率为1 920×1 200，帧率180 FPS，拍摄过程中显微镜的放大倍率为200倍，通过气浮减震平台以及软件后期处理解决了高放大倍率下图像抖动问题，上述成像质量满足细胞及微小生物组织的低温冷冻显微。

图16 生精小管在水溶液中冻结（降温速率约为500 K/min）

图17 生精小管在冷冻保护剂中冻结（降温速率约为500 K/min）

5 结论

本文提出了一种用于瞬态过程研究的新型低温生物显微成像冷冻台方案，进行了传热过程的建模和数值计算，优化了真空绝热环境舱内的传热设计，在此基础上研制了一套高降温速率且样品环境氛围可控的低温显微成像系统，研究了系统降温特性和极限低温等，分析了核心换热区域的传热特性，得出如下结论：

1）载物台与液氮热沉之间的接触热阻对系统的降温速率起决定性作用，优化接触方式后系统的降温速率最高可达1 600 K/min（300～250 K）以上；

2）载物台厚度以及样品位置点的选取在降温初期（300～200 K）对降温速率产生很大影响，载物台边缘与中心的温差最高可达10 K；

3）样品极限低温主要取决于载物台与液氮热沉之间的接触热阻以及载物台厚度；

4）获得了生精小管样品冻融瞬态过程中管外支状冰晶形成以及管内细胞液不同结晶方式的高速影像，满足低温生物损伤机理研究需求。