4种诱抗剂对烟草靶斑病的诱抗性

黄 宁， 周建云， 赵一君， 周国林， 聂忠扬， 张翼飞，黄 翔， 刘劲松， 林 松， 张晓强

(1.贵州省烟草公司 贵阳市公司， 贵州 贵阳 550002； 2.中国烟草总公司 贵州省公司， 贵州 贵阳 550001)

0 引言

【研究意义】烟草(NicotianatabacumL.)是茄科烟草属植物，全球约有120个国家和地区种植烟草，在我国烟草是重要的经济作物之一[1]。近年来，气候环境的变化导致在烟草上出现的病害越发严重，严重威胁烟草种植业的健康持续发展。因此，研究防治烟草靶斑病的有效方法对促进烟草种植业稳产增收意义重大。【前人研究进展】烟草靶斑病(Tobacco target spot)的病原为无性世代立枯丝核菌(Rhizoctoniasolan)，该病害 于2006 年在国内首次发现并被报道，从烟草苗期至大田成熟期均可发生，侵染叶片的同时亦危害茎部。叶片受侵染后出现圆形水渍状斑点，如遇温度适宜、湿度大的环境，病斑则迅速扩展形成直径2 ～ 20 cm有同心轮纹的不规则斑，病斑周围有褪绿晕圈，病斑坏死部分易碎，形成穿孔，类似枪弹射击在标靶上形成的空洞，故称为靶斑病[2]。该病是我国近年来发生范围较广的烟草病害，在云南、湖南、吉林、黑龙江、广西、辽宁等地均有发生，且来势猛、流行快，连片发生、病情重，极大地影响烤烟产质量，同时具有一定的传染性，是应重点关注的烟草大田期病害之一[3]。为降低烟草行业由于该病害造成的损失，广大科研人员对相关防治药物进行了大量研究，但化学药剂的大量使用会造成环境污染，以及产品农残的超标等问题。因此，在烟草病虫害防控上，亟需探索一些安全、有效的绿色防控技术。近年来，作为现代植物病害防治的重要途径之一，植物诱导抗病得到国内外学者的广泛关注[4-7]。植物诱抗剂通过调节植物的新陈代谢并激活其免疫系统提高植物的抗逆能力和抗病性，具有多抗、高抗和卫生安全等优点[8]。植物免疫诱抗剂是一类能够诱导植物系统获得抗性的化合物，一般分为有机酸类、无机化合物类、寡糖类和蛋白多肽类[9-10]，这些物质能够激活植物的免疫系统、调节植物的新陈代谢过程，进而增强植物的抗病抗逆能力[5-11]。【研究切入点】化学杀菌剂在作物病害防控方面应用广泛，但杀菌剂的长期使用难免产生抗药性、农药残留和环境污染等问题，不利于农业可持续发展。植物诱抗剂在诱导作物生长、提高抗病能力方面效果显著，其使用量相对较低，对环境污染小，是减少化学农药使用量，促进作物提质增效的重要手段。目前，有关诱抗剂对烟草靶斑病诱抗性的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】以贵阳市冯三镇烟草种植基地分离获得的靶斑病致病菌(Rhizoctoniasolani，WT)为试验材料，研究黄腐酸、S-诱抗素、水杨酸、0.01%芸苔素内脂可湿性粉剂4种诱抗剂诱导烟草的抗病效果，为生产上防控该病提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试品种 云烟87，烟草幼苗由开阳县冯三镇烟草育苗基地提供。

1.1.2 供试菌种 立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani，WT)，由贵州大学农安实验室提供。

1.1.3 供试药剂 黄腐酸(有效成分≥95%)，购自德国阿格福莱农林环境生物技术股份有限公司；S-诱抗素(天然脱落酸)，购自山东圣鹏科技股份有限公司；水杨酸(有效成分≥99.5%)，购自天津市光复精细化工研究所；0.01%芸苔素内脂可湿性粉剂，购自江苏克胜集团股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 育苗 于2021年4月21日将烟株幼苗移栽至高18 cm、直径20 cm的花盆中，浇足定根水，定期观察烟株生长情况，待烟株长至50 cm时开始试验处理。

1.2.2 诱抗剂处理 试验共设黄腐酸2 000倍液、S-诱抗素30 000倍液、1 mmol/L水杨酸溶液、芸苔素内酯2 000倍液4个处理，并设置清水对照(CK)，每个处理10盆烟株。分别于6月15日、6月20日、6月25日将4种诱抗剂各均匀喷雾至烟叶表面，间隔5 d喷施1次，共喷施3次。

1.2.3 孢子悬浮液制备及接种 将烟草靶斑病致病菌WT接种至PDA平板培养基上，置于28℃黑暗条件下培养。待培养皿中央长出孢子后，用无菌水将孢子洗脱，8层无菌纱布过滤，并将孢子悬浮液浓度调整为105个/mL，备用。于诱抗剂最后1次(6月25日)诱导2 d后，喷雾接种浓度为105个/mL的烟草靶斑病菌孢子悬浮液，为保证接种成功率，共接种2次致病菌孢子液，间隔1 d接种1次，接种后烟株保湿培养。

