SFRP基因家族在泛癌中的预后评估作用

齐云峰，李铭新，董成成，王雨琦，黄 乐

(吉林师范大学 生命科学学院，吉林 四平 136000)

0 引言

癌症目前是全球人类面临的最大公共卫生挑战之一，根据世界卫生组织国际癌症研究机构数据显示，2020年新发癌症病例已达到了1929万例，死亡病例达到了996万例[1].目前癌症已成为全球十大重大疾病之一，且罹患癌症病人通常预后不良，生存率低.癌症的诱因通常十分的复杂，一方面癌症的高发体现了经济的快速发展，人们普遍生活压力较大，饮食习惯不健康，另一方面也体现了全球人口的老龄化[2-3].所以癌症的诊断与预防已经成为科研工作者亟待解决的问题.已发现信号通路表达失调是最常见的癌症驱动因素.Wnt信号通路是一种进化程度十分保守的信号分子，广泛的参与胚胎发育、细胞增值、细胞分化、细胞凋亡，是一种重要的细胞内信号转导途径[4-7].已有研究表明，Wnt信号通路其途径成分突变与表达失调可诱发疾病，尤其是癌症[8-10].分泌型卷曲相关蛋白(Secreted Frizzled-related Proteins，SFRPs)是Wnt信号通路中最大的基因家族[11-14].作为Wnt信号拮抗因子，SFRPs可通过与Wnt配体结合形成无功能复合物，从而阻断Wnt信号通路表达.已有学者通过实验表明，SFRP基因家族发生DNA甲基化，表达下调导致Wnt信号通路表达异常从而导致肿瘤的发生.已有研究表明，SFRP基因家族中的基因在许多癌症类型中都存在着异常表达的情况[15-18].例如，F.Atschekzei等[19]使用亚硫酸氢盐处理过的DNA的焦磷酸测序用于病例对照研究，研究包括120例正常肾组织和从肿瘤邻近区域获得的72例癌旁组织，发现SFRP1的甲基化会导致肾细胞癌的风险增加.X.Y.Liu等[20]研究发现大肠癌患者SFRP2基因甲基化水平明显高于相邻的非肿瘤组织(P<0.001)，表明SFRP2基因可作为大肠癌独立生物标识物.C.Kirana等[21]通过评估大肠癌患者与非大肠癌患者SFRP5基因表达得出结论，SFRP5可以作为生理性肿瘤抑制基因，并且证明其在预后中可作为生物标识物.

基于以上研究，本文使用TCGA数据库中该基因家族在18种癌症中的表达数据，研究了SFRP基因家族与癌症患者生存率的关联.并且研究了该基因家族与肿瘤微环境、药理活性的相关性.研究结果显示，SFRP2普遍在肿瘤细胞中表达上调，SFRP1、SFRP4、SFRP5则主要下调.基因表达量与患者生存率的关联方向则取决于所测试的癌症类型.SFRP基因家族与免疫亚型、肿瘤微环境显著相关，但关联的程度却因不同的基因与不同的癌症而异.综上所述，本研究区分了SFRP基因家族中的成员在每种肿瘤类型中作用的不同，研究结果表明需要将SFRP基因家族中的每个成员当作单独实体进行研究.

1 材料与方法

1.1 数据来源

RNA-Seq，临床数据，基于mRNA的干性打分(RNAss)和DNA甲基化(DNAss)数据以及免疫亚型数据均来自于Xena(https：//xenabrowser.net/datapages/).肿瘤数据来源于癌症基因组谱图数据库(The cancer Genome Atlas，TCGA).涉及的肿瘤共31种类型，分别是肾上腺皮质癌(ACC)、膀胱尿路上皮癌(BLCA)、乳腺浸润癌(BRCA)、宫颈鳞状细胞癌和宫颈内腺癌(CESC)、胆管癌(CHOL)、结肠腺癌(COAD)、淋巴样肿瘤弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBC)、食道癌(ESCA)、胶质母细胞瘤(GBM)、头颈部鳞状细胞癌(HNSC)、嫌色性肾细胞癌(KICH)、肾透明细胞癌(KIRC)、肾乳头状细胞癌(KIRP)、急性骨髓性白血病(LAML)、脑低级别胶质瘤(LGG)、肝细胞肝癌(LIHC)、肺腺癌(LUAD)、肺鳞癌(LUSC)、间皮瘤(MESO)、卵巢浆液性囊腺癌(OV)、胰腺癌(PAAD)、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤(PCPG)、前列腺癌(PRAD)、直肠腺癌(READ)、肉瘤(SARC)、皮肤黑色素瘤(SKCM)、胃癌(STAD)、睾丸癌(TGCT)、甲状腺癌(THCA)、胸腺癌(THYM)、子宫内膜癌(UCEC)、子宫肉瘤(UCS)、葡萄膜黑色素瘤(UVM).共从TCGA数据库下载11057个样品，样品预处理均使用R语言(4.0.0版本)，并剔除临床信息不全样品.

