sRNA rli106 在单核细胞增生李斯特菌环境应激及生物被膜形成中的调控作用研究

郭 蕴，季春辉，王立霞，宁程程，李 娜，孟庆玲，乔 军*，才学鹏

（1.石河子大学动物科技学院，新疆 石河子 832003；2.中国兽医药品监察所，北京 100081）

单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）属于李斯特菌属，是一种重要的革兰阳性食源性人兽共患病原菌[1-2]，在自然界中广泛分布，可通过多种途径传播。人和动物感染后，在临床上主要表现为胃肠炎、脑膜炎、流产和败血症等症状，尤其对新生儿、妊娠母畜和免疫功能低下者易感，致死率可达20%～30%[3-5]。同时，作为一种兼性厌氧胞内寄生菌，该菌可在高盐、低温、高渗、酸性等多种应激环境下增殖，环境适应性很强[6]。在动物性食品生产加工过程中，LM 可污染肉类、蛋类、奶制品等，引起严重的公共卫生安全问题[7]。

有研究发现，LM 非编码小RNA（sRNA）与Pr⁃fA、VirR 和SigmaB、MogR 等多种调控因子组成了复杂的调控网络，对该菌基因的表达进行调控，在LM应对环境变化和毒力调节中发挥重要作用[8-10]。目前，利用生物信息学及分子生物学技术在LM 中已经鉴定出150 多种sRNA，然而大部分sRNA的生物学功能尚不清楚[11-12]。rli106是近年来在LM 基因组中新发现的sRNA，在LM侵染宿主细胞后胞内外表达差异显著[13]，为了探究rli106基因的生物学功能，本研究利用重叠延伸PCR 及同源重组技术构建rli106基因缺失和回补菌株，通过分析rli106基因缺失株、回补株和亲本株在不同应激环境中的适应能力、运动性、生物被膜（BF）形成能力以及BF形成相关基因的转录水平，揭示rli106对LM 生物学特性的影响，为探究rli106基因在LM环境适应中的分子调控机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌株及主要试剂 LM EGD-e 菌株由德国伍兹堡大学Goebel 惠赠；大肠埃希菌DH5α、pKSV7 由本实验室保存；pMD19-T载体、T4连接酶、限制性核酸内切酶KpnI、PstI、BamH I、Hind III 均购自TaKaRa公司；DNA、质粒提取和胶回收试剂盒均购自TIAN⁃GEN 生物有限公司；氯霉素、红霉素购自索莱宝科技有限公司；脑心浸液肉汤BHI 购自青岛海博生物科技有限公司。

1.2 引物设计与合成 根据GenBank 登录的LM EGD-e 基因组序列（AL591824.1），利用Primer 5.0 软件设计构建缺失株、回补株的特异性引物以及BF 形成相关基因gltB和gltC的qRT-PCR 引物；在P1/P4 引物的5'端分别添加酶切位点KpnI、PstI（下划线部分）；在CF/CR 引物的5'端分别添加酶切位点BamH I、Hind III（下划线部分），引物均由北京华大基因公司合成（表1）。

表1 本研究中所用引物Table 1 List of primers used in this study

1.3 LM sRNArli106基因的克隆与分子特征分析用BHI 培养LM EGD-e 菌株，按照细菌基因组DNA提取试剂盒步骤提取LM 基因组DNA，用rli106F/rli106R 引物扩增rli106基因，将其与pMD19-T（sim⁃ple）载体连接，测序挑选阳性克隆。利用在线网站http://www.softberry.com/对测序结果进行LM 启动子和转录因子预测分析。

1.4 LM-Δrli106缺失株与CLM-Δrli106回补株的构建 利用P1/P2 和P3/P4 两对引物分别扩增LM EGD-e 菌株rli106基因的上、下游同源臂，利用重叠延伸PCR（SOE-PCR）技术获得rli106基因缺失的融合片段，将其与pMD19-T（simple）载体连接，经测序和双酶切鉴定获得pMD19-T-Δrli106质粒。将pMD19-T-Δrli106与pKSV7 质粒分别用KpnI、PstI 双酶切，回收目的片段，克隆于经同样双酶切处理的pKSV7中，构建重组穿梭质粒pKSV7-Δrli106。制备LM EGD-e 感受态细胞后，将pKSV7-Δrli106电转化该感受态细胞中，然后涂布于含氯霉素抗性的BHI 平板上，30 ℃培养48 h，挑取单菌落于含氯霉素抗性的BHI 液体培养基中培养8 h，利用P5/P6 引物经菌液PCR 鉴定是否为阳性克隆。并将阳性菌在含氯霉素抗性（10 μg/mL）的BHI 培养基中和42 ℃双重抗性下连续传代进行同源重组，期间每一代均要用旁外侧引物P7/P8 进行菌液PCR 鉴定，待检测出短条带并经测序正确后确定获得含有氯霉素抗性的单交换重组株。然后在无氯霉素BHI 液体培养基中42 ℃传20代，使pKSV7 温度敏感型穿梭载体丢失，经菌液PCR 和测序鉴定正确的缺失株命名为LM-Δrli106。同时将LM-Δrli106缺失株在无氯霉素抗性、37 ℃继续培养20 代，通过旁外侧引物P7/P8 进行菌液PCR鉴定其遗传稳定性。