1.3 测定项目及方法

1.3.1 发病情况 待对照组出现明显靶斑病症状时(7月15日)开始调查烟株发病情况，共调查2次，间隔15 d调查1次，记录病情指数，烟草靶斑病病情分级标准及计算方法如下。

0级：无病斑；

1级：病斑面积占叶片面积的1%以下；

3级：病斑面积占叶片面积的1%～10%；

5级：病斑面积占叶片面积的11%～30%；

7级：病斑面积占叶片面积的31%～50%；

9级：病斑面积占叶片面积的51%。

病情指数=[∑(各级病叶数×该级代表值)]×100/(调查总叶数×最高级代表值)

诱抗效果= [(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数]×100%

1.3.2 烟株农艺性状 按照标准《烟草农艺性状调查方法》(YC/T 142—1998)，于烟株打顶前调查统计株高、叶数、最大叶长和最大叶宽，打顶后测量茎围和节间距。

1.3.3 生理生化指标 当对照组出现明显靶斑病症状时开始检测各处理烟株生理生化指标，取样时随机采摘各处理中部叶片3～5片烟叶，置于冰盒中并带回实验室立即检测烟叶苯丙氨酸解氨酶(PAL)、丙二醛(MDA)、过氧化物酶(POD)、超氧化物气化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和可溶性蛋白质含量，MDA、POD、SOD、CAT及蛋白质含量检测试剂盒均购自北京索莱宝科技有限公司。相对电导率检测方法[12]：先用自来水洗净烟叶表面灰尘，再用蒸馏水冲洗3次，滤纸吸干水分后，用小刀将烟叶切成适宜长度的长条。快速称取鲜样3份，每份0.1 g，分别置于装有10 mL去离子水的刻度试管中，盖上玻璃塞于室温下浸泡12 h，用电导仪测定浸提取液电导率(R1)，然后沸水浴加热30 min，冷确至室温后摇匀，再次测定电导率(R2)。

相对电导率=R1/R2×100%

1.4 数据分析

利用Excel 2010和DPS 7.05进行数据统计，采用DPS 7.05单因素试验统计分析-Duncan新复极差法进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 不同诱抗剂对烟草靶斑病的诱抗性

从表1看出，诱抗剂处理后，烟株病情指数均低于对照处理，表明诱抗剂诱导增强烟草对靶斑病菌的抗性。发病早期(7月15日)S-诱抗素的诱抗效果最佳，病情指数为2.08，诱抗效果为61.62%；水杨酸处理次之，病情指数为2.25，诱抗效果为58.49%；黄腐酸处理最差，诱抗效果仅44.46%。发病后期(8月30日)各诱抗剂的诱抗效果均呈下降趋势，但仍以S-诱抗素的诱抗效果最好，为56.61%；水杨酸处理次之，为53.40%。综上，4种诱抗剂均能诱导增强烟株对靶斑病菌的抗性，其中，S-诱抗素对烟草诱导抗病效果最佳。

表1 不同诱抗剂处理烟草靶斑病的诱抗效果

2.2 不同诱抗剂处理烟株的农艺性状

从表 2 看出，4种诱抗剂对烟草株高、茎围、最大叶长和最大叶宽等农艺性状均有不同程度影响。其中，S-诱抗素处理烟株的农艺性状整体较好，S-诱抗素可明显增加烟株的株高、叶数及节间距，分别较对照增加19.6%、24.3%和11.4%；水杨酸处理次之，对烟株株高影响较为明显；黄腐酸和芸苔素内酯处理的效果较差。各诱抗剂处理后烟株的茎围、最大叶长、最大叶宽与对照间差异均不显著。

表2 不同诱抗剂处理烟株的农艺性状

2.3 不同诱抗剂处理烟株的生理生化指标

由表3可见，4种诱抗剂诱导后烟叶MDA含量均有所下降且均低于对照，其中S-诱抗素处理后烟叶MDA含量最低，仅5.71 nmol/g；水杨酸处理其次，为7.56 nmol/g，但二者间差异不显著；与相对电导率变化趋势一致，S-诱抗素及水杨酸处理后烟叶电导率均低于其他处理，表明诱抗剂处理后烟叶受病原菌侵染程度降低，烟叶细胞膜损伤程度较小。另外，诱抗剂处理后烟株防御酶活性均较对照处理明显提高，其中S-诱抗素诱导后烟叶PAL、CAT和SOD防御酶活性显著高于其他处理，分别较对照增加85.86%、42.77%和61.18%；水杨酸处理次之，PAL、CAT和SOD分别较对照增加63.34%、39.83%和44.43%；4种诱抗剂处理后烟叶可溶性蛋白含量均上升，其中S-诱抗素增加量最大，较对照增加55.24%；与其他诱抗剂处理相比，水杨酸对烟叶可溶性蛋白含量影响较小。综合看，S-诱抗素对烟草防御酶活性影响最大，能显著提高烟草对靶斑病的抗性，水杨酸处理次之。