1.2 肿瘤微环境分析

使用ESTIMATE程序分析不同肿瘤中免疫细胞与基质细胞浸润水平，分析数据来源于TCGA数据库.SFRP基因家族表达与免疫细胞与基质细胞相关性使用斯皮尔曼(Spearman)相关性分析，并测试了六种免疫亚型与SFRPs表达之间的相关性.

1.3 药物敏感性分析

使用CellMiner网站(https：//discover.nci.nih.gov/cellminer/)进行药物敏感性分析，该网站可访问NCI-60数据库.将SFRP基因家族mRNA表达水平与细胞敏感性数据相关联，使用斯皮尔曼相关性分析进行相关性打分，涉及262种FDA批准的药物或处于临床实验中的药物.

1.4 统计学处理

使用线性回归模型(GLMM)比较正常样品与肿瘤样品之间基因表达差异，箱线图用来展示SFRP基因家族不同基因在不同癌症之间表达差异情况.基因表达与患者生存率之间的关系使用单因素Cox分析、多因素Cox分析与Log-rank检验方法.肿瘤微环境相关性、肿瘤干细胞相关性分析、药物敏感性使用Spearman或Pearson相关性分析.本文所有的分析使用R语言(4.0.0版本)完成，并且使用ggplot2、ggpubr、survminer、pheatmap、corrplot、survival包绘制文章图片.

2 结果分析

2.1 SFRP基因家族在泛癌中的表达

图1(A)展示了SFRP基因家族在不同癌症中的平均表达量情况，可以得出结论，在SFRP基因家族中，SFRP2基因在不同癌症中平均表达量最高，SFRP5则最低.数据结果表示SFRP基因家族的表达存在内部差异.将SFRP基因家族中的不同基因当作独立的实体研究是具有研究价值与意义的.在肿瘤发生过程中起作用的一个基因的定义特征是它们在癌症肿瘤中的表达失调.并且越来越多的证据表明，SFRP基因家族在多种癌症类型中发生了改变.在接下来的研究中，我们调查了18种癌症类型的原发性癌症患者所有4个基因的表达水平.根据图1(B)所示，所有SFRP基因在不同的癌症中均表现出显著的差异，但是每种基因和每种癌症类型的表达改变方向都不同.在被研究的肿瘤类型中，SFRP1基因主要下调，SFRP2、SFRP4、SFRP5基因则主要上调，但也有一些例外的情况.另外，我们进行了Spearman相关性测试，各种癌症类型中各个SFRP基因家族成员的表达水平呈现正相关，但从图1(C)中可以明显观察到SFRP2和SFRP4呈现较高的相关性(r=0.26).这可能是由于它们具有某些共同的功能或特征.

图2展示了SFRP1、SFRP2、SFRP4、SFRP5基因在癌症与相邻癌旁组织中表达差异情况.结果表明，这四种基因在不同癌症类型中表达的方向存在差异.例如，SFRP1在BLCA肿瘤组织中低表达，而在CHDL、LUSC、ESCA这三种癌症中正常组织与癌症组织的表达没有显著差异.SFRP2在COAD、THCA、READ中低表达，在CHOL、LUAD中呈现高表达.这些差异说明SFRP基因家族在肿瘤组织中的表达会发生失调.

图2 SFRP1(A)、SFRP2(B)、SFRP4(C)、SFRP5(D)在癌症与相邻癌旁组织基因表达差异

从图3中能够确定SFRP基因家族的表达与肿瘤患者生存率存在着关联.且SFRP基因家族的成员在31种肿瘤中所起到的作用方向各不相同，并且SFRP1基因的表达通常导致ACC、BLCA、KIRP、OV患者预后较差.

