大豆多肽发酵液脱色及不同超滤组分抗氧化研究

李乐乐 杨学为 罗雪韵 范柳 尹乐斌

摘 要：为探究豆渣发酵液的脱色效果和不同分子质量大豆多肽的体外抗氧化能力，利用枯草芽孢杆菌发酵豆渣酶解液制备大豆多肽，利用活性炭脱色处理，再采用超滤分离将豆渣多肽发酵液分级出

5～10 kDa，3～5 kDa，500～3 000 Da和<500 Da的4个组分。分别研究4个组分的大豆多肽对DPPH自由基、OH自由基、ABTS阳离子自由基的清除能力。结果表明，最佳脱色条件为活性炭添加量1%、脱色温度50 ℃、脱色时间45 min;不同组分对3种自由基均有一定的清除活性，其中<500 Da的组分对ABTS阳离子自由基清除活性最强，5～10 kDa多肽组分对DPPH自由基清除活性最强，3～5 kDa多肽组分对-OH自由基清除活性最强。本研究为大豆多肽的生理活性研究提供了理论指导。

关键词：豆渣;大豆多肽;超滤;抗氧化活性

Study on Decolorization of Soybean Polypeptide Fermentation Broth and Antioxidant Activity of Different Ultrafiltration Components

LI Lele1， YANG Xuewei1， LUO Xueyun1， FAN Liu1， YIN Lebin1，2*

（1.School of Food and Chemical Engineering， Shaoyang University， Shaoyang 422000， China; 2.Hunan Provincial Key Laboratory of Soybean Products Processing and Safety Control， Shaoyang 422000， China）

Abstract： In order to explore the decolorization effect of soybean residue fermentation broth and the antioxidant capacity of soybean peptides with different molecular weight in vitro， soybean peptides were prepared from soybean residue enzymatic hydrolysate fermented by Bacillus subtilis， decolorized by activated carbon， and then separated by ultrafiltration. The soybean residue polypeptide fermentation broth was divided into 4 components of 5～10 kDa， 3～5 kDa， 500～3 000 Da and <500 Da. The scavenging abilities of four components of soybean peptides to DPPH radical， OH radical and ABTS cationic radical were studied. The results showed that the optimum decolorization conditions were 1% of activated carbon， 50 ℃ decolorization temperature and 45 min decolorization time; different components have certain scavenging activities against three kinds of free radicals. Among them， the component less than 500 Da has the strongest scavenging activity against ABTS cationic free radicals， the

5～10 kDa polypeptide component has the strongest scavenging activity against DPPH free radicals， and the

3～5 kDa polypeptide component has the strongest scavenging activity against -OH free radicals. This study provides theoretical guidance for the study of physiological activity of soybean peptides.

Keywords： bean dregs; soybean polypeptide; ultrafiltration; antioxidant activity

豆渣是豆制品加工副產物，其富含膳食纤维、有机酸和蛋白质等营养成分。由于豆渣有机物丰富，水分大且口感粗糙，导致其处理成本高昂，豆渣的综合利用也成为豆制品企业急需解决的问题[1]。大豆多肽即肽基蛋白水解物，其主要是通过酶解和微生物发酵使大分子蛋白水解为小分子多肽，研究表明大豆多肽具有抗氧化、降血压、降血糖和抗疲劳等生理活性[2-4]。不同分子量大豆多肽生理活性也存在差异。邓成萍等[5]运用中性蛋白酶和碱性蛋白酶双酶水解制备大豆多肽，并超滤分离成4个多肽组分，同时探究不同分子量多肽的物理性质和生物活性，研究发现小分子大豆多肽的DPPH自由基清除能力和ACE抑制活性显著增强。

超滤分离是一种应用广泛的膜分离技术，在压力差作用下利用超滤膜将不同分子量物质分离，具备操作简单、成本低、适应力强等优势，通常被用于分离纯化多肽、多糖等活性成分[6]。豆渣经枯草芽孢杆菌发酵制备大豆多肽，其发酵液颜色较深。本实验利用活性炭对发酵液进行脱色处理，超滤分离纯化不同组分多肽，并对其抗氧化活性进行比较分析，以深入了解不同组分多肽的生理活性，同时为探究大豆多肽的纯化技术提供有效的指导。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料与菌株

豆渣由实验室提供;枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），绿陇生物有限公司。

1.1.2 试剂

活性炭，台山市粤侨试剂塑料有限公司;ABTS，分析纯，安徽酷儿生物工程有限公司;DPPH，分析纯，南京都莱生物技术有限公司;抗坏血酸，福晨化学试剂有限公司。

1.1.3 仪器与设备

SCIENTZ-10N冷冻干燥机，宁波新芝生物科技股份有限公司;VELOCITY 14R台式冷冻离心机，Dynamica公司;D-7型紫外分光光度计，南京菲勒仪器有限公司;微滤机组，使用纤维膜和不同分子量的超滤膜，上海摩速科学器材有限公司。

1.2 方法

1.2.1 大豆多肽的制备

回收干净的湿豆渣利用精细磨粉碎成糊浆状，加入纯化水调整豆渣的干基使其達到5.8%，在豆渣糊中加入纤维素酶水解形成豆渣酶解液，将其置于80 ℃水浴锅灭酶10 min（将pH值调整为7.2）。将枯草芽孢杆菌接种在豆渣酶解液中开始液态发酵（控制发酵条件为温度37 ℃，接种量3%，时间60 h），将发酵液在冷冻离心机下以10 000 r/min离心10 min后取上清液保存备用。

1.2.2 活性炭脱色处理

由于豆渣发酵液颜色呈黄褐色，因此考虑利用活性炭进行脱色处理。量取20 mL发酵液置于锥形瓶中，在一定的活性炭用量（0.25%、0.50%、1.00%、1.50%和2.00%）、脱色温度（30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃和70 ℃）、脱色时间（15 min、30 min、45 min、