表3 不同诱抗剂处理烟株的防御酶活性及生理指标

3 讨论

植物免疫诱抗剂能诱导植物系统获得抗病性，其本身不具有杀菌活性且用量少，可有效减少化学农药用量、降低环境压力和缓解农药3R问题[13]。该试验选用的4种诱抗剂均可有效降低烟草靶斑病的病情指数，增强烟草对靶斑病的抗性，其中S-诱抗素的诱抗效果最佳，为61.62%；水杨酸次之，为58.49%；芸苔素内酯和黄腐酸相对较差。

S-诱抗素存在于衰老的叶片组织、成熟的果实、种子及植物的茎、根等部位，是植物生长发育、成熟各阶段的重要调控因子。S-诱抗素具有促进植物叶片脱落、芽和种子休眠、抑制植物细胞的分裂和延长、引起气孔关闭、影响种子胚的发育、增加植物在生物和非生物胁迫下的抗逆性、影响性的分化等多方面的作用[14]。S-诱抗素在实际生产中主要用于提高作物在高温、低温、干旱和水涝等逆境下的生存能力[15-17]；提高作物对病原菌和害虫的抗性，从而提高防治药剂的药效[18-20]；可延长鲜切花的花期[21]，促进氮磷钾的吸收，提高作物产量。该研究发现，S-诱抗素通过提高烟叶防御酶活性，改善烟株农艺性状，显著增强烟株对靶斑病菌的抗性。

水杨酸(Salicylic acid，SA)即邻羟基苯甲酸，广泛存在于植物体内，目前已被证明能够调节植物许多抗逆生理过程，如抗寒性、抗盐性、抗病性、抗旱性以及抗热性[22-23]，SA作为一种植物激素，在未来有可能成为植物抵御各种逆境胁迫，提高作物增收潜力的管理方式，具有广阔的应用前景[24]；刘太国等[25]研究发现，应用外源SA可以比较有效地诱导烟草抗病品种对病毒病产生抗病性。赵明敏[26]研究表明，外源施加SA能有效增强烟草对普通花叶病的抗性。试验结果表明，经水杨酸诱导后烟叶防御酶活性显著增加、MDA含量及相对电导率明显降低，因此该处理烟株对致病菌的抵抗能力显著增加。

芸苔素内酯是一种天然的植物甾醇类生长激素，广泛存在于植物界，被国际上誉为第六大植物激素[27]。芸苔素内酯促进细胞伸长和分裂为基础，调节植物的形态建成、维管束分化、生殖发育、开花和衰老及响应环境信号[28]，并且可以改善逆境下植物体内的渗透调节，提高植物抗氧化酶活性[29]。外施芸苔素内酯能解除植物的光抑制现象，提高作物的净光合速率，促进作物的生长和有机物的积累。研究发现，芸苔素内酯对烟草靶斑病的诱导抗病效果仅次于S-诱抗素和水杨酸处理，对烟株促生作用较好。

黄腐酸中的羟基、羰基、醇羟基、酚羟基等官能团，有较强离子交换和吸附能力，可以提高肥料利用率[30]。腐殖酸通过与铵结合形成腐植酸铵，能减少氨挥发，进而增加氮素有效性[31]。同时，腐殖酸与Al3+、Fe3+、Ca2+、Mg2+等高价阳离子结合，减少其与磷肥中 HPO42-、H2PO4-结合而造成沉淀机会，提高磷肥利用率[32]。研究发现，黄腐酸能提高马铃薯幼苗的生物酶活性，促进其光合作用，提高作物的抗病能力[33]。赵世元[34]研究发现，叶面喷施黄腐酸可提高烟草体内POD、SOD、PAL和PPO活性，喷施10 mmol/L黄腐酸可提高烟草对青枯病抗病效果，改善烟株的农艺性状。黄腐酸可促进植物的生长、养分吸收及细胞伸长[35]，有效刺激烤烟根系生理活性，增强根系活力，促进烤烟根系生长[36]。研究发现，黄腐酸能在一定程度上诱导增强烟草对靶斑病的抗病性，但效果相对较差。为提高诱抗剂对植物的诱导抗病作用，还需进一步研究不同诱抗剂组合的施用效果，深入研究其诱抗机理，并开展大田试验，为促进优质烟叶生产提供切实可行的植保技术。

4 结论

不同诱抗剂对烟草靶斑病的诱抗效果差异明显，S-诱抗素和水杨酸诱导抗病效果较佳，分别为61.62%和56.61%。S-诱抗素可有效提高烟草对靶斑病的抗性，在降低烟叶病情指数的同时还能改善烟株农艺性状，进而提高烟叶产量。