图3 SFRP基因表达与不同癌症类型患者总体生存率关系

众所周知，在人类肿瘤中已经鉴定出六种免疫亚型，分别为C1(组织愈合型)、C2(IFN-γ主导型)、C3(炎症性)、C4(淋巴细胞耗竭型)、C5(免疫静默型)、C6(TGF-β主导型).我们将SFRP基因家族的基因表达水平与TCGA数据库中的免疫浸润情况相关联，结果呈现在图4(A)中.由图可知该基因家族的四种基因在六种免疫亚型中的表达有显著差别(P<0.001).并且SFRP2基因的高表达与C1，C2，C6相关，并且通常与C1，C2，C6免疫亚型相关的患者生存率较低，由此可推断出SFRP2基因可能充当着肿瘤启动子的角色.由于癌症在发生发展与转移的过程中，肿瘤细胞与其所处的内外环境有着密切的关系.肿瘤细胞还可以通过调节自分泌与旁分泌，改善自身的生存与发展条件，促进自身的生长与发展.所以我们研究了SFRP基因家族表达水平与基质细胞之间的相关性，从结果可以看出SFRP基因家族与基质细胞相关性非常强.更具体来说，SFRP2与BLCA、BRCA、CESC、PAAD、PRAD之前存在着显著的正相关关系(p<0.001)以及SFRP4与BLCA、BRCA、LGG、PAAD之间存在正相关关系.但也存在一些负相关的关系，例如SFRP1与ACC、LGG、UVM，SFRP2与LGG.为了验证结果的准确性，我们同时测试了SFRPS与免疫的相关性，并且评估了SFRPS免疫细胞浸润水平与肿瘤细胞干性的分数，其结果与基质测试结果相似.

图4 SFRP基因表达与免疫浸润亚型关联(A)和基于ESTIMATE算法的SFRP基因表达与16种不同癌症类型的基质评分之间的相关性(B)

据报道，细胞分化能力的逐渐丧失和干细胞样特征的获得是驱动肿瘤进展的主要原因.SFRP基因与肿瘤干细胞相关性可通过基于mRNA表达(RNAss)与DNA甲基化模式(DNAss)来评估.图5(A)和(B)展示了SFRP基因在33种癌症中与DNAss和RNAss相关性.从结果发现，SFRP1、SFRP2、SFRP4、SFRP5与DNAss和RNAss多呈现负相关性.但SFRP基因在部分肿瘤中也与DNAss呈现正相关性.

图5 SFRP基因表达与肿瘤干细胞相关性(DNAss、RNSss)

为了研究SFRP基因表达水平与药物敏感性的关系，本文研究了SFRP基因家族在60种人类癌症细胞系中的表达与药物敏感性相关性.药物敏感性得分越高，表明细胞对该药物治疗越敏感.可以从结果发现，SFRP对许多化疗药物的耐药性显著相关(见图6).

图6 使用NCI-60细胞系数据分析SFRP基因与药物敏感性相关性

例如，SFRP5与Denileukin Diftitox Ontak的细胞耐药性相关(Cor=0.577，P<0.001)，该药物可参与治疗T细胞淋巴瘤.SFRP2与Idelalisib细胞耐药性相关(Cor=0.447，P<0.001)，该药物可有效治疗复发/难治性慢性淋巴白细胞白血病、小淋巴细胞淋巴瘤、滤泡性B细胞非霍奇金淋巴瘤.SFRP4与Ibrutinib细胞耐药性相关(Cor=0.447，P=0.001)，该药可用于套细胞淋巴瘤治疗.同时，在结果中也可以观察到SERP2和SFRP1均与Belinostat细胞耐药性相关.

3 结论

本文对SFRP基因家族的基本情况进行了系统的表征.并对SFRP基因家族在不同类型的癌症与免疫亚型中起到的作用进行了研究.研究发现，SFRP2基因可能在肿瘤中充当着启动子角色，并且与肿瘤的不良预后相关.SFRP1、SFRP4、SFRP5基因则可能更多的发挥着抑癌基因的作用.但是对于特定的肿瘤类型而言，SFRP基因家族的基因所表现出的行为也不相同.综上所述，SFRP基因家族对不同肿瘤的预后具有异质性，由此可推断该基因家族基因之间的差异性可导致生物功能异质性.此项工作对SFRP基因家族在肿瘤微环境、药物敏感性方面以及在肿瘤中的作用进行了阐释，为后续开发个性化的癌症药物提供了工作基础.