甘草添加水平对黄河鲤肌肉mstn 基因表达的影响

单雅诗， 彭念念， 王良炎＊

（河南师范大学水产学院， 河南 新乡 453007）

甘草（Glycyrrhiza Uralensis Fisch）是我国最常用的大宗药材之一，始载于《神农本草经》中，被列为上品,在临床方剂中使用频率极高,素有“十方九草”之称,有补脾益气,清热解毒、调和诸药等功效[1]。 甘草的主要成分为甘草酸和甘草甜素，具有抗炎、抗菌、抗肿瘤、抗艾滋病等药理作用。 近年来,中草药由于其成本低、加工方便、无抗药性和药物残留、副作用小、效果显著、资源丰富等优点受到人们的关注。 有研究认为中草药对于强健机体、加速生长、提高生产性能和改善机体营养组分等方面有较好的综合效应，而且具有无抗药性、无残留、不良反应小、效果显著等特点[2]。

黄 河 鲤（Cyprinus carpio haematopterus）主 产 于黄河流域，为我国重要的淡水经济鱼类，与松江鲈、兴凯湖鲌、松花江鳜并称为中国四大淡水名鱼[3]。 黄河鲤以其独特的营养与文化价值， 深受消费者的喜爱，在河南省水产养殖业中占据着举足轻重的地位。随着水产养殖日益集约化和规模化， 黄河鲤肉质品质普遍下降，土腥味加重，脂肪增多，蛋白含量减少。人们感到其产品品质及品味不如自然界野生鱼类鲜美。改善黄河鲤肉质品质是急需解决的问题。近年来,中草药作为添加剂在水产养殖中的应用逐渐增多，但以甘草为饲料添加剂，探讨其对黄河鲤肌肉生长的研究较少。

肌肉生长抑制素（myostatin，mstn）简称肌抑素，因其具有转化生长因子β（transforming growth factorbeta，tgf-β）超家族成员共有的结构特性，又被称为生长分化因子8 （growth differentiation factor8，gdf-8）。Mstn作为一种肌肉负向调控因子在肌肉生长和肉质品质中发挥着重要的作用。 在畜牧生产中，抑制mstn表达可以改善畜禽的瘦肉质量和肉质， 提高经济效益；在医学研究中，抑制mstn表达对肌肉萎缩症等疾病有一定的效果。Mstn负向调控细胞的生长发育，该基因的多态性与动物骨骼肌的生长相关，mstn缺失不但影响骨骼肌发育， 还对脂肪沉积有一定的抑制作用。 因此，本研究通过在饲料中添加不同浓度甘草含量， 探讨其对黄河鲤肌肉生长相关基因mstn的影响，从而为甘草在水产饲料中的应用提供参考数据。

1 材料与方法

1.1 实验鱼来源和样品收集

本实验所用黄河鲤来自河南省水产科学院。 挑选体重均一的黄河鲤幼鱼750尾， 随机分为5个处理组，每组三个平行，每个平行50尾鱼。 C组为对照组，饲料中甘草浓度为0 %，T1组甘草浓度为0.5 %，T2组饲料甘草浓度为1.5 %，T3组甘草浓度为2.5 %，T4组甘草浓度为4.0 %，实验饲料配方和营养成分见表1。养殖实验结束后，统计每组实验鱼的重量，并按照表2进行样品的采集，用于RNA的提取，采集后的样品放入液氮中速冻，然后放入-80 ℃冰箱保存备用。

表1 饲料配方及营养成分

表2 实验样品采集

1.2 黄河鲤肌肉总RNA提取和cDNA合成

将采集的实验样品进行RNA的提取，1 %琼脂糖凝胶电泳检测RNA 完整性，ND-2000 核酸蛋白仪（Thermo， 美 国） 检 测RNA 纯 度 和 浓 度。 Prime-ScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（Takara公司， 大连） 合成cDNA用于PCR扩增。 利用Primer 3 Plus软件设计mstn和β-actin的引物，引物序列见表3，由金唯智公司进行合成。 按照（Takara公司，大连）说明书进行PCR扩增，反应结束后凝胶电泳验证。

表3 所用引物序列

1.3 实时荧光定量PCR （Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR）

按照Prime Script TMRT Master Mix 和SYBR Premix Ex Taq TM（Ta Ka Ra，大连）试剂盒说明书，以cDNA为模板，体系为10 μl，上下游引物各0.3 μl，SYBR PremixⅡTaqTM（2X） 5 μl，cDNA 1 μl，RNase free H2O 3.4 μl。 QRT-PCR反应程序如下：95℃预变性30 s，95℃变性5 s，62℃20 s，95℃10 s，40个循环。反应结束后分析溶解曲线以及Ct值。

1.4 数据统计与分析

将每组实验鱼的背部肌肉、 红肌和腹部肌肉依次进行称重，并计算出平均值。 荧光定量所得图谱和数据用Light Cycler 96分析得出Ct值，最后采用2-△△Ct法计算的mstn的相对表达水平， 利用spss18.0分析实验数据，在单因素方差分析（One-Way ANOVA）基础上采用Duncan多重比较检验实验数据间的差异（P＜0.05），结果用mean±SE表示。