为了构建rli106基因回补株，将rli106克隆入pHT304载体中，经双酶切鉴定获得穿梭质粒pHT304-rli106。将PHT304-rli106电转化LM-Δrli106感受态细胞中，37 ℃恒温培养18 h～24 h，挑取单个菌落在含有红霉素抗性的BHI（终浓度50 μg/mL）液体培养基中培养[14]，利用CF/CR 引物进行菌液PCR 鉴定[14]，将PCR 和测序鉴定正确的回补株命名为CLM-Δrli106。

1.5 sRNArli106基因缺失对LM 在不同应激环境中适应能力影响的检测 将LM EGD-e、LM-Δrli106和CLM-Δrli106分别接种于5 mL BHI 液体培养基中，分别于不同温度（30 ℃、37 ℃、42 ℃）、不同渗透压（5% NaCl、8% NaCl）、5 mmol/L H2O2的BHI 液体培养基中培养，在不同的时间测定各菌株的OD600nm值并绘制生长曲线，以检测rli106基因缺失对LM 在不同环境条件下应激能力的影响。

1.6 sRNArli106基因缺失对LM 运动能力影响的检测 将LM EGD-e、LM-Δrli106和CLM-Δrli106分别接种于5 mL BHI 液体培养基中，37 ℃过夜培养活化，将OD600nm调至同一水平后，将接种针蘸取少量菌液穿刺接种于0.3%的半固体BHI 试管中，置于28 ℃培养36 h，观察其生长情况并拍照记录；另外吸取1 μL 菌液点样于0.3%的半固体BHI 平板上，置于28 ℃培养36 h，通过测量细菌在平板中迁移所形成圆圈的直径评估其运动能力，并拍照记录。

1.7 sRNArli106基因缺失对LM 不同时期BF 形成能力影响的检测 将LM EGD-e、LM-Δrli106和CLMΔrli106菌液培养至OD600nm≈0.2，吸取菌液200 μL 加入到96 孔微孔板中，于37 ℃条件下分别培养12 h 和24 h。按照参考文献方法用1%的结晶紫溶液染色，然后加入95%的乙醇脱色，用酶联检测仪测定其OD570nm，将脱色前的微孔板置于倒置显微镜下观察，拍照记录[15]。

1.8 sRNArli106基因缺失对LM BF 形成相关基因转录水平影响的检测 将LM EGD-e、LM-Δrli106和CLM-Δrli106于BHI 液体培养基中培养至OD600nm≈0.2，吸取菌液2 mL 加入到6 孔板中培养24 h 后，提取总RNA，反转录成cDNA，以16S rRNA 基因作为内参对照，通过qRT-PCR 检测gltB、gltC基因的转录水平，每个样品设置3 个重复，采用2-ΔΔCT法计算基因的相对转录水平。

1.9 数据分析 所有试验均重复3 次，采用Graph⁃Pad Prism 5.0 进行组间差异显著性分析，数据采用平均值±标准差。P＜0.05 为差异显著，P＜0.01 为差异极显著。

2 结 果

2.1 LM sRNArli106基因的克隆与分子特征分析利用rli106F/rli106R 引物扩增获得了长度约为225 bp的目的片段，与预期结果相符（图1）。结果显示，该基因与GenBank 中登录的LM sRNArli106基因片段大小及序列均一致，在基因组中位于lmo2515和lmo2516基因之间。利用在线网站http://www.softberry.com/预测，发现在sRNArli106基因上游5'-UTR 含有-10 box 和-35 box 启动子区域，有转录调节因子CpxR 结合位点。表明CpxR 可能通过调控rli106的表达来调节LM 的环境适应性。