60 min和75 min）下对豆渣发酵液进行脱色处理，脱色液经抽滤和离心后，在400 nm波长下测定脱色前后吸光度变化，在540 nm波长下测定脱色前后多肽含量变化，以脱色率和多肽保留率为指标，确定最佳脱色条件。脱色率和多肽保留率计算公式如下：

（1）

（2）

式中：A1为脱色前吸光度;A2为脱色后吸光度;B为脱色后多肽含量，%;B0为脱色前多肽含量，%。

1.2.3 超滤分离

将脱色处理后的发酵液进行冷冻离心（5 200 r/min，

12 min），分别通过预先清洗的纤维膜和10 kDa、5 kDa、3 kDa和500 Da的超滤膜，压力调整为

40 MPa，25 ℃下进行回流超滤。发酵液最初体积为4 000 mL，起初将发酵液通过含有纤维膜的柱子以除去其中的不溶性杂质，然后由大到小经过10 kDa、5 kDa、 3 kDa、500 Da超滤膜，分阶段收集5～

10 kDa、3～5 kDa、500～3 000 Da和<500 Da的组分，将不同组分样品进行冷冻干燥，冻干粉置于

-20 ℃保存备用。

1.2.4 多肽的抗氧化性

测定不同多肽组分的ABTS阳离子清除率、DPPH自由基清除率、OH自由基清除率[7-8]。根据不同自由基在不同波长下存在特征吸收峰确定波长，由于自由基与抗氧化剂共存时，其体系溶液颜色变浅，故可以用于判定多肽样品的抗氧化能力，根据不同波长下样品的吸光度值即可得到不同自由基的清除率。

2 结果与分析

2.1 活性炭脱色处理

2.1.1 脱色温度对发酵液脱色效果的影响

如图1所示，随着脱色温度提高，发酵液脱色率呈先快速上升后趋于缓慢下降的趋势，多肽保留率呈先急剧下降后缓慢下降得趋势，当脱色温度低于50 ℃时，随着温度升高，发酵液脱色率快速升高且多肽保留率下降明显，当温度超过50 ℃时，脱色率和多肽保留率缓慢降低，可能是由于温度升高，体系中分子加快扩散，加速了活性炭对色素及其他分子的吸附，但当温度过高，会使活性炭的解吸大于吸附，同时也会使部分活性成分损失[9]。综合考虑，选择脱色温度50 ℃为最佳。

2.1.2 脱色时间对发酵液脱色效果的影响

如图2所示，随着脱色时间的延长，发酵液脱色率呈先快速上升后趋于平缓的趋势，多肽保留率呈先急剧下降后趋于平稳的趋势，当脱色时间>45 min，发酵液脱色率和多肽保留率相对稳定，这是由于活性炭吸附存在吸附和解析的动态平衡，在脱色时间45 min时到达了平衡点。综合考虑，选择脱色时间45 min为最佳。

2.1.3 活性炭添加量对发酵液脱色效果的影响

如图3所示，随着活性炭添加量的增加，脱色率升高而多肽保留率降低，当活性炭添加量>1%时，尽管脱色效果显著增强，但是多肽损失严重，这是由于活性炭过量，其吸附表面积增大，吸附能力也进一步提高，在此过程中，活性炭不仅除去部分有色杂质和臭味，同时也吸附了多糖、蛋白质等有机物，导致小分子多肽损失严重。综合考虑，选择活性炭添加量为1%为最佳。

2.2 抗氧化能力测定

2.2.1 ABTS阳离子清除率测定

ABTS与过硫酸钾反应，生成蓝绿色的ABTS自由基在734 nm处有特征吸收峰，当与抗氧化剂共存时，体系颜色变浅，在734 nm处的吸光度下降，因其反应灵敏、操作简便而被广泛应用于抗氧化活性指标的评定[10]。不同多肽组分对ABTS阳离子清除效果如图4所示，发酵液的不同超滤组分样品均具有一定的清除效果，<500 Da的多肽样品比其他组分对ABTS阳离子清除效果强。

2.2.2 DPPH自由基清除率测定

DPPH是一种稳定的自由基，由于其具有单电子，其醇溶液在517 nm具有明显的吸收峰，当DPPH中单电子与其他抗氧化剂中的单电子配对时，517 nm处吸光度降低，因此常被用来分析体外抗氧化实验[10]。不同多肽组分对DPPH自由基清除效果如图5所示，发酵液的不同超滤组分样品对DPPH自由基都具有一定的清除效果，其中5～10 kDa的多肽样品比其他组分清除效果强。

2.2.3 OH自由基清除率测定

OH自由基是活性氧中对生物体毒害作用最强的一种自由基，与细胞衰老和损伤有关[11]。不同多肽组分对OH自由基清除效果如图6所示，发酵液的不同超滤组分样品对OH自由基都具有一定的清除效果，其中3～5 kDa的多肽样品比其他组分清除效果强。

3 结论

本研究利用枯草芽孢杆菌发酵豆渣酶解液制备大豆多肽，利用活性炭脫色处理，再通过超滤分离不同组分多肽，并研究不同组分的抗氧化能力。结果表明，最佳脱色条件为活性炭添加量1%、脱色温度50 ℃、脱色时间45 min;不同组分对3种自由基均有一定的清除活性，其中<500 Da多肽组分对ABTS阳离子自由基清除活性最强，5～10 kDa多肽组分对DPPH自由基清除活性最强，3～5 kDa对OH自由基清除活性最强。本研究为探究大豆多肽生理活性和开发前景提供数据参考。

参考文献

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