2 实验结果

2.1 喂食甘草后对黄河鲤背部肌肉mstn mRNA表达量影响

图1结果显示，四个处理组中的黄河鲤背部肌肉mstnmRNA表达量均有一定变化， 表明甘草对黄河鲤背部肌肉mstn基因的表达有影响。 表达水平为先增高后下降的趋势，T1、T2、T3和T4四个处理组在表达量上不存在显著差异（P＞0.05）。 添加甘草的实验组跟对照组相比，mstn表达量明显低于对照组，具有显著的差异（P＜0.05），其中甘草添加量为0.5 %的实验组表达量最低， 为0.43； 其余三个实验组分别为0.23、0.11和0.06。

图1 喂食甘草后鲤背部肌肉MSTN基因相对表达量

2.2 喂食甘草后鲤红肌对黄河鲤背部肌肉mstn mRNA表达量影响

图2结果显示，甘草处理组红肌肉的mstn基因表达量与对照组存在显著差异（P＜0.05）；处理组T2和T3不存在显著差异（P＞0.05），而T1和T4存在显著差异（P＜0.05）；其中甘草添加量为0.5 %的实验组mstn表达量最低； 其余三个处理组中， 甘草添加浓度为4%时，mstnmRNA表达量最高；另外两个实验组表达量介于两者之间。

图2 喂食甘草后鲤红肌MSTN基因相对表达量

2.3 喂食甘草后对黄鲤背部肌肉MSTN mRNA表达量影响

图3结果显示， 处理组甘草添加浓度为1.5%和2.5%时，鲤腹部肌肉mstn基因表达存在显著差异（P＜0.05），表达量趋势同鱼背部肌肉相似，表现为先升高后下降。 0.5%甘草处理组mstn基因表达量为1.97，与对照组不存在显著差异 （P＞0.05）；1.5%甘草处理组mstn基因表达量为3.53， 与对照组差异显著 （P＜0.05）；2.5%甘草处理组中mstn基因表达量为4.19，与对照组存在显著差异（P＜0.05）；4 %甘草处理组mstn基因表达量为2.59， 与对照组的差异不显著 （P＞0.05）。T3处理组的表达量高于T1、T2和T4处理组（P＜0.05）。 综上所述：T2和T3组与C组存在显著差异（P＜0.05）， 其它处理组与对照组之间不存在显著性的差异（P＞0.05）。

图3 喂食甘草后鲤腹部肌肉MSTN基因相对表达量平均值

3 讨论

黄河鲤属于鲤形目鲤科鲤属， 因肉质鲜美而闻名，是我国内陆水域最重要的养殖品种。 近年来，人们开始寻求适宜的饲料添加剂来降低脂肪的含量，提高蛋白质的沉淀， 从而改善鱼的肉质品质和风味[4]，在饲料中植物性添加剂对肌肉品质的影响受到广泛关注。有研究表明，在饲料中添加不同成分的螺旋藻、 复方中草药和不同剂型微量元素等都可以影响鲤肌肉mstnmRNA的表达水平。 然而， 肌肉的分化、生长和发育是动物生长发育的重要环节和过程，且在不同层次受多种因素的影响[5]。鱼类肌肉在肌原发生调节因子的作用下， 将各体节进一步分化成为不同类型肌纤维或肌肉组织， 位于躯干深层的白色肌肉为快肌，位于表皮下的红色肌肉为慢肌。本文根据黄河鲤肌肉分布的位置以及其它特点以背部肌肉、红肌以及腹部肌肉为研究对象，通过qRT-PCR的方法研究甘草对鲤肌肉mstn表达的影响， 旨在为中草药甘草作为饲料添加剂在水产养殖中的应用提供理论数据。

最近已从许多鱼类组织中分离出mstn， 包括斑马鱼、罗非鱼、虹鳟和鲶等[6]。此外，与哺乳动物相比，鱼类不仅在红色和白色肌肉中表达mstn， 而且在其他组织中也表达mstn，这表明mstn可能在鱼类中不仅在肌肉生长中起作用， 而且在其他生理过程中也起作用[7]。 在本实验中，背部肌肉喂食甘草后mstn基因的表达明显降低，且随着甘草浓度的增加，表达量呈现先升高后降低的趋势，甘草浓度约在0.5% ～2.5%之间可使mstn基因表达量降低，加速背部肌肉生长。在红肌中，虽然喂食甘草后mstn基因的表达量降低，但是与对照组差异不显著， 表明饲料中添加甘草可能对红肌生长的影响较小。 Galt[8]等通过对虹鳟红肌注射mstn,12 h后在红肌体内均未检测到差异，此外，也可能与红肌自身特点相关， 红肌富含线粒体和肌红蛋白，主要用于缓慢游泳和平衡，随着鱼体增长，红肌会保持恒定，所以添加甘草后，mstn表达量也不会发生较大变化。 在腹部肌肉中，喂食甘草后mstn基因的表达存在较大差异，甘草浓度为1.5%和2.5%时，mstn表达量显著增加， 表明饲料中添加1.5%和2.5%甘草可能影响腹部肌肉的生长。 此外， 一些研究报道，饲料中添加甘草粉、甘草提取物和甘草茎叶等均可影响肌肉品质，侯芳[9]等研究表明饲料中添加14.95 %的甘草茎叶具有提高阿勒泰羊肌肉品质；王旭东[10]等研究表明，饲料中添加甘草药渣的实验组羊肉品质高于饲料中未添加甘草药渣的对照组，混合药渣对羊肉并没有影响。综上所述，饲料中添加甘草对黄河鲤不同肌肉组织的mstn表达量变化影响存在较大差异，这可能也与骨骼肌类型不同相关。而甘草添加后背部肌肉和腹部肌肉mstn的表达差异对肌肉品质改善的作用还有待进一步深入研究。