图1 LM sRNA rli106基因的PCR扩增Fig.1 PCR amplification of LM sRNA rli106 gene

2.2 LM sRNArli106基因缺失株和回补株的构建与鉴定 在无氯霉素抗性、37 ℃继续培养20 代后，通过旁外侧引物P7/P8 对第20 代进行菌液PCR 鉴定，同时进行测序，结果显示可扩增出1 166 bp 单一片段（图2A），测序验证结果正确，表明获得了稳定遗传的缺失株LM-Δrli106。通过CF/CR 引物进行菌液PCR 鉴定出阳性转化子，将阳性转化子进行测序鉴定，结果显示可扩增出239 bp目的片段（图2B），测序验证结果正确，表明正确构建回补株CLM-Δrli106。

图2 LM sRNA rli106缺失株（A）和回补株（B）的鉴定Fig.2 Identification of LM sRNA rli106 deletion strain(A)and complemented strain(B)

2.3 sRNArli106基因缺失对LM 在不同应激环境中适应能力影响的检测结果 在30 ℃、37 ℃培养条件下，LM EGD-e、LM-Δrli106、CLM-Δrli106生长差异不显著（P＞0.05）（图未展示）；在42 ℃条件下培养，与LM EGD-e、CLM-Δrli106相比，在8 h 后LM-Δrli106生长变慢（P＜0.05）（图3A）。表明LM-Δrli106在高温环境中的适应性减弱。在5% NaCl 条件下培养，与LM EGD-e、CLM-Δrli106相比，在6 h～12 h LM-Δrli106生长显著变慢（P＜0.01）（图3B）；在8%NaCl 条件下培养，与LM EGD-e、CLM-Δrli106相比，在8 h 后LMΔrli106生长显著变慢（P＜0.05）（图3C）。表明LMΔrli106在高渗环境中的适应性减弱。在5 mmol/L H2O2条件下，与LM EGD-e、CLM-Δrli106相比，在6 h～8 h LM-Δrli106的生长变慢（P＜0.05）（图3D）。表明LM-Δrli106在氧化环境中的适应性减弱。

图3 LM EGD-e、LM-Δrli106与CLM-Δrli106在不同应激环境下的生长曲线Fig.3 Growth curves of LM EGD-e,LM-Δrli106 and CLM-Δrli106 under different environmental stresses

2.4 sRNArli106基因缺失对LM 运动能力影响的检测结果 通过在0.3%的半固体BHI 试管中培养36 h后发现，与LM EGD-e、CLM-Δrli106相比，LMΔrli106在试管中的运动能力无明显差异（P＞0.05）（图4A）；通过在0.3%的半固体BHI 平板中培养36 h后发现，与LM EGD-e、CLM-Δrli106相比，LMΔrli106在平板上运动所形成的菌落直径大小无明显差异（P＞0.05）（图4B、图4C）。表明rli106基因缺失不影响LM 的运动能力。

图4 LM EGD-e、LM-Δrli106与CLM-Δrli106运动能力的测定和比较Fig.4 Determination and comparison of the motility of LM EGD-e,LM-Δrli106 and CLM-Δrli106

2.5rli106基因缺失对LM BF 形成及BF 形成相关基因转录水平影响的检测结果 通过在37 ℃条件下分别培养12 h 和24 h 后，分别采用结晶紫染色法测定各菌株的BF 形成能力，结果显示，LM EGD-e、LMΔrli106、CLM-Δrli106均能形成BF，但LM-Δrli106BF形成能力极显著弱于LM EGD-e、CLM-Δrli106（P＜0.01）（图5A）。通过用酶联检测仪测定其OD570nm值，并经数据统计结果显示，在12 h 和24 h 时，与LM EGD-e、CLM-Δrli106相比，LM-Δrli106BF形成能力差异均极显著（P＜0.01）（图5B）。表明rli106基因缺失影响LM形成BF 的能力。qRT-PCR 结果显示，与LM EGD-e、CLM-Δrli106相比，LM-Δrli106在静置培养时，基因gltB、gltC的转录水平显著下调（P＜0.01）（图5C）。表明rli106基因缺失影响LM BF 形成相关基因（gltB、gltC）的转录水平。

图5 rli106基因缺失对LM BF形成的影响Fig.5 Effects of rli106 gene deletion on biofilm formation by LM

3 讨 论

LM 作为一种重要的革兰阳性食源性人兽共患病原菌，广泛分布于自然界，能在外界环境中长期存活。研究表明，sRNA 可与靶标mRNA 结合，在转录后水平调控基因的表达，被认为是基因表达的关键调节因子[16-18]。rli106是近年来在LM 基因组中新发现的sRNA，其生物学功能尚不清楚，鉴于此，本研究利用同源重组技术构建了LM-Δrli106基因缺失株和CLM-Δrli106基因回补株，测定了LM EGD-e、LMΔrli106、CLM-Δrli106在不同应激环境中的适应能力、运动性、BF 形成能力。结果显示，LM-Δrli106对高温、高渗、氧化环境的应激能力及BF 形成能力显著降低，但运动性无明显改变。提示rli106基因在环境适应性和BF 形成中发挥重要的调控作用，但不参与细菌运动性。

LM 具有极强的环境适应能力，能够在食品加工、贮藏、运输等应激环境条件下生存。在细菌的温度、营养、氧化应激、pH 等环境变化时，Sigma因子和sRNA 均起到了重要的调节作用。Sigma 因子可通过转录水平对LM 环境应激相关基因进行调控，而sRNA 主要通过转录后水平来调控环境应激相关基因的表达。研究发现，双组分信号转导系统和调节蛋白可通过调控部分sRNA 来发挥传递环境胁迫信号和调节应激响应的作用[19]。有研究发现，Cpx 双组分系统（Two component system，TCS）至少调控了4 个sRNA（cyaR、rprA、omrA和omrB）基因的表达，而CpxR 是细菌中Cpx 双组分系统的反应调控蛋白，通过直接与cyaR和rprA启动子结合的方式调控cyaR和rprA的表达以应对环境变化[20]。本研究通过分析比较LM EGD-e、LM-Δrli106、CLM-Δrli106在不同应激环境中的生长情况，证实了rli106基因缺失可降低LM 在42 ℃、5% NaCl、8% NaCl、5 mmol/L H2O2的应激环境下的适应能力。表明rli106在LM 抵抗环境应激中发挥了重要的调控作用。通过在线网站对测序结果分析，发现在sRNArli106基因上游5'-UTR含有-10 box 和-35 box 启动子区域，有转录调节因子CpxR 结合位点。因此，本研究推测CpxR 通过调控rli106的表达来调节LM 的环境适应性。

细菌的运动性由菌体表面鞭毛提供，鞭毛是致病细菌中的必需结构，被认为是细菌的主要运动器官。然而，除了运动性之外，细菌鞭毛还参与包括粘附、BF形成、毒力因子分泌和真核细胞免疫系统的调节等生命过程。通过试管穿刺和平板运动试验发现，与LM EGD-e、CLM-Δrli106相比，LM-Δrli106运动性无明显改变，提示rli106基因并不参与LM 运动能力的调控。

除了环境调控因子外，LM 可在胁迫条件下形成BF，来抵抗外界应激环境。BF 的形成是一个连续和有序的过程，是细菌在生长过程中为了适应生存环境，其表面分泌粘性胞外聚合物吸附于物质表面，并增殖而形成的具有一定结构的细胞群体。黄艳燕等利用转座子Tn917 成功筛选出一批菌膜形成能力发生变化的突变株，发现gltB、gltC两个基因失活是引起BF 形成能力降低的重要原因[21]。本研究通过结晶紫染色方法检测LM EGD-e、LM-Δrli106、CLMΔrli106菌株的BF 生成能力，结果表明rli106基因缺失可降低LM形成BF的能力。qRT-PCR结果显示，与LM EGD-e、CLM-Δrli106相比，LM-Δrli106中gltB、gltC基因转录水平显著下调，但上述研究中LM EGDe、LM-Δrli106、CLM-Δrli106在运动性方面无显著差异。因此，本研究推测鞭毛蛋白对LM-Δrli106形成BF的能力影响不大，rli106可能通过调控gltB、gltC基因的转录水平而调节BF 的形成。然而，rli106调控上述基因具体的分子机制尚需进一步研究。

总之，本研究通过构建LM-Δrli106基因缺失株和CLM-Δrli106基因回补株，证实LM-Δrli106对高温、高渗、氧化环境的应激能力及BF 形成能力显著降低，提示rli106基因在LM 环境适应性和BF 形成中发挥重要的调控作用，为揭示rli106基因在LM 环境适应性和BF 形成中的分子调控机制奠定